纯尿激酶酶原与人血清白蛋白通过二硫桥键共价连接形成的血纤维蛋白溶酶原激活剂复合物的制作方法

专利名称：纯尿激酶酶原与人血清白蛋白通过二硫桥键共价连接形成的血纤维蛋白溶酶原激活剂复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用尿激酶酶原作为溶解血栓的药剂，以溶解患者体内的血纤维旦白凝块。
尿激酶酶原(UK酶原)由单链组成，分子量为55千道尔顿，是双链尿激酶(UK)的前体(酶原)。在美国再颁专利32，221中Husain等人对尿激酶酶原作了详细描述，在本文中作为参考。单链尿激酶酶原经酶促转化作用活化为双链UK形式，其特征是转移丝氨酸旦白酶家族到适当位置。尿激酶酶原通过静脉注射后很快从血浆中清除，约为5-8分钟。这一清除时间比它的活性衍生物即高分子量的双链UK的清除时间短。
本发明描述了由纯尿激酶酶原与人血清白蛋白(HSA)共价连接形成的血纤维旦白溶酶原激活剂复合物。形成的复合物可明显延迟尿激酶酶原从血浆中清除，同时保留了溶解血纤维旦白的特性。本文所说的“尿激酶酶原”是指天然存在的或重组产生的UK酶原(UK酶原的任何酶原缺失突变型)、或者是任何具生物学活性的UK酶原的单链衍生物或片段，该衍生物或片段含有一个能与HSA的游离半胱氨酸残基进行硫醇一二硫基转换的胱氨酸残基，在下文将详细描述。本文所说的“HSA”是指天然存在的或重组的HSA。本文所说的“纯”是指在使用前该复合物实质上(占重量的95%或更大)不含其它物质(如血液或组织培养物中的其他成分)。
由于本发明所述的复合物比UK酶原本身在体内具有更长的半衰期，因而提高了它在血栓溶解治疗中的使用价值。而本发明的复合物不仅可预防血栓形成，而且能长期地预防心血管病变，如已知与血纤维旦白溶解活性受抑制有关的动脉粥样硬化。
由于在体内的半衰期得到改善，本发明所述的UK酶原HSA复合物可通过静脉内注射方法用于治疗。从而改进了UK酶原本身在治疗中使用，因为UK酶原在体内的半衰期短，在治疗时必须进行连续静脉内注射，从而给治疗带来极大的不便，尤其是医院外的治疗。
本发明的其它特征和优点在下面描述的优选实施例和权利要求中能明显地看出。
首先对附图进行描述如下

图1(a)是完整的单链UK酶原分子的模式图，(Holmes et al，Biotechnology(1985)，3，923-929);图1(b)显示单链UK酶原与HSA的共价连接。
图2显示UK酶原/HSA混合物在37℃中温育4小时后过滤层析结果。收集0.5ml馏出物测定蛋白质含量(O)和血纤维旦白溶解活性(O)。
图3是UK酶原在不同介质中温育后的酶谱。
泳道2-在缓冲液中温育3-在HSA中温育4-在CBS血浆中温育5-在CBS血浆和HSA中温育6-在血浆中温育。
7-10表示经过α(HSA)-Sephadex柱后UK酶原与HSA一起温育。
图4显示泳道2-3表示纯化的复合物的酶谱。
4-表示纯化的复合物与α(HSA)温育1小时后的酶谱，以及通过α(HSA)-Sephadex柱后纯化的复合物的酶谱。泳道3中的样品在电泳前先在SDS缓冲液中煮沸2分钟，而不用在37℃ SDS缓冲液中温育30分钟这一经典方法。
图5中泳道2，3，4分别表示pH值为5，7.5，9时UK酶原与纯化的HSA中温育后的酶谱。泳道6，7，8分别是在Zn2+、Ca2+、以及Zn2+和Ca2+存在时UK酶原与纯化的HSA温育后的酶谱。泳道9是UK酶原与HSA浓度比为10时两者一起温育后的酶谱。
图6中显示泳道2-UK酶原在缓冲液中温育后的酶谱泳道3、4、5和6分别表示UK酶原在血浆中温育0小时、1小时、2小时、6小时、的酶谱。
7-表示UK在缓冲液中温育后的酶谱。
8、9-分别表示在血浆中温育0，6小时后的酶谱。
10-表示在浓缩尿中温育后酶谱。
图7是HSA经DFP和氯胺T处理(不影响形成复合物)以及BSA经DTT处理(使之恢复与UK酶原形成复合物的能力)后得的酶谱。
泳道1-UK酶原在缓冲液中温育。
2-UK酶原与HSA一起温育。
3-UK酶原与缓冲液处理的HSA一起温育4-UK酶原与DFP处理的HSA一起温育5-UK酶原与缓冲液处理的HSA一起温育。
6-UK酶原与氯胺T处理的HSA一起温育。
7-UK酶原以二聚体形式存在于缓冲液。
8-相同二聚体形式的UK酶原与BSA一起温育。
9-UK酶原与经DTT处理的BSA(恢复硫醇形式)一起温育。其中二聚体完全消除，存在有UK酶原BSA复合物。
图8A和8B的酶谱表示PDI对复合过程的影响。
图8A中泳道1表示单独存在于缓冲液中的酶原酶谱。泳道2，3，4，5，6，7分别是重组UK酶原(0.5μg/ml)与硫醇白蛋白(40mg/ml)一起温育，时间分别为0，15分钟，30分钟和1小时，2小时，4小时的酶谱。
图8B中将8A中相应的混合物在PDI(920μg/ml)存在时温育。
图9的酶谱表示剂量与形成的复合物的相关性中PDI的作用。
泳道1表示UK酶原单独存在于缓冲液中。泳道2，3，4，5，6，7表示UK酶原(10μg/ml)和巯基白蛋白(40mg/ml)在PDI浓度分别为0，23，230，460，690，920(μg/ml)时温育6hr。
图10是UK酶原与来自于E。Coli的重组HSA(rec-HSA)形成的复合物的酶谱。
图11中泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9，10分别表示37℃时0.5μg/ml的UK酶原在缓冲液中温育0，6hr，在血浆中温育0，1hr，4hr，6hr，以及在去除血纤维旦白溶酶原而加入aprotinin(20KIU/ml)的血浆中温育0，1hr，4hr，6hr后，在37℃的SDS中制得样品的酶谱。
图12表示下列样品的酶谱。
泳道1-表示37℃时0.5μg/ml UK酶原在缓冲液温育。
泳道2-表示37℃时0.5μg/ml的UK酶原与CBS-HSA(40mg/ml)一起温育。
3-表示UK酶原(0.5μg/ml)在去除HSA的血浆中温育。
4-表示UK酶原(0.5μg/ml)在去除HSA的血浆中重新补充HSA后温育。
5-表示血浆与未经UK-Ab Sepharose柱过滤的UK酶原一起预保温。
6-9分别表示血浆与经过UK-Ab Sepharose柱过滤后流出的4个部分预培养。
图13表示下列不同形式的UK(0.5μg/ml)和巯基白蛋白(40mg/ml)预培养6hr后的酶谱(10%SDS-PAGE)。
泳道1-HMW-UK存在缓冲液中的酶谱。
泳道2-HMW-UK和HSA预培养。
泳道3-LMW-UK存在于缓冲液中。
泳道4-LMW-UK和HSA一起培养。
泳道5-重组UK酶原与HSA培养。
泳道6-缺失突变型UK酶原存在于缓冲液中。
泳道7-缺失突变型UK酶原与HSA共培养。
图14是利用UKAb与下列样品进行的Western免疫吸印反应。
泳道1-UK酶原(0.3μg/ml)在缓冲液中37℃时培养7hr。
泳道2-UK酶原与未经处理的BSA(40μg/ml)一起温育。
泳道3-UK酶原与CBS-HSA共温育。
泳道4-单独存在的CBS-HSA泳道5-8表示分别与1-4相同的混和物样品在还原性条件下培养。
图15显示泳道1-表示在缓冲液中培养的UK酶原的酶谱。
2，3分别表示在含有0.5mM和5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的缓冲液中培养的UK酶原的酶谱。
4-6分别表示UK酶原在血浆、含有0.5mM和 5mM的GSSG的血浆中培养时的酶谱。
图16显示的酶谱泳道1-5表示UK酶原分别培养于缓冲液、含有10-3M、3×10-3M，6×10-3M，10-2M的DTNB的缓冲液中的酶谱。泳道6-10表示UK酶原分别培养于血浆、含有10-3M、3×10-3M，6×10-3M，和10-2M的DTNB的血浆时的酶谱。
图17酶谱表示pH和HSA浓度对形成复合物的影响。
泳道1-单独存在于缓冲液中的UK酶原的酶谱。
泳道2-6分别表示pH为6，7.0，7.4，8.0，8.5时5μg/ml的UK酶原与巯基白蛋白(40mg/ml)在37℃时一起培养24hr后的酶谱。
泳道7-表示标准分子量对照泳道8-10表示5μg/mlUK酶原与浓度分别为80mg/ml，20mg/ml，10mg/ml的HSA在37℃pH＝8时培养24hr的酶谱。
图18酶谱表示与CBS-HSA相关的UK活性。
泳道1-其中CBS-HSA来自于与UK酶原(0.5μg/ml)预培养20hr的血浆。
泳道2-其中CBS-HSA来自于富含(5μg/ml)UK酶原的血浆(但未经预培养处理)泳道3-表示UK复合物与从新鲜血浆中分离的CBS-HSA发生免疫沉淀反应。
图19A是包含二组数据的曲线图。X轴上标示的二组数据表示血浆通过一个标准G-75柱凝胶过滤，收集的馏出部分的数目。Y轴上开环数据表示在280nm的吸收值。Y轴上的闭环数据表示在血纤维旦白的平板上测得的溶解面积(mm2)图19B显示收集到的馏出部分(分别与图11A中的A、B、C、D部分相同)UK免疫沉淀物的酶谱。
本发明所述的UK酶原白蛋白复合物具有下列特性1)在37℃的十二烷基磺酸钠(SDS)中比在100℃时更稳定。2)在还原性条件下不稳定。3)用二硫苏糖醇(DTT)预处理的HSA(恢复硫醇形式)可促进复合。4)蛋白二硫同分异构酶(PDI)催化复合反应。5)复合过程受DTNB和GSSG的抑制。复合物的这些特性暗示在白蛋白的游离半胱氨酸残基与UK酶原的胱AA残基之间形成一个二硫键。由于UK酶原发生缺失突变(丢失了11-135残基)或存在LMW-UK而不发生复合作用的实验中可推知形成一个二硫键的复合物中UK酶原的胱AA是在A链;很可能就是UK酶原NH2末端的配对胱AA之一。
纯化的HSA贮存很长时间后，由于游离半胱AA被氧化，阻碍了二硫基交换，导致它与UK酶原形成复合物的能力丧失。但用DTT处理后能重新获得与UK酶原结合的能力。这种处理是在酸性pH值条件下进行的，以保证维持HSA旦白质构型的二硫键的完整性。
在下文将详细描述本发明所述的溶解血栓组合物的二种制备方法。每一种方法，首先分别纯化UK酶原和白蛋白，然后借助二硫键连接结合(见图1A和1B)。
第一种方法，根据Peters，T.在Advances In Protein Chemistry，37∶161-245(1985)提出的方法，在pH＝6.0时用DTT处理白蛋白，使之恢复硫醇形式。通过渗析移走DTT，然后在PDI存在条件下，UK酶原与白蛋白结合。
第二种方法，纯UK酶原与硫醇白蛋白在37℃pH＝8.0培养过程中相结合。
下文描述的第一种方法中，UK酶原是由Collaborative Research Inc.(Bedford，MA)提供的，是从人肾细胞系培养物基质中纯化得到的。为抑制微量的UK污染物，UK酶原与20μM丹磺酰一谷氨酸一甘氨酸-精氨酸氯甲基酮(GGACK)在37℃0.1M HEPES，0.2mg/ml BSA，0.001%吐温，pH＝7.4时一起培养30分钟(见Pannell等人在Blood，69∶22-26，1987中的描述)。在下文描述的第二种方法中，UK酶原制剂通过一个Sephadex G-75柱(1×45cm)过滤，用10mM NaAc，0.1m NaCl，0.001%吐温pH＝4.8进行平衡和洗脱，去除UK酶原二聚体。然后与上面描述的相同方法处理，以抑制微量UK污染物。
从贮存血浆中纯化人血清白蛋白(HSA)的过程采用已公开的方法。以0.63%柠檬酸三钠和0.9%NaCl平衡Cibacron Blue-Sepharose(CBS)柱(1.5×25cm)，将10ml贮存血浆上柱，过滤，当在280nm的吸收值小于0.02时，用0.2M硫氰酸钠洗脱HSA，然后在蒸馏水中渗析，冻干。
采用分批分离方法制备不含血纤维旦白溶酶原的血浆。先将1ml赖氨酸琼脂糖和5ml血浆在0.005M HEPES和0.15M NaCl(pH＝7.4)中混匀，然后4℃时搅拌2hr，离心，取上清，用经典的血凝块溶解技术，测定上清中血纤维旦白溶酶原含量。
根据Laemmli描述的方法，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)其中聚丙烯酰胺凝胶的含量为7.5%。在没有其他特殊规定条件下，样品制备需在非还原条件下进行，将样品与缓冲液(0.06M Tris-HCl，pH＝6.8 2% SDS)一起在37℃加热37分钟，然后电泳。电泳结束后，在2.5% TritonX-100中，洗凝胶，然后按照Wun等人描述的方法将胶铺在血纤维旦白酶原血纤维旦白琼脂板上得到酶谱。根据Towbin和Pluskal等人描述的方法(只在规格上作些更改)进行Western吸印。聚丙烯酰胺凝胶和四张滤纸均匀地浸于吸印缓冲液(39mM甘AA，48mM Tris，20% 甲醇，0.0375%SDS)中平衡。二氟化聚偏乙烯(PVDF)膜预先在甲醇中浸几秒钟，然后在蒸馏水中平衡10分钟。进行吸印反应的各个部件装配成三明治形状，在LKB Multipore Ⅱ Semi-dry吸印仪，0.8mA/cm2电流时电泳转移1hr，然后用TTBS(100mM Tris，0.15M NaCl，0.1% Tween-80，pH＝7.5)洗PVDF膜，10分钟，再在含3%BSA的TTBS浸1hr。
用第一种方法获得吸印后的PVDF膜后，经过下列两次培养，然后进行免疫着色试验。首先将上述得到的PVDF膜与兔的UK抗抗体(10μg/ml)或HSA的单克隆抗体(以1500稀释度)在0.25%BSA的TTBS中37℃培养。然后将该膜与羊抗兔或兔抗鼠免疫球旦白(IgG)碱性磷酸酶结合物(Sigma)(以11000稀释度)在0.25%BSA的TTBS中37℃时培养1hr。利用第二种方法获得的膜，首先在13μg/ml的α(UK)和0.25%BSA的TTBS溶液中37℃培养2hr，然后与碱性磷酸酶结合物(以1500稀释度)在0.25%BSA的TTBS中37℃培养2hr。
颜色反应是利用5-Br-4-Cl-3-吲哚磷酸甲苯胺盐(0.15mg/ml)和p-硝基蓝tetrazolium Chloride(0.3mg/ml)在碳酸缓冲液(0.1M碳酸钠，1mM MgCl2，pH9.8)中进行。每次培养后，将PVDF膜在TTBS中洗三次，时间为10分钟。最后在碳酸缓冲液中洗15分钟，然后进行颜色反应。
按经典方法在37℃时用Kabi底物S2444测定UK酶原/UK酰胺溶解活性。反应缓冲液含0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，0.1mg/ml BSA，100μ/ml aprotinin，pH＝8.8，和0.75mM的底物。用1∶1的盐水5%乙酸终止反应，在405nm测定吸收值。血纤维旦白酶原激活因子的活性可用标准琼脂血纤维平板或谷氨酸-血纤维旦白酶原和Kabi底物S2251测定。
