专利名称:优美红景天和四裂红景天愈伤组织的诱导和培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织的培养方法和所用得的培养基，具体地说，本发明涉及一种红景天的组织培养方法和培养基。
背景技术：
红景天属植物因其独特的药效，被誉为“东方神草”、“高原人参”。红景天在我国已有很长的应用历史，《神农本草》和《四部药典》都有记载，列为上品之药(刘志伟，吴谋成，李慧良。菱叶红景天活性成份提取及其保健茶的研制。食品与发酵工业，2002，28(5)47-49)，可用于滋补强壮、消除疲劳、抵御寒冷。康熙皇帝曾用红景天消除军旅疲劳，乾隆时皇室将红景天作为贡品索取。1976年苏联将红景天用为“适应原”样药物，用于宇航员、飞行员、潜水员、运动员等消除疲劳、增加活力。近年国内将其作为强壮药物，开发了多种制剂、保健食品及饮料，用于延缓衰老、老年性心衰、镇静、糖尿病等(中华人民共和国卫生部药政管理局、中国药品生物制品检定所编著，现代实用本草(上册)。北京人民卫生出版社，1997393-397)。
红景天甙(salidroside)被认为是红景天属植物中最重要的具有治疗活性的成分，目前利用红景天甙开发的药物主要是依靠从天然的红景天属植物的根和根茎中提取(平均含量为0.5％)，需要消耗大量天然植物资源(周荣汉，中药资源学。北京中国医药科技出版社，1993278-286)。
近年来有人提出以人工栽培作为补救途径。然而，由于红景天生境狭窄，适宜的地区很少，人工栽培条件下红景天甙产量低(低于0.2％)，因此，人工栽培红景天技术也不是一个理想的解决措施。
通过细胞和组织的培养定向生产红景天甙不受生境影响且可提高红景天甙产量，是一种有效的替代途径。
目前，仅有人对高山红景天(Rhodiola sachalinenisis)(Xu J F，Zhao Y，Han Aiming，et al.Induction and culture of calli from Rhodiola sachalinenisis.A.Bor.Chin.J.Appl.Environ.Biol.1995，1(1)19-25.Xu J F，Xie J，Han A M，et al.Kineticand technical studies on large-scale culture of Rhodiola sachalinenisis compactcallus aggregates with air-lift reactors.Journal of Chemical Technology andBiotechnology，1998，72(3)227-234.植物愈伤组织颗粒悬浮培养生产红景天甙，中国专利，公开号CN1417343A，
公开日2003年5月14日)和玫瑰红景天(Rhodiola rosea)(Miroslawa Furmanowa，Malgorzata Hartwich，August W.Alfermann，Wiktor Kozminski，Marian Olejnik.Rosacin as a product of glycosylation by Rhodiola rosea(roseroot)cell cultures.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1999，56105-110)进行了愈伤组织的诱导和组织培养的初步研究，其他红景天属植物的类似研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供优美红景天(R.coccinea)和四裂红景(R.quadrifida)愈伤组织的诱导和培养方法。为此本发明提供了一种优美红景天和四裂红景天愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤取茎、叶或芽，冲洗、消毒后，将茎剪成0.5～1cm的节段、叶剪出切口、芽直接接种到固体诱导培养基上，23～24℃下暗培养。按照上述方法，诱导出了优美红景天和四裂红景天的愈伤组织，并且愈伤组织在诱导培养基上生长良好。
植物激素是植物细胞、组织、器官离体培养中必不可少的物质，不同种类、不同浓度的植物激素组合对愈伤组织的诱导率的影响非常明显。发明人通过正交实验，确定了优美红景天和四裂红景天愈伤组织诱导方法的优选的方案，特征在于所用的培养基包含以下浓度组合的激素6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～3mg/L和/或激动素(KT) 0.1～1.0mg/L中至少一种，以及萘乙酸(NAA) 0.3～2mg/L和/或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.5～1.0mg/L中至少一种。
将其添加到基础MS培养基(Murashige和Skoog，1962)中，可以诱导优美红景天和四裂红景天愈伤组织，出愈率高，30天的出愈率可达到60％～100％。
本发明还提供了一种优美红景天和四裂红景天愈伤组织的继代培养方法，包括以下步骤优美红景天和四裂红景天愈伤组织在固体诱导培养基上培养25～35天后，挑选生长快、颜色鲜嫩的愈伤组织，接种在固体继代培养基中，24℃培养。传代3～5次后，将固体培养基上的愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基中，震荡培养。按照上述方法，优美红景天和四裂红景天的愈伤组织生长良好。
不同种类、不同浓度的植物激素对愈伤组织的培养也有着非常显著的影响，经过探索，发明人确定了优美红景天和四裂红景天愈伤组织培养方法的优选的方案，其特征是所用的培养基中添加包含以下浓度组合的激素6-苄基氨基嘌呤 3～8mg/L 萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L(6-BA)脱落酸(ABA) 0.01～0.1mg/L 赤霉素(GA3) 0.5～2.0mg/L将其添加到基础MS培养基中，优美红景天和四裂红景天愈伤组织增长较快，20～25天收获时干重可达18～25g/L；并且愈伤组织红景天甙的产量较高，可达到50～60mg/L。
其更优选的方案是所用的培养基包含以下浓度组合的诱导子水杨酸 0.2～2mg/L茉莉酸甲酯 0.5～5mg/L
酵母提取物 0.1～1g/L诱导子起到胁迫植物合成和积累次级代谢产物的作用，该组合可以提高优美红景天和四裂红景天愈伤组织中红景天甙的产量，与不加诱导子的培养基相比，红景天甙含量可以提高3～5倍。
培养基的组成优化是提高次级代谢产物——红景天甙的重要方法之一。本发明还提供了优美红景天和四裂红景天愈伤组织培养方法更优选的方案，其特征是所用的培养基是改良的MS培养基，其组分和浓度如下蔗糖 30000～60000mg/L 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸铵 1650mg/L 氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸钾 1900mg/L 甘氨酸 4～6mg/L磷酸二氢钾 170mg/L 盐酸硫胺素 0.8～2.0mg/L硫酸镁 370mg/L 盐酸吡哆素 1.0～2.0mg/L氯化钙 440mg/L 烟酸 1.0～2.0mg/L硫酸锰 22.3mg/L 肌醇 200～300mg/L硫酸锌 8.6mg/L 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 55～85mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二钠 74.6～111.9mg/L碘化钾 0.83mg/L 琼脂 0～2000mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L溶剂为水。
这种改良的MS培养基与MS基本培养基相比，可以使优美红景天和四裂红景天愈伤组织红景天甙的产量提高3～5倍。
优美红景天和四裂红景天愈伤组织培养方法最优选的方案是所用的改良的MS培养基，组成和含量如下蔗糖 30000mg/L 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸铵 1650mg/L 氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸钾 1900mg/L 甘氨酸 4mg/L磷酸二氢钾 170mg/L 盐酸硫胺素 0.8mg/L硫酸镁 370mg/L 盐酸吡哆素 1.0mg/L氯化钙 440mg/L 烟酸 1.0mg/L硫酸锰 22.3mg/L 肌醇 200mg/L硫酸锌 8.6mg/L 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 55.6mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二钠 74.6mg/L碘化钾 0.83mg/L 琼脂 0～2000mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L其余为水。
以上培养基按普通的培养基配制方法配制。
附图1为优美红景天愈伤组织悬浮培养的生长动力学(鲜重)附图2为优美红景天愈伤组织悬浮培养的生长动力学(干重)具体实施方式
下面用实施例具体说明本发明实施例1优美红景天芽愈伤组织的诱导优美红景天的芽用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+0.6mg/L KT，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导5天后，芽周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为32/50。
实施例2优美红景天芽愈伤组织的诱导优美红景天的芽用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+0.2mg/L KT，2.0mg/L NAA，24℃下暗培养。在诱导5天后，芽周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为30/50。
实施例3优美红景天芽愈伤组织的诱导优美红景天的芽用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+0.8mg/L KT，0.5mg/L NAA，24℃下暗培养。在诱导5天后，芽周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为33/50。
实施例4优美红景天芽愈伤组织的诱导优美红景天的芽用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA，0.5mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导5天后，芽周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为49/50。
实施例5优美红景天芽愈伤组织的诱导优美红景天的芽用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导5天后，芽周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为47/50。
实施例6优美红景天叶愈伤组织的诱导优美红景天的叶用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。将叶片剪切，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，23～24℃下暗培养。在诱导5天后，某些叶片周围有突起并逐渐长出愈伤组织，30天后统计出愈率为42/50。
实施例7优美红景天叶愈伤组织的诱导优美红景天的叶用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。将叶片剪切，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+3.0mg/L 6-BA，0.3mg/L NAA，23～24℃下暗培养。在诱导5天后，某些叶片周围有突起并逐渐长出愈伤组织，30天后统计出愈率为39/50。
