专利名称:一种重组人尿激酶原的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人尿激酶原的纯化方法，更具体地说是用色谱技术纯化重组人尿激酶原的方法。
背景技术：
尿激酶原是一种特异性溶血栓药物，具有良好的市场前景。目前，已经能够通过基因重组技术在多种基因工程细胞如大肠杆菌、哺乳动物、酵母、昆虫等细胞生产尿激酶原。在尿激酶原的生产过程中产品的纯化技术非常重要，是决定产品质量、影响生产成本和效益的关键步骤。
公开文献报道的尿激酶原的纯化技术，如Avgennos G.C.等(1990)用快流速磺酸型琼脂糖凝胶珠(S-Sepharose Fast Flow)阳离子交换色谱、对氨基苯甲脒亲和色谱、磺酸型阳离子交换快速蛋白质液相色谱(mono-S FPLC)、第二次对氨基苯甲脒亲和色谱四步法从CHO基因工程细胞培养物中纯化人尿激酶原，但是该四步方法在实际应用中操作比较繁琐，延长了生产操作时间，而且纯化的尿激酶原总产率仅为40％。按此方法进行放大工业化生产，势必受到限制。
另外如专利申请“溶血栓新药——重组人尿激酶原的纯化工艺”(申请国中国，公开号CN1164536A，
公开日1997年11月12日)公开了一种对CHO基因工程细胞培养液中重组人尿激酶原的四步纯化工艺，包含第一步羧甲基径向阳离子交换色谱法(CM-径向阳离子交换色谱法)、第二步微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附色谱法、第三步S-200型葡聚糖聚丙烯酰氨高效凝胶(Sephacryl S-200HR)色谱法和第四步对氨基苯甲脒亲和色谱法。该纯化方法采用的CM-径向阳离子交换色谱填料不能在线清洗消毒，使用寿命短，而且刚性差，结构不规则，装填色谱柱比较麻烦，不利于放大；另外，该纯化方法的收率较低，仅有50％，用于大规模工业生产不够理想。
发明内容
本发明旨在解决动物细胞表达的尿激酶原的大规模纯化问题。
为此，本发明提供了一种用Streamline-SP扩张床色谱、Sephacryl S-200凝胶色谱、对氨基苯甲脒Sepharose Fast Flow亲和色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱法等，从哺乳动物工程细胞培养上清中大量纯化基因工程产品的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案A.用阳离子交换Streamline-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B.用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗产品；C.用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D.用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞DNA。
本发明还提供了优选的工艺条件其中步骤A优选的工艺条件是指将收集的细胞培养上清，调pH至5.5～6.8。色谱柱先用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速30～60ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)和0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.8～1.2mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
步骤A更优选的工艺条件是收集的细胞培养上清，调pH至6.4。色谱柱先用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速40ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含1.0mol/L氯化钠，pH7.0)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
其中步骤B优选的工艺条件是指将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速10～40ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
步骤B更优选的工艺条件是将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.4)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速20ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
其中步骤C优选的工艺条件是指将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
步骤C更优选的工艺条件是将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
其中步骤D优选的工艺条件是指将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005～0.010mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至7.5～8.5后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
步骤D更优选的工艺条件是将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用1mol/L Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
为了达到更好的实验效果，优选的方法是在步骤C和D之间还包括步骤E用阳离子交换Streamline-SP固定床色谱柱浓缩尿激酶原，浓缩可达10～15倍左右，大大方便了后续操作。
步骤E优选的工艺条件是将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至5.5～6.8后，上柱，随后用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
步骤E更优选的工艺条件是将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至6.4后，上柱，随后用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
本发明所采用的纯化方法，培养液上清不需要离心或过滤，即可直接上柱，并且该纯化方法处理量大，流速快，可以节省操作步骤，节约成本，提高收率，适合于大规模生产；另外，所采用的分离介质便于装填色谱柱，而且操作简便，易于清洗消毒。经上述方法分离纯化的尿激酶原产品可以达到SFDA对生物制品的要求，并且回收率达到70％以上，优于以往的尿激酶原产品纯化方法。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，以下列举实施本发明的具体实施例。
实施例一尿激酶原基因的克隆和表达载体的构建(参见中国专利重组人糖基化尿激酶原的制备方法，公告号CN1062016C，公告日2001年2月14日)采用肉豆寇酯(PMA)诱导Detroit 562细胞，提取细胞总RNA，构建cDNA文库，通过筛选获得了含有编码尿激酶基因片段的阳性克隆株，得到人尿激酶原全长cDNA基因并克隆至pUC19质粒，获得了PMM-UK重组质粒；从pMM-UK质粒DNA中，分离pro-UK cDNA并插入中间载体1pSV2-pro-UK中得到可表达尿激酶原的重组质粒pSV2-pro-UK；从pSV2-dhfr载体中得到内含SV40增强子和二氢叶酸还原酶基因，将此片段插入pXMT载体中，从而获得中间载体pMTSV-dhfr；从pSV2-pro-UK中得到含SV40增强子和全长尿激酶原cDNA，并将该片段插入PMTSV-dhfr中间载体中，即可获得可表达尿激酶原的载体pMTsv-du。
实施例二转染和筛选高效表达的CHO工程细胞将20-40μg pMTSV-du质粒DNA通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞，先用HAT选择培养基筛选，10大后换成含1-3×10-8M MTX的选择培养基进行dhfr和MTX双重筛选，并对表达有尿激酶原活性的阳性转化细胞经多次亚克隆和MTX加压扩增基因，锌离子诱导，最终筛选到能高效表达尿激酶原的细胞株。
实施例三CHO工程细胞的培养和放大CHO工程细胞由方瓶(单层贴壁培养)一转瓶(单层贴壁培养)一搅拌瓶(多孔微载体培养)一5LCelligen反应器(多孔微载体培养)一30L Biostat UC反应器(多孔微载体培养)逐级放大培养。由于细胞能在长满细胞的载体和空载体之间自动转移，每级放大培养时，先在更大规模的反应器中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体，长满细胞的多孔微载体通过管道直接近人下一级反应器中。控制pH为7.0±0.5，DO为7％-40％，温度为37.0±0.1℃，搅拌转速为70r/min-90r/min.多孔微载体的浓度为2g/L-g/L培养基。采用批式换液连续培养方式，每天通过细胞截留系统换液1-1.2个工作体积，将微载体截留在反应器中，收获含产品的上清并加入新鲜培养基。
实施例四用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原A.收集50升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.4。色谱柱先用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速40ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含1.0mol/L氯化钠，pH7.0)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速20ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例五用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原A.收集100升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.0。色谱柱先用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速40ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)和0.008mol/L磷酸盐缓冲液(含1.2mol/L氯化钠，pH7.6)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.6)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速20ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.6)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至7.8后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例六用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原A.收集200升工程细胞培养上清，用HCl调pH至5.8。色谱柱先用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速60ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)和0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.8mol/L氯化钠，pH6.8)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.4mol/L氯化钠，pH6.8)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速40ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.4mol/L氯化钠，pH6.8)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.008mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例七用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原A.收集200升工程细胞培养上清，用HCl调pH至5.5。色谱柱先用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速45ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)和0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.8mol/L氯化钠，pH7.5)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.3mol/L氯化钠，pH7.5)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速30ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.3mol/L氯化钠，pH7.5)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