方法1根据Peters，T。在Adv，prot，chem，37∶161-245，1985中描述的方法，用10mM二硫基苏糖醇(DTT)在50mM MES，0.15M NaCl pH＝6.0处理HSA或BSA，以再生硫醇形式HSA和BSA，且从理论上计算每分子巯基白蛋白应含1个-SH。在pH为5-7时可保存维持构型的二硫键。通过渗析移走DTT，在920μg/ml PDI存在时将5μg/ml UK酶原与一种HSA试剂(40mg/ml)或与BSA，在0.1M HEPES缓冲液(pH＝8.0)中37℃时至少培养4hr以制备UK酶原白蛋白复合物。最后将200μl上述混合物通过Sephadex G-75柱(1×45cm)过滤，用0.1M HEPES，pH7.5，0.15M NaCl，0.001%吐温80，20KIU/ml aprotinin平衡和洗脱，收集0.5ml流出物，测定旦白质含量(280nm时的吸收值)和溶解血纤维旦白的活性，在非还原性条件下，复合物迁移出表观分子量约为100KDa的部分(已被定为标准)，但在该条件下，复合物迁移发生在UK酶原形成二聚体后。因此UK酶原HSA复合物的实际分子量约为120KDa。相当于120KDa复合物的3个流出部分被贮存。
应该注意，在培养步骤中使用固定化PDI，而不是PDI溶液。
方法2UK酶原HSA复合物通过下列步骤制备。5μg/ml UK酶原与40mg/ml HSA在0.1M HEPES缓冲液中37℃培养4hr，然后将200μl该混和物通过Sephadex G-75柱，用0.1M HEPES pH＝7.5，0.15M NaCl，0.001%吐温80，20KIU/ml aprotinin平衡和洗脱，收集0.5ml流出物，按标准旦白质分析方法测定旦白质含量，用血纤维旦白平板测得溶解血纤维旦白活性，结果见图2，(其中30-31-32流出部分贮存)。
用一种不溶性的多克隆UK抗体识别UK酶原HSA复合物，实验结果见图3所示。已纯化的UK酶原HSA复合物与HSA抗抗体在37℃培养1hr，在酶谱上显示的120KD裂解带被一条更高分子量的带所代替，表明复合物与HSA的抗体结合(见图4所示)。同样，纯化的复合物能结合到α(HSA)Sepharose柱上。这些发现证实了复合物的组成成分。
HSA或BSA经长期贮存后，由于游离半胱AA被氧化，使HSA或BSA与UK酶原形成复合物的能力降低。用5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)滴定有用的游离半胱AA(处于天然状态)方法测定不新鲜的商品HSA，结果表明每10分子商品HSA含1个游离半胱AA。相反，用上述方法2纯化后的新鲜HSA，每2分子含有一个游离半胱AA，因此，在培养形成复合物前，建议在pH＝6.0时用DTT处理HSA和BSA。
pH＝8.0时对复合物形成更有利，图5所示。在pH＝7.5时UK酶原与HSA能形成复合物(如其中3所示)，但在pH＝5或9时没有复合物形成(见2和4所示)。6、7、8分别表示加入50μM Zn2+、5mM Ca2+和Ca2++Zn2+对复合物形成没有影响，但是5-10μM Cu2+抑制复合物形成。
已发现在正常血浆中自发地产生UK酶原HSA复合物，从正常血浆中纯化得到的HSA与UK酶原有关。因此，UK酶原HSA复合物天然存在。在这些实验中，UK酶原与不含血纤维旦白溶酶原的血浆一起培养，血纤维旦白溶酶原激活因子的分子量可用酶谱分析测定。
UK酶原加到500ng/ml的血浆中，在37℃培养1-6hr，在此过程中，其酶促活性的部分以表观分子量为100KDa(实际分子量为120KDa)进行迁移。图6显示迁移的酶谱。其中2-6和8-9分别表示存在于缓冲液中的UK酶原与UK的酶谱。3和8、4、5以及6和9分别表示UK酶原和UK在血浆中培养时间为0、1、2或6hr的酶谱。在血浆中产生的这种新的高分子量(HMW)谱带是缓慢的依赖于时间现象。尽管由酶谱定量只不过是粗略估计，但从酶谱可大概知道在血浆中培养6hr后，酶活性的10%是由120KD(测得的实际值)分子产生的。从UK酶原在缓冲液中培养时没有HMW裂解带出现可排除UK酶原二聚体的形成。而且，如果UK酶原二聚体形成，应该迁移至复合物的前面(见图7、8B、9、10)。这个发现暗示UK酶原结合一个分子量约65千道尔顿的血浆旦白形成一个约120千道尔顿的化合物。
曾在尿和血浆中观察到由双链UK和一种UK抑制物PAI-3组成的具相同分子量的复合物。但是，根据下列理由，说明上述发现中排除了这种复合物存在的可能性(1)UK酶原与PAI-3不形成复合物;(2)UK酶原在血浆中是稳定的。在实验所用浓度时，UK酶原不会活化形成双链UK。最后一点，复合物形成不受加入的UK抑制物(Glu Gly Arg氯甲基酮)、血纤维旦白溶酶原抑制物(aprotinin 20KIU/ml)的抑制或者由于去除血浆中的血纤维旦白溶酶原而阻碍形成。