实施例8优美红景天叶愈伤组织的诱导优美红景天的叶用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。将叶片剪切，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培养。在诱导5天后，某些叶片周围有突起并逐渐长出愈伤组织，30天后统计出愈率为39/50。
实施例9优美红景天叶愈伤组织的诱导优美红景天的叶用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。将叶片剪切，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA，2.0mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培养。在诱导5天后，某些叶片周围有突起并逐渐长出愈伤组织，30天后统计出愈率为39/50。
实施例10优美红景天叶愈伤组织的诱导优美红景天的叶用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。将叶片剪切，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，0.5mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培养。在诱导5天后，某些叶片周围有突起并逐渐长出愈伤组织，30天后统计出愈率为39/50。
实施例11优美红景天茎愈伤组织的诱导从优美红景天茎的基部剪取枝条，自来水冲洗5小时，无菌水冲洗3遍，75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。去除叶片，将茎剪成0.5～1cm的节段，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA，0.5mg/L KT，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导7天后，某些茎段周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为41/50。
实施例12优美红景天茎愈伤组织的诱导从优美红景天茎的基部剪取枝条，自来水冲洗5小时，无菌水冲洗3遍，75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。去除叶片，将茎剪成0.5～1cm的节段，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导7天后，某些茎段周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为43/50。
实施例13优美红景天茎愈伤组织的诱导从优美红景天茎的基部剪取枝条，自来水冲洗5小时，无菌水冲洗3遍，75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。去除叶片，将茎剪成0.5～1cm的节段，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA，0.6mg/L KT，2.0mg/L NAA，24℃下暗培养。在诱导7天后，某些茎段周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为30/50。
实施例14优美红景天茎愈伤组织的诱导从优美红景天茎的基部剪取枝条，自来水冲洗5小时，无菌水冲洗3遍，75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。去除叶片，将茎剪成0.5～1cm的节段，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，2.0mg/L NAA，24℃下暗培养。在诱导7天后，某些茎段周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为31/50。
实施例15四裂红景天茎愈伤组织的诱导从四裂红景天茎的基部剪取枝条，自来水冲洗5小时，无菌水冲洗3遍，75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。去除叶片，将茎剪成0.5～1cm的节段，接种于诱导培养基固体MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，0.3mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导7天后，某些茎段周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为40/50。
实施例16四裂红景天茎愈伤组织的诱导从四裂红景天茎的基部剪取枝条，自来水冲洗5小时，无菌水冲洗3遍，75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。去除叶片，将茎剪成0.5～1cm的节段，接种于诱导培养基固体MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，2.0mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导7天后，某些茎段周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为41/50。
实施例17四裂红景天茎愈伤组织的诱导从四裂红景天茎的基部剪取枝条，自来水冲洗5小时，无菌水冲洗3遍，75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。去除叶片，将茎剪成0.5～1cm的节段，接种于诱导培养基固体MS基本培养基+0.5mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，1.0mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导7天后，某些茎段周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为38/50。