E.将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至5.5后，上柱，随后用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.3mol/L氯化钠，pH7.5)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.010mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至7.5后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例八用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原A.收集150升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.4。色谱柱先用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速50ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含1.2mol/L氯化钠，pH7.8)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.8)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速40ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.8)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
E.将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至6.4后，上柱，随后用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，pH7.8)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.0后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
实施例九用色谱纯化法纯化重组人尿激酶原A.收集150升工程细胞培养上清，用HCl调pH至6.8。色谱柱先用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速50ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)和0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含1.2mol/L氯化钠，pH7.0)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
B.将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速35ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
E.将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至6.8后，上柱，随后用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
D.将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液将步骤C收集的穿过液的pH调至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
权利要求
1.一种重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于该方法包括如下步骤A.用阳离子交换Streamline-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B.用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗产品；C.用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D.用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞的DNA。
2.按照权利要求
1所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于在步骤C和D之间还包括步骤E用阳离子交换Streamline-SP固定床色谱浓缩尿激酶原。
3.按照权利要求
2所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤E是指将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至5.5～6.8后，上柱，随后用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
4.按照权利要求
3所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤E是指将Streamline-SP固定床色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)平衡色谱柱3～5个柱体积，第C步下来的样品稀释后，用NaOH调pH至6.4后，上柱，随后用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)洗脱，并收集洗脱蛋白吸收峰。
5.按照权利要求
1、2或3所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤A是指将收集的细胞培养上清，调pH至5.5～6.8。色谱柱先用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速30～60ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5～6.8)和0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.8～1.2mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
6.按照权利要求
5所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤A是指将收集的细胞培养上清，调pH至6.4。色谱柱先用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速40ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含1.0mol/L氯化钠，pH7.0)进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
7.按照权利要求
1、2或3所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤B是指将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速10～40ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
8.按照权利要求
7所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤B是指将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速20ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
9.按照权利要求
1、2或3所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤C是指将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH6.8～7.8)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
10.按照权利要求
9所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤C是指将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L氯化钠，pH7.0)平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液。
11.按照权利要求
1、2或3所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤D是指将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005～0.010mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液调步骤C收集的穿过液pH至7.5～8.5后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
12.按照权利要求
11所述的重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于所述步骤D是指将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用1mol/L Tris溶液调步骤C收集的穿过液pH至8.2后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。
专利摘要
本发明涉及一种重组人尿激酶原的纯化方法，更具体地说是用色谱技术纯化制备重组人尿激酶原的方法。为了解决动物细胞表达的尿激酶原的大规模纯化问题，本发明公开了一种用Streamline－SP扩张床色谱、Sephacryl S－200凝胶色谱、对氨基苯甲脒Sepharose Fast Flow亲和色谱和DEAE－Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱法，从哺乳动物工程细胞培养液回收基因工程产品的方法。还可以在步骤C和D之间包括步骤E用阳离子交换Streamline－SP固定床色谱柱浓缩尿激酶原。采用上述方法得到符合SFDA要求的重组人尿激酶原，总回收率在70％以上，纯度达到99％以上。
文档编号C12N9/72GKCN1680550SQ200410018835
公开日2005年10月12日 申请日期2004年4月5日
发明者肖成祖, 张正光, 姜燕, 胡显文, 胥照平, 李世崇, 刘健, 高丽华 申请人:天津天士力制药股份有限公司, 上海天士力药业有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan