一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物细胞工程技术领域，尤其涉及一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞 系及其建立方法和应用。
【背景技术】
[0002] 口腔黏膜上皮细胞作为哺乳动物免疫系统的第一道防线，是细菌病毒感染宿主遇 到的最早的一类细胞。口腔黏膜上皮细胞能够像髓系细胞一样产生免疫反应，在识别微生 物抗原方面具有重要作用。口腔黏膜上皮细胞体外培养存在很大的困难，取材不易，费时费 力，传代次数有限，细胞稳定性、均一性很差，许多实验结果因细胞培养代数的不同而没有 可比性，极大地限制了其研究和应用。因此，建立一株稳定的口腔黏膜上皮细胞系，为相关 疾病致病机理及疫苗等的研究提供良好的细胞模型，具有重大的意义。西北农林科技大学 动物医学院张彦明教授领导的研究团队已经先后成功建立了永生化猪脐静脉血管内皮细 胞系、猪小肠黏膜上皮细胞系等，具有建立永生化细胞系的成熟技术。本发明创建了仔猪口 腔黏膜上皮细胞的分离与培养方法，并通过转染将真核表达质粒PCI-neo-hTERT导入原代 猪口腔黏膜上皮细胞，经过G418抗性筛选获得阳性克隆细胞，进一步筛选克隆化细胞，获得 永生化的仔猪口腔黏膜上皮细胞系，为研究口蹄疫病毒、猪水泡病病毒、猪繁殖与呼吸综合 征病毒的入侵、复制、致病等机理提供一个可供选择的细胞模型，并为相关病原疫苗的研发 提供了基础材料。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法，旨在 解决猪口腔黏膜上皮原代细胞体外培养传代次数有限，细胞稳定性、均一性差的问题。
[0004] 本发明是这样实现的，一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，所述永 生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法包括：
[0005] 原代培养仔猪口腔黏膜上皮细胞；
[0006] 将含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法导入原代培 养的仔猪口腔黏膜上皮细胞；
[0007] 转染细胞24h后给细胞换液，48h后加含500yg/mL G418的DMEM/F12培养基筛选；
[0008] 高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，转入另 外培养板培养；
[0009] 扩大培养:用含250yg/mL G418的培养基继续筛选培养一个月，得到抗G418稳转阳 性细胞；
[0010]筛选1个月后，培养基中不再添加 G418,继续培养超过50代次的细胞即是永生化的 细胞系，永生化的细胞与原代细胞形态一致。
[0011] 进一步，所述原代培养仔猪口腔黏膜上皮细胞具体包括：
[0012] 将未哺乳的仔猪麻醉后，心脏采血致死，酒精消毒，剪取面颊部位对应的口腔上皮 组织，无菌条件下ros(含600IU/ml双抗，5yg/mL的两性霉素 B)漂洗数遍，4°C浸泡30min，将 口腔上皮组织剪成< 1mm3的糜状，PBS漂洗3遍，1000r/min离心5min，接种于96孔培养板，静 置lOmin，加入原代培养用生长液，置于37°C、5%⑶ 2培养箱中进行培养，24h观察有无细菌 污染，每3d换一次液，每日观察细胞形态及生长情况，培养7~12d。
[0013]进一步，所述将pCI-neo-hTERT转染导入原代培养的仔猪口腔上皮细胞具体包括： [0014]转染前48h，0.25 %胰酶消化原代猪口腔黏膜上皮细胞并计数，以1 X 104个细胞/ 孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80%~90%的汇合度；
[0015] 用无血清Opti-mem培养液分别稀释2yL、4yL、6yL、8yL pCI-neo-hTERT质粒至体积 为50yL，使质粒浓度达到O.O1μg/μL~0.04yg/yL，轻轻混匀，室温作用5min;
[0016] 用无血清Opti-mem培养液稀释Lipofectamine 3000Transfection Reagent 4yL 至体积为50yL，轻轻混匀，室温作用5min;
[0017] 混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 3000，此时总体积为100yL，轻轻混勾， 室温作用20min;
[0018] 逐滴将所得混合物加入到不同孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔 未转染空白对照；
[0019] 于37°C、5%的C02培养箱中48h后，加入含500yg/mL G418的DMEM/F12培养基进行 筛选。
[0020] 进一步，所述真核表达质粒PCI-neo-hTERT转染细胞24h后给细胞换液，48h后加含 500yg/mL G418的DMEM/F12培养基筛选，从筛选第3天开始有细胞死亡，第14天时，未转染组 细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有少量细胞存活，将G418浓度降至250yg/mL维持筛 选，每日观察，5d后出现阳性细胞克隆。
[0021] 进一步，所述阳性克隆的方法有：
[0022] 套环法:用套环套住阳性克隆细胞，在套环内加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另 外一个新的培养孔中培养；
[0023] 刮除法:刮除阴性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；
[0024] 无限稀释法:将阳性细胞消化并计数，重新接种于96孔板，每孔1个细胞，继续培养 使其长成单细胞克隆。
[0025] 进一步，所述RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT的表达:根据GenBank中已发表 的hTERT的mRNA参考序列，采用Primer Premere5.0设计1对特异性检测引物;上下游引物分 别为P1:5' -GTATGCCGTGGTCCAGAAGG-3' ; P2:5' -CGTGGGTGAGGTGAGGTGTC-3'，扩增片段大小 为228bp;
[0026] 所述RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT的表达细胞总RNA的提取包括：
[0027] 转染细胞与原代细胞分别用0.25%胰酶消化后接种到6孔板中，待细胞铺满单层 后取出，用灭菌PBS洗2遍，弃去液体；
[0028] 加入lmL Trizol试剂，静置lmin分钟，用枪来回吹打，将细胞裂解液吸到DEPC水处 理过的1.5mL灭菌EP管中，静置5min;
[0029] 