再者，在UKPAI-1(血纤维旦白溶酶原激活因子抑制剂-1)复合物的培养和形成过程中活化UK酶原与上述结果不相符。因为后一种复合物迁移的分子量约为95KD，同时伴随有分子量约为125KD和155KD的其他抑制剂复合物的产生。(Kruith of，E.K.O.et al;Blood，64∶907-913(1984))，而且在凝胶顶端存在能与α2-巨球旦白-Ab反应的第四种复合物。而且，为了减少在培养过程中UK酶原活化的可能性，可进行附加实验将aprotinin(20KIU/ml)加入到去除血纤维蛋白酶原的血浆中。这些步骤没有抑制120KD复合物的形成(图11中7-10所示)。
但是，当UK酶原与不含HSA的血浆(CBS血浆)培养时，没有高分子量的激活因子复合物产生，如图3所示。这些结果证明在血浆中观察到的复合物是由UK酶原和HSA结合形成的。
5μg/ml UK酶原与新鲜纯化的CBS-HSA(40mg/ml)在0.1M HEPES pH＝7.4 37℃一起至少培养4hr，用SDS-PAGE和酶谱鉴定该混和物时，常出现一条分子量约120KD的谱带(图12中的2所示)，相反UK酶原在不含CBS的血浆培养时，没有复合物形成(见图12的3所示)。在不含CBS的血浆中加入足量的CBS-HSA后重新形成复合物(见图2中的4所示)。将含有所说复合物的血浆(图2的5)通过一个UK-Ab sepharose柱移走该复合物(见图2的6-9所示)。
UK酶原与HSA和BSA的商品制剂一起培养时也可观察到复合物的形成，但必须用DTT预处理以恢复硫醇形式。
以UK酶原与CBS-HSA一起培养形成的复合物可用Sepha-dex G-75凝胶过滤分离，然后用SDS-PAGE方法分析。将样品煮沸，该复合物被完全分解，在凝胶酶谱图上能看到37℃时只有部分(＜50%)化合物被分解(图谱资料未列出)。
由于发现HMW-UK与HSA一起培养时也形成一种复合物(见图13中的2所示)，但HMW-UK在缓冲液中培养时又不形成该复合物(图13的1所示)，因此必须测定由UK和一种抑制物(与HSA在CBS柱上其纯化得到)组成的复合物出现的可能性。
这种复合物迁移后在酶谱上显示出的分子是约为120KD，相当于UK酶原在血浆中培养时形成的复合物(图13中5所示)。但是LMW-UK(Abbokinase)与HSA培养时没有复合物形成(见图13的3，4所示)。而且UK酶原的缺失突变体(丢失了第11-135位残基)与HSA共培养时也不形成复合物(图13的7所示)。这些结果表明复合物不是UK抑制物形成的，UK的A链参与复合反应，旦白酶的另一条链不参与。
为进一步排除UK抑制物复合物形成，用DFP预处理CBS-HSA，以抑制丝AA旦白酶污染物。DFP处理后不影响CBS-HSA与UK酶原形成复合物(如图7中4所示，与2和3相比较)。其次，用能使Serpin s失活的氯胺T处理HSA制剂可排除Serpin污染物(Stief et al.，Biol.Chem，Hoppe-Seyler，369∶1337-1348(1988))。这种处理也不抑制复合物的形成。因此，观察到的UK酶原或HMW UK形成的复合物中没有抑制剂参与。(图7的6所示，与5相比较，其中HSA未经处理)。
UK酶原与CBS-HSA共培养时，用UK多克隆抗体进行的Western免疫吸印反应，产生一条分子量约为120KD的谱带(见图14中3所表示)。但如果UK酶原在缓冲液培养(图14的1所示)或与未经DTT预处理的BSA共培养(图5的2所示)时不出现120KD谱带。作为对照的CBS-HSA与该抗体不发生可见的反应(见图14中的4和8)在还原性条件下，分子量约为120KD的复合物发生分解，暗示该复合物是通过二硫键连接的(图14中的7所示)。
有其他证据证明UK酶原白蛋白复合物是通过二硫键连接的。首先，当类似于氧化型谷胱甘肽或DTNB的巯基试剂加到方法2的反应混合物中时，能抑制复合物形成(下面详述)。氧化型谷胱甘肽加入血浆中后，在37℃时反应能进行2hr。试验结果见图15的酶谱，其中1-3表示在缓冲液中培养UK酶原时的酶谱。UK酶原HSA形成的复合物随加入谷胱甘肽浓度的增大而减少，其中2和5表示加入的谷胱甘肽浓度为0.5mM，3和6表示加入谷胱甘肽浓度为5.0mM，如图15中1-3所示，谷胱甘肽不会抑制UK酶原的溶解血纤维旦白活性。这种对谷胱甘肽的响应暗示复合物中包含了白蛋白的游离半胱AA，从而说明UK酶原与HSA是通过二硫键连接。同样，利用能与游离半胱AA反应的DTNB进行试验，结果表明DTNB抑制复合物的形成。图16是UK酶原培养于缓冲液中的酶谱(其中1-5所示)，其中6-10表示UK酶原与HSA在DTNB存在时共培养产生的酶谱。其中1和6所用DTNB浓度为0.0M，2和7所用DTNB浓度为1mM，3和8所用DTNB浓度为3mM，4和9所用DTNB浓度为6mM，5和10所用DTNB浓度为10mM。
其次，HSA或BSA的商品试剂与UK酶原形成少量或不形成复合物。如图7中的8所示，(只形成一个UK酶原二聚体)以及图14中的2所示，而且，与新鲜制剂CBS-HSA发生络合随着贮存时间增加而减少。但是，所有这些试剂用DTT处理后重新获得与UK酶原形成复合物的能力。DTT对商品BSA试剂的影响如图7中的9所示。在pH＝5-7时用DTT处理恢复硫醇形式的作用不会引起结构型二硫键的分解，如Peters，T.在Adv.Prot.Chem.，37∶161-245(1985)所描述。因此该结果表明HSA或BSA中存在的一个有用的半胱AA巯基是与UK酶原形成复合物所必需的。