实施例18四裂红景天叶愈伤组织的诱导四裂红景天的叶用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。将叶片剪切，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，0.3mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培养。在诱导5天后，某些叶片周围有突起并逐渐长出愈伤组织，30天后统计出愈率为36/50。
实施例19四裂红景天叶愈伤组织的诱导四裂红景天的叶用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍。0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍。将叶片剪切，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，2.0mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，23～24℃下暗培养。在诱导5天后，某些叶片周围有突起并逐渐长出愈伤组织，30天后统计出愈率为33/50。
实施例20四裂红景天芽愈伤组织的诱导四裂红景天的芽用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+3.0mg/L 6-BA，0.1mg/L KT，0.3mg/L NAA，1.0mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导5天后，芽周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为43/50。
实施例21四裂红景天芽愈伤组织的诱导四裂红景天的芽用自来水冲洗4小时，无菌水冲洗3遍，70％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3遍，0.1％HgCl2消毒10分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到诱导培养基固体MS基本培养基+3.0mg/L 6-BA，1.0mg/L KT，2.0mg/L NAA，0.7mg/L 2，4-D，24℃下暗培养。在诱导5天后，芽周围有突起并逐渐长出愈伤组织。30天后统计出愈率为40/50。
实施例22优美红景天愈伤组织悬浮培养的生长动力学优美红景天愈伤组织在诱导培养基上培养25天后，挑选生长快、颜色鲜嫩优美红景天茎诱导愈伤组织，按照0.3g鲜重/瓶接种于20ml固体继代培养基基础MS固体培养基+3mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，0.1mg/L ABA和1.0mg/L GA3，50ml的锥形瓶中，24℃培养，光照强度为1000Lx，8h/天。将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+3mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，0.1mg/L ABA和1.0mg/L GA3中，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好。愈伤组织每四天收获一次，测鲜重、干重。结果见附图1和附图2。红景天愈伤组织悬浮培养的生长动力学。从附图1和附图2中可以看出，愈伤组织从第四天开始就进入快速生长的对数期，16天时进入平稳期，20天时鲜重达到最高。
实施例23优美红景天愈伤组织中红景天甙的提取取0.2g烘干的优美红景天愈伤组织于研钵中研成粉末，加入10ml甲醇，超声(150W)处理20min，12,000rpm离心10min，取上清。将沉淀中再加入10ml甲醇重复处理，合并上清得红景天甙粗提液，用φ0.22μm的滤膜过滤。
实施例24愈伤组织红景天甙的HPLC测定采用Agilent 1100 series高效液相色谱仪，在Hypersil C18 R-ODS柱(250mm×4.6mm，5μl)进行恒速洗脱，流动相为20％的甲醇。进样10μl、流速1ml/分钟、温度30℃、检测波长276nm。
实施例25优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+3mg/L 6-BA，0.5mg/L NAA，0.01mg/L ABA和0.5mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为18.0g/L，红景天甙含量为50mg/mL。
实施例26优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+3mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.8mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为19.5g/L，红景天甙含量为52mg/mL。
实施例27优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+3mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.8mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为22.2g/L，红景天甙含量为56mg/mL。
实施例28优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+3mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.8mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为22.4g/L，红景天甙含量为52mg/mL。
