一种选择性地提高生产卤代酸脱卤酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，主要涉及一种选择性地提高假单胞菌生产 L-2-卤代酸脱卤酶的方法。
【背景技术】
[0002] L-2-卤代酸脱齒酶（L-2-haloacid dehalogenase, L-DEX)是可以催化 L-2-齒 代物中碳-卤键（C-X)断裂形成相应的D-2-羟基化合物的一类酶，产生该酶的微生 物可以卤化物为唯一碳源进行生长。L-DEX具有广泛的底物，不仅能催化L-2-卤代酸 的水解，还可降解单卤代酸及选择性地降解消旋卤代酸中的L-卤代酸，因此在生物降 解有机卤代物（参考文献：[1]MM. HSggb丨〇m，YB. Ahn, DE Fennell, LJ Kerkhof, et al. Anaerobic dehalogenation of organohalide contaminants in the marine environment [M] · 2003, 53:61-84.)、生物催化制备手性物质（参考文献：[2]M Bertau. Novel unusual microbial dehalogenation during enantioselective reduction of ethyl4,4,4-trifluoro acetoacetate with baker's yeast[J]. Tetrahedron Letters. 2001，42 (7) : 1267-1268.)以及环境中卤代物的在线检测方面有较大的研究与应 用价值。
[0003] 1948 年 Heppel 等（参考文献：[3] L Heppel and V Porterfield. Enzymatic dehalogenation of certain brominated and chlorinatedcompounds[J]. Journal of Biological Chemistry.l948，176(2):763-769.)首先描述了由微生物产生的能使 二氯甲烷水解为甲醛的脱卤酶（命名为烷基脱卤酶EC 3.8. 1. 1)，此后不同类型的脱 卤酶相继被发现。80年代后期，人们开始从多种环境中筛选得到大量的2-卤代酸脱 齒微生物（参考文献：[4] S Fetzner and F Lingens. Bacterial dehalogenases-bi ochemistry, genetics, and biotechnological applications[J]. Microbiological Reviews. 1994, 58(4):641-685. ) 〇 如 Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Rhizobium 等。已报道的产脱卤酶微生物可以产生DL-2-卤代酸脱卤酶，D-2-卤代酸脱卤酶（参考 文献：[5] CJ Lin, LR Yang, G Xu and JP Wu. Enhancement of haloacetate dehalogenase production by strain mutation and condition optimization[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2011，16(5) :923-929.)和 L-2-卤代酸脱卤酶三者中的一种， 很少有同时产生D-2-卤代酸脱卤酶和L-2-卤代酸脱卤酶的微生物。繁茂膜海绵共附生假 单胞菌DEH138是同时产生可诱导的D-和L-脱卤酶的海洋微生物。L-2-卤代酸脱卤酶可 以专一性地作用于L-2-卤代酸产生相应的D-2-羟基酸，D-2-卤代酸脱卤酶则专一性地 作用于D-2-卤代酸产生相应的L-2-羟基酸。尽管L-2-卤代酸脱卤酶在自然界中广泛存 在，但是在野生型脱卤酶产生菌中，脱卤酶的产量、活性及选择性比较低。虽已有文献报道 使用辅助碳源与诱导物来提高脱卤酶产量（参考文献：[5] CJ Lin，LR Yang，G Xu and JP Wu.Enhancement of haloacetate dehalogenase production by strain mutation and condition optimization[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2011, 16(5): 923-929.)〇
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的问题是改变现有野生型脱卤酶产生菌所产产量不高的问题，提 供一种选择性地提高海洋假单胞菌发酵生产L-2-卤代酸脱卤酶的方法，该方法选择性使 L-DEX的产量提高了 4. 7倍，D-DEX产量则保持稳定。
[0005] 本发明方法中使用的培养基为无机盐基础培养基，组成为Na2HP04 · 12H20(12g/ L)，NaH2P04.2H20(lg/L)，NaCl(30g/L)，酵母浸粉（0.1g/L)，（NH 4)2S04(2.0g/ L)，MgS04 · 7H20(0. lg/L)，调pH至7. 0~7. 5。2-氯丙酸固体培养基是在无机盐基础培养 基中加入0. 04g/L溴百里酚蓝（作为pH指示剂），18g/L琼脂，终浓度8~20mmol/L的 2_氯丙酸，将种子液（0D6。。为0.4~0.6)按1:100-1:10(体积比）的比例接种于不同碳源 培养基，在25~45°C培养16~50h。