第三，DTNB滴定反应表明DTT处理前与处理后，商品HSA中可利用半胱AA比例为0.10.6。处理后的数据可与新鲜制备的CBS-HSA相比。因此，HSA试剂中可利用半胱AA数目与该试剂与UK酶原形成复合物之间呈正相关性。
第四，培养混和物含有催化巯基-二硫基转换的PDI(Freed-man，R.B.，Cell，57∶1069-1072(1989);Gilbert，H.F.，Biochem.，28∶7298-7305(1989))存在时，能加快复合反应速度。如果没有PDI存在，培养4hr后才能看到形成的复合物(图8A所示)，但是在920μg/ml PDI存在时，培养1hr就能形成复合物(图8B)。PDI的作用与它的浓度具相关性如图9所示。其中UK酶原(10μμg/ml)与巯基白蛋白试剂(40mg/ml)在PDI浓度为0，23，230，460，680，或920μg/ml时一起培养6hr。PDI存在时UK酶原二聚体形成也进一步增加(如图8A，8B和9所示)。表明这些二聚体是通过二硫键连接的。所需PDI量越大说明该酶效能越低。
将样品在SDS中煮沸2分钟能抑制复合物形成(图14中的3所示)，说明存在有在煮沸时不稳定的二硫键连接的复合物。但是在抑制二硫基转换的CuCl2存在时(CuCl2为1mm)，该复合物对沸腾具抗性。Volkin和Klibanov曾报导某些通过二硫键连接的结合物中二硫键在受热时分解的特性。(Volkin et al.，J.Biol.Chem.，262∶2945-2950(1987))。
UK酶原的胱AA与白蛋白的未配对的半胱AA之间通过二硫键连接后，使结合白蛋白的UK酶原具有一个游离半胱AA。该游离的半胱AA能与另一个UK酶原分子的胱AA或另一个白蛋白分子的半胱AA反应。在这种情况下，形成的复合物不是由一分子UK酶原和一分子白蛋白组成，而是二分子UK酶原分子与一分子白蛋白结合或二分子白蛋白与一分子UK酶原结合。本发明已鉴定的这种三者联合的复合物属于本发明所述的复合物范围内。
培养在pH为6-8.5范围内进行时，可看到形成复合物的最适pH值约为8-8.5(图17中的1-6所示)。因此，大多数实验是在pH＝8.0时进行。利用HSA试剂与UK酶原的一系列浓度比值范围进行实验，结果表明决定复合物形成的主要限制因子是HSA浓度，结果见图17中的8-10所示。其中与UK酶原(5μg/ml)共培养的用DTT处理过的商品HSA浓度分别为80，20，10mg/ml。UK酶原浓度的提高不会加强复合物的形成。而且在过量HSA存在时，24hr后复合物形成逐渐达到停滞状态。
上述结果暗示UK酶原复合物可能是HSA或BSA制剂中存在的少量污染物。将HSA试剂用DEAE cellulose层析或通过伴刀豆球旦白-A Sepharose过滤除去污染物的方法不会改变它与UK酶原试剂反应的能力。因此，如果是存在有微量的旦白质污染物，也只能是糖旦白。除少数例外(HSA，transthyretin，结合蛋白质维生素A血浆旦白全是糖旦白(Peters，T，adv.prot.Chem.，37∶161-245(1985))。
根据方法1得到的UK酶原与高度纯化的，经DTT处理HSA形成的复合物经SDS-PAGE电泳后从凝胶上电洗脱，然后，再次SDS-PAGE电泳。UK-Ab免疫吸印反应表明复合物分子量约为120KD。但是，虽然在大量实验中这种复合物可通过HSA多克隆抗体识别，但在本实验中用HSA单抗体不能识别(没有显示资料)。这种相矛盾的结果可以解释为是由于HSA分子中能被这种单克隆抗体识别的主要抗原决定基被复合物掩盖了。而且，这种相反的发现说明UK酶原复合物有可能是存在于HSA或BSA中少量血浆旦白污染物。因此，实验中可使用来自于E.Coli的重组HSA(rec-HSA)进行。这种HSA不含任何血浆旦白污染物。
用DTT处理前(-)和处理后(+)，将Rec-HSA和天然HSA(40mg/ml)分别与UK酶原(5μg/ml)一起培养6hr，对培养混和物进行酶谱分析表明利用天然的或重组的HSA都能形成分子量约为120KD的复合物(c)，且用DTT预处理(+)HSA试剂可增加该复合物的形成。经DTT处理后也可促进高分子量复合物(c′)的形成，这种复合物中与HSA复合后的UK酶原可能含有未配对的半胱AA。从图10可看出，UK酶原二聚体恰好迁移在120KD复合物之前。
可测定未被结合的UK酶原不能与HSA一起用CBS亲和层析方法纯化(用0.5M NaCl充分冲洗柱)。将UK酶原(5μg/ml)加入到血浆中立即进行CBS亲和层析实验结果证明了上述结论。在这些条件下，洗脱出的HSA在酶谱上不显示可测定的溶解血纤维旦白活性(如图18中的2所示)游离的UK酶原逐渐被0.5M NaCl冲洗掉。相反，如果将血浆与UK酶原(5μg/ml)在37℃预培养20hr，以形成复合物，经CBS纯化的HSA的酶谱上显示出与之相关的溶解血纤维旦白活性。从这种HSA酶谱上可看到，具有120KD和55KD的两条迁移谱带(如图18中的1所示)。由于游离UK酶原不能进行共纯化，因此55KD带有可能是样品制剂保存在SDS中，HSA复合物分解而产生的UK酶原的谱带。
为测定血浆本身含有的UK酶原能否与HSA形成同样的复合物，通过CBS层析方法(用0.5M NaCl充分洗涤层析柱)将约600mg的HSA从新鲜血浆中纯化。纯化后的HSA用葡萄球菌旦白A UK抗抗体吸附剂处理(如前面图中6-9所示)，然后用以识别复合物中的UK酶原。产生的免疫沉淀在SDS样品缓冲液中煮沸以分解抗原-抗体复合物。这些条件也引起UK酶原HSA复合物分解。随后得到的酶谱出现了55KD裂解带，暗示在HSA试剂中存在有UK酶原(图18中的3所示)。由于游离的UK酶原不能用CBS亲和层析方法纯化，上述结果也证明在CBS柱上从血浆中分离出的UK酶原已经与HSA形成结合物。因此，在正常血浆中发现的结果和在富含UK酶原的血浆培养6hr或6hr以上后观察到的结果相一致。从CBS亲和层析方法分离出的UK是一种UK抑制剂复合物，而不是UK酶原HSA复合物的可能性几乎是不存在的，因为UK形成的抑制剂结合物在100℃的SDS中是稳定的(Kruithof，Blood，64∶907-913(1984);Cieplak et al.，Thrombos.Haemostas.，53∶36-44(1985);Stump et al.，J.Biol.Chem.，261∶12834-12841(1986))，从而在SDS-PAGE 后迁移的分子量≥95KD。
为了测定血浆本身含有的UK酶原(以复合物形式存在)的含量，将20ml新鲜血浆(含20KIU/ml aprotinin)通过Sephadex G-75柱过滤。使血浆旦白分解为两个主峰值(见图19A)。在凝胶过滤前以富含UK酶原的血浆样品校对过滤柱，37℃预培养20hr以形成复合物然后测定游离UK酶原和UK酶原HSA复合物的位置。在血纤维旦白平板上测定收集到流出物的溶解血纤维旦白的活性(如图19A所示)。在相应于D区域的112-119号流出物中发现有游离UK酶原存在，在对应于B区域的95-100号流出物中发现有UK酶原HSA复合物存在。
此后，正常血浆用上面所说的Sephadex G-75柱凝胶过滤进行分析。血浆本身的溶解血纤维旦白活性可通过免疫沉淀和酶谱分析测定。流出物被分成四批贮存如图19A所示。图19B表示能测定的溶解血纤维旦白的活性主要存在于相应于具高分子量的流出部分的B贮存部分中。在这些分子中含有洗脱出的UK酶原复合物(图19A)。在具更高分子量的A贮存部分中也发现存在有少量UK活性(如图19B)。用UK酶原与纯化的HSA培养的某些实验中也会形成高分子量的UK酶原HSA复合物(如图10)，可推断复合物中含有多于1分子的HSA或UK酶原。在相当于游离UK酶原分子量的D贮存部分没有UK活性。因此，在血浆中测得的所有UK活性者是以复合物形式存在的。由于在SDS中制备样品时，复合物发生分解产生了在酶谱上看到分子量约为55KD的酶带(如图19B的酶谱)。因此观察到的复合物不是一种UK抑制剂复合物。这种发现暗示正常血浆自身所含UK酶原的大部分是以相当于由UK酶原与HSA形成复合物的形式存在的。
假定肝脏中UK酶原分子的UK受体识别位点掩蔽在本发明所述的复合物内，因此，结合态的UK酶原的半衰期长(几小时-几天)。相应的游离UK酶原半衰期只有5-8分钟。复合物中的UK酶原的溶解血纤维旦白的特性不受损失，UK酶原白蛋白复合物有希望成为治疗上更合适的溶解血栓药物。本发明应从实质上减少UK酶原的剂量，不需要不断的注射，从而促进了治疗速度。
本发明所述的UK酶原白蛋白复合物与其他血纤维旦白酶原激活剂如t-PA，UK，和UK酶原可用于治疗相同的症状。目的是溶解血管内的血凝块(血栓)。现代的临床病症包括心肌梗塞、深静脉血栓形成，肺栓塞。本发明所述的复合物与合适的生物学载体基质如盐水相混合，通过静脉内注射引入体内。复合物与t-PA，或与UK酶原具协同效应的物质混合后更具优点。这种混和物也可通过简单的静脉内注射引入体内，简化了治疗程序，且可以携带到家里。t-PA启动溶解反应且很快清除，由作用时间长的UK酶原完成溶解过程。
另外，本发明的复合物能用于提高血液本身的溶解血纤维旦白的活性，从而可用于长期抑制与溶解血纤维旦白活性降低有关的心血管疾病。长期以来，人们认为血栓形成是导致动脉粥样硬化病变的致病因素。利用本发明所述的复合物以每周或每月进行周期性静脉内注射可抑制动脉粥样硬化。
最后，具酶解活性的HMW-UK和白蛋白的复合物形式也有一定的临床使用价值，因为HMW-UK是UK酶原的酶活性形式。它能与几种血浆抑制剂反应。因此只有在这些抑制剂被消耗后，才能延长这种复合物的半衰期，因此这种复合物由于具有更长的半衰期从而比HMW或LMW-UK具有优点，由于半衰期长，降低了费用，简化了治疗程序。
实施例1用于血栓应急治疗的静脉内注射方法，将5-20mg冻干的UK酶原白蛋白复合物与盐水混和，使之进入注射器管腔内将丸剂注射到病人静脉内。
实施例2快速溶解冠状血栓的方法，将5-20mg冻干UK酶原白蛋白复合物溶于盐水中，与2mg UK一起注射。UK可加快溶解启动。由于复合物半衰期长，因而可抑制血栓的重新形成，又可完全溶解已形成的血栓。
实施例3治疗深血管血栓、肺血栓时，将5-20mg冻干UK酶原白蛋白复合物溶于盐水中，静脉注射，如果需要可重复注射，所用的几种注射剂量不会产生非特异性的血纤维旦白酶原的活化。
实施例4t-PA与冻干UK酶原白蛋白复合物组成的协同结合物通过静脉注射治疗血栓时，将5-20mg t-PA与5-20mg UK酶原白蛋白复合物混和，通过简单的静脉注射引入体内，t-PA将很快被清除，而复合物将留在血液循环中，以完全溶解血栓，抑制血栓再形成，不降低特效。
实施例5快速溶解冠状血栓的另一种方法，将约5-20mg冻干UK酶原白蛋白复合物与大约30mg/hr冻干t-PA溶于盐水中一起注射。
实施例6由于UK酶原白蛋白复合物具有特长的半衰期，因而可用于抑制血栓的形成。用于这种治疗时，只需使用小剂量，如每星期1-5mg。
实施例7活化的HMW-UK白蛋白复合物是HMW或LMW-UK的更经济的取代物。
实施例8治疗深血管血栓，大约5-20mg冻干UK酶原HSA复合物溶于盐水中，单独或与t-PA一起注入体内。
实施例9对反复无常的心绞病或即将发生的心肌梗塞的治疗，用5-10mg UK酶原HSA复合物丸药静脉注射。用于这方面治疗时，具有长半衰期的血纤维旦白激活剂特别有用，因为它在临床使用时能维持几天。
实施例10用另外的血纤维溶酶旦白酶原激活剂在percutaneous transluminal血管成形术的或急性的溶解血栓的治疗之后以预防血栓的再形成。只需相对低剂量本发明所述的UK酶原HSA复合物就足够了。例小于10mg。
实施例11用于血纤维旦白溶解活性受抑制而产生的心血管病变的预防。利用该复合物周期性地注射可提高溶解血纤维旦白活性。例如每月注射1-5mg UK酶原与HSA的复合物。
权利要求
1.一种纯化的血纤维旦白溶酶原激活复合物，其特征在于由纯尿激酶原通过一个二硫键与人血清白蛋白共价结合产生的。该二硫键是由所说的UK酶原的一个AA残基的一个S原子与所说的人血清白蛋白的一个AA残基的一个S原子形成的。
2.根据权利要求1所说的激活复合物，其中所说的二硫键连接是在所说的人血清白蛋白的一个半胱AA残基和所说的UK酶原的一个胱AA残基之间形成。
3.根据权利要求1所说的激活复合物，其中所说的UK酶原的胱AA残基是在A链UK酶原的氨基末端。
4.根据权利要求1所说的激活复合物，其中所说的二硫键连接形成是在旦白质二硫同分异构酶(PDI)存在时发生。
5.根据权利要求1所说的激活复合物，其中所说的复合物是指与(存在于健康人体血液中)UK酶原和人血清白蛋白形成的复合物具相同的分子结构的复合物。
6.根据权利要求2所说的激活复合物，其中所说的二硫键连接是与人血清白蛋白相同半胱AA残基和UK酶原相同胱AA残基之间形成的，如在健康人体血液中的UK酶原HSA复合物中形成的二硫键。
7.根据权利要求1或6所述的激活复合物，其中所说的UK酶原是指重组产生的UK酶原。
8.根据权利要求1所述的激活复合物，其中所述的UK酶原和人血清白蛋白是重组产生的。
9.根据权利要求1所述的激活复合物，其中所说的UK酶原是具溶解血纤维旦白活性的UK酶原片段，在UK酶原肽链氨基末端的11，31，33，39，51，53或63位任一氨基酸含有一个半胱AA残基。
10.根据权利要求1所说的激活复合物，其中所说的UK酶原是指具溶解血纤维旦白活性的尿激酶酶原形式，含有相当尿激酶的第1-45位氨基酸残基的一条AA链。
11.权利要求1所述激活复合物组成治疗组合物，特征是与一种药理学上可接受的载体基质相混和。
12.溶解病人体内血栓的治疗方法，包括将一定的溶解血栓剂量的权利要求11所说的药剂组合物引入病人体内。
13.病人体内心血管病变如粥样动脉硬化症的治疗或预防方法，包括将一定剂量的权利要求11所说的药剂组合物引入病人体内，使病人体内溶解血纤维旦白活性水平有足够的提高。
14.制备权利要求1所说的溶血栓激活剂复合物的方法，包括在合适的条件下培养纯人血清白蛋白和纯尿激酶，给以足够时间形成所说的复合物。
15.根据权利要求14的方法，其特征进一步包括以二硫苏糖醇预处理人血清白蛋白，使之恢复硫醇形式。
16.根据权利要求14或15的方法，其特征还包括在培养过程中加入旦白质二硫同分异构酶。
全文摘要
一种尿激酶酶原复合物，由尿激酶酶原通过一个二硫键与人血清白蛋白共价连接形成，该复合物激活血纤维蛋白溶酶原溶解血纤维蛋白该复合物在血浆中半衰期比UK酶原本身更长。
文档编号A61P7/02GK1049865SQ90103940
公开日1991年3月13日 申请日期1990年4月13日 优先权日1989年4月13日
发明者维克托·古列维奇, 杰罗米·布雷顿 申请人:血管实验室有限公司