实施例29优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+3mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，0.1mg/L ABA和1.0mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为23.5g/L，红景天甙含量为54mg/mL。
实施例30优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和0.5mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为19.0g/L，红景天甙含量为53mg/mL。
实施例31优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为25.0g/L，红景天甙含量为60mg/mL。
实施例32优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+8mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.01mg/L ABA和1.0mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为19.6g/L，红景天甙含量为54mg/mL。
实施例33优美红景天愈伤组织的液体继代培养将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基基础MS液体培养基+8mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.08mg/L ABA和2.0mg/L GA3，24℃室内散射光下培养，转速为90rpm。愈伤组织生长良好，20天时收获，干重为20.2g/L，红景天甙含量为53mg/mL。
实施例34诱导子对优美红景天愈伤组织红景天甙产量的影响将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，在第19天分别加入诱导子SA 0.2mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 0.1g/L，24℃下室内自然光下培养20天收获，测干重为22.5g/L，提取红景天甙后HPLC测定含量为150mg/L。
实施例35诱导子对优美红景天愈伤组织红景天甙产量的影响将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，在第19天分别加入诱导子SA 0.2mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 1.0g/L，24℃下室内自然光下培养20天收获，测干重为23.6g/L，提取红景天甙后HPLC测定含量为230mg/L。
实施例36诱导子对优美红景天愈伤组织红景天甙产量的影响将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，在第19天分别加入诱导子SA 0.2mg/L，MJ 3mg/L，YE 0.5g/L，24℃下室内自然光下培养20天收获，测干重为24.7g/L，提取红景天甙后HPLC测定含量为180mg/L。
实施例37诱导子对优美红景天愈伤组织红景天甙产量的影响将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，在第19天分别加入诱导子SA 1.8mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 0.1g/L，24℃下室内自然光下培养20天收获，测干重为24.0g/L，提取红景天甙后HPLC测定含量为170mg/L。
实施例38诱导子对优美红景天愈伤组织红景天甙产量的影响将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，在第19天分别加入诱导子SA 2.0mg/L，MJ 0.5mg/L，YE 1.0g/L，24℃下室内自然光下培养20天收获，测干重为25.0g/L，提取红景天甙后HPLC测定含量为240mg/L。
实施例39诱导子对优美红景天愈伤组织红景天甙产量的影响将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，在第19天分别加入诱导子SA 2.0mg/L，MJ 5.0mg/L，YE 1.0g/L，24℃下室内自然光下培养20天收获，测干重为23.8g/L，提取红景天甙后HPLC测定含量为210mg/L。
实施例40提高优美红景天茎愈伤组织中红景天甙产量的培养基以下为改良的MS液体培养基蔗糖 30000mg/L 硫酸铜 0.025mg/L(CuSO4·5H2O)硝酸铵 1650mg/L 氯化钴 0.025mg/L(CoCl2·6H2O)硝酸钾 1900mg/L 甘氨酸 4mg/L磷酸二氢钾 170mg/L 盐酸硫胺素 0.8mg/L硫酸镁 370mg/L 盐酸吡哆素 1.0mg/L氯化钙 440mg/L 烟酸 1.0mg/L硫酸锰 22.3mg/L 肌-肌酸 200mg/L硫酸锌 8.6mg/L 硫酸亚铁 55.6mg/L(FeSO4·7H2O)硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二钠 74.6mg/L碘化钾 0.83mg/L钼酸钠 0.25mg/L(Na2MoO4·2H2O)
将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，每个实验有三瓶重复，24℃下暗培养。20天收获，测干重为19.9，提取红景天甙后HPLC测定含量，计算产量为180mg/L。