[0006] 本发明方法中使用的辅助碳源包括羟基乙酸、乳酸与葡萄糖，浓度为10~30mM， 使用前相应的酸需用NaOH中和至pH7. 0~7. 5。
[0007] 本发明方法中诱导物有单氯乙酸、单碘乙酸、2-氟丙酸、2-氯丙酸、2-溴丙酸、 3_氯丙酸、2-氯丁酸、2-溴丁酸、2-氯丙酰胺与2-溴丙酰胺，浓度为2~20mM，使用前相应 的酸需用NaOH中和至ρΗ7· 0~L 5。
[0008] 本发明方法中培养方式有两段法与同步法。两段法是将DEH138在辅助碳源培养 基中培养10~40h，再加入诱导物诱导10~40h (对数生长期）；同步法则是将辅助碳源与 诱导物同时加入培养相同时间20~80h。
[0009] 本发明方法中将不同的辅助碳源与诱导物进行组合培养DEH138,对酶产量进行分 析，获得最佳组合后，进行辅助碳源与诱导物浓度及培养时间的优化。
[0010] 本发明方法中，获得了最佳辅助碳源与诱导物的组合与培养方式，优化辅助碳源 浓度为10~30mM，培养时间为10~60h。 toon] 本发明方法中，获得了最佳辅助碳源与诱导物的组合下的辅助碳源浓度，优化诱 导物浓度为2~20mM，培养时间为20~100h。
[0012] 本发明方法的优点：第一次报道了将辅助碳源与诱导物组合通过两段法与同步法 来选择性地提高卤代酸脱卤酶的产量，避免了分子生物学方法克隆表达酶的不确定性，通 过优化选择性地将L-DEX产量提高了 4. 7倍，D-DEX产量保持稳定。
[0013] 海洋假单胞菌DEH138 (Pseudomonas sp.DHll38,保藏于中国工业微生物菌种 保藏管理中心，编号为CICC10431);公开信息（参考文献：[6]王亚月，信艳娟，张 锦友等.底物诱导海洋假单胞菌DEH138A产生脱卤酶的研究[J].大连海洋大学学 报· 2014, 29(4) :381-385.)。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，但不限于这些实施例。
[0015] 实施例1
[0016] 种子液制备：
[0017] (1)本发明中所使用的繁茂膜海绵共附生假单胞菌DEH138 (Pseudomonas sp. DEH138)，菌种在中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC10431。
[0018] (2)无机盐基础培养基配制：Na2HP04 · 12H20(12g/L)，NaH2P04 · 2H20(lg/ L)，NaCl(30g/L)，酵母浸粉（0· lg/L)，（NH4)2S04(2.0g/L)，MgS04*7H 20(0. lg/L)，余量为水， 调pH至7· 0~7· 5。
[0019] ⑶2-氯丙酸固体培养基：在无机盐基础培养基中加入0. 04g/L溴百里酚蓝（作 为pH指示剂），终浓度18g/L琼脂，终浓度8-20mmol/L的2-氯丙酸。
[0020] (4)2-氯丙酸液体培养基：在无机盐基础培养基中加入终浓度8-20mmol/L的 氯丙酸。
[0021] (5)2216E 培养基：5. Og/L、酵母浸粉 1. 0g/L、FeC130. lg/L、NaCl 30g/L，加去离子 水至 1L, lmol/L NaOH 溶液调 pH 至 7. 0 ~7. 5, 1 X 105Pa 高压灭菌 20min。
[0022] (6)菌种的活化：以8~20mM 2-氯丙酸为碳源的固体培养基（2-氯丙酸固体培养 基）复苏DEH138,经2216E液体培养基活化后，于2-氯丙酸为唯一碳源的液体培养基（2-氯 丙酸液体培养基）中培养，培养温度25-45°C，摇床转速200~230rpm，培养40-50h至0D 6。。 为 0· 4 ~0· 6〇
[0023] 实施例2
[0024] 辅助碳源与诱导物种类及培养方式对脱卤酶产量的影响：
[0025] (1)本实施例中的对照是正常培养条件下（2-氯丙酸为唯一碳源（2-氯丙酸液体 培养基）培养DEH13840~50h，0D600nm达到0. 4~0. 6)获得的L-DEX与D-DEX的产量， 分别为2. 46U与0. 21U。
[0026] (2)以10mM羟基乙酸、乳酸、羟基丁酸或葡萄糖为唯一碳源（分别替代2-氯丙酸 液体培养基中的2-氯丙酸）培养DEH138,获得的菌体无脱卤酶活性。
[0027] (3)以10mM的碘乙酸、2-氟丙酸、3-氯丙酸、2-氯丁酸、2-溴丁酸、2, 2-二氯丙酸、 2_氯丙酰胺或2-溴丙酰胺为唯一碳源（分别替代2-氯丙酸液体培养基中的2-氯丙酸） 培养DEH138,菌株无法正常生长。
[0028] (4)以30mM(在无机盐基础培养基中加入的终浓度）葡萄糖为辅助碳源，以 10mM(在无机盐基础培养基中加入的终浓度）碘乙酸、2-氟丙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、 2_氯丁酸、2-溴丁酸、2, 2-二氯丙酸、2-氯丙酰胺或2-溴丙酰胺两段法（每段时间36h) 培养DEH138。只有诱导物为2-氯丙酸、3-氯丙酸、2-氯丁酸或2-溴丁酸时，获得的菌体才 表现出脱卤酶活性，L-DEX产量分别为5. 89U、4. 22U、2. 6