实施例41提高优美红景天茎愈伤组织中红景天甙产量的培养基以下为改良的MS液体培养基蔗糖 55000mg/L 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸铵 1650mg/L 氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸钾 1900mg/L 甘氨酸 5mg/L磷酸二氢钾 170mg/L 盐酸硫胺素 1.5mg/L硫酸镁 370mg/L 盐酸吡哆素 2.0mg/L氯化钙 440mg/L 烟酸 1.5mg/L硫酸锰 22.3mg/L 肌醇 300mg/L硫酸锌 8.6mg/L 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 80mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二钠 100mg/L碘化钾 0.83mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L溶剂为水。
将优美红景天茎愈伤组织按1.5g鲜重/瓶分别接种在含有5mg/L 6-BA，0.7mg/L NAA，0.07mg/L ABA和0.5mg/L GA3的改良的MS液体培养基中悬浮培养，250ml的锥形瓶中含有50ml培养基，每个实验有三瓶重复，24℃下暗培养。20天收获，测干重为20.1，提取红景天甙后HPLC测定含量，计算产量为150mg/L。
权利要求
1.一种优美红景天和四裂红景天愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤取茎、叶或芽，冲洗、消毒后，将茎剪成0.5～1cm的节段、叶剪出切口、芽直接接种到固体诱导培养基上，23～24℃下暗培养。
2.权利要求
1所述的优美红景天和四裂红景天愈伤组织的诱导方法，其特征在于所用的培养基是在固体MS基本培养基中添加6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～3mg/L和/或激动素(KT) 0.1～1.0mg/L中至少一种，以及萘乙酸(NAA) 0.3～2mg/L和/或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.5～1.0mg/L中至少一种。
3.一种优美红景天和四裂红景天愈伤组织的继代培养方法，包括以下步骤愈伤组织在固体诱导培养基上培养25～35天后，挑选生长快、颜色鲜嫩的愈伤组织，接种在固体继代培养基中，24℃培养。传代3～5次后，将固体培养基上的红景天愈伤组织颗粒接种于液体继代培养基中，震荡培养。
4.权利要求
3所述的优美红景天和四裂红景天愈伤组织的培养方法，其特征在于所用的培养基中含有6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 3～8mg/L 萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L脱落酸(ABA) 0.01～0.1mg/L 赤霉素(GA3) 0.5～2.0mg/L
5.权利要求
4所述的优美红景天和四裂红景天愈伤组织的培养方法，其特征在于所用的培养基中还含有；水杨酸 0.2～2mg/L茉莉酸甲酯 0.5～5mg/L酵母提取物 0.1～1g/L
6.权利要求
4或5所述的优美红景天和四裂红景天愈伤组织的培养方法，其特征在于所用的培养基是改良的MS培养基，其组成和含量如下蔗糖 30000～60000mg/L 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸铵 1650mg/L 氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸钾 1900mg/L 甘氨酸 4～6mg/L磷酸二氢钾 170mg/L 盐酸硫胺素 0.8～2.0mg/L硫酸镁 370mg/L 盐酸吡哆素 1.0～2.0mg/L氯化钙 440mg/L 烟酸 1.0～2.0mg/L硫酸锰 22.3mg/L 肌醇 200～300mg/L硫酸锌 8.6mg/L 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 55～85mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二钠 74.6～111.9mg/L碘化钾 0.83mg/L 琼脂 0～2000mg/L钼酸钠 0.25mg/L(Na2MoO4·2H2O)溶剂为水。
7.权利要求
6所述的优美红景天和四裂红景天愈伤组织的培养方法，其特征在于所用的培养基是改良的MS培养基，其组成和含量如下蔗糖 30000mg/L 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.025mg/L硝酸铵 1650mg/L 氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L硝酸钾 1900mg/L 甘氨酸 4mg/L磷酸二氢钾 170mg/L 盐酸硫胺素 0.8mg/L硫酸镁 370mg/L 盐酸吡哆素 1.0mg/L氯化钙 440mg/L 烟酸 1.0mg/L硫酸锰 22.3mg/L 肌醇 200mg/L硫酸锌 8.6mg/L 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 55.6mg/L硼酸 6.2mg/L 乙二胺四乙酸二钠 74.6mg/L碘化钾 0.83mg/L 琼脂 0～2000mg/L钼酸钠 0.25mg/L(Na2MoO4·2H2O)溶剂为水。
专利摘要
本发明涉及植物组织的培养方法和的培养基，具体地说，本发明涉及红景天的组织培养方法和培养基。本发明提供了优美红景天(R.coccinea)和四裂红景天(R.quadrifida)愈伤组织的培养方法，以及可以提高优美红景天和四裂红景天愈伤组织诱导率的培养基，该培养基是在MS基本培养基中添加一定浓度的植物激素组合物；还提供了一种优美红景天和四裂红景天愈伤组织的继代培养方法和适合其愈伤组织快速生长并促进红景天甙生产的培养基，该培养基系在MS基本培养基中添加植物激素和/或诱导子；以及可以提高优美红景天和四裂红景天愈伤组织中红景天甙产量的改良的MS培养基。
文档编号A01H4/00GKCN1650696SQ200410018654
公开日2005年8月10日 申请日期2004年2月4日
发明者盛长忠, 姜燕, 元英进 申请人:天津天士力制药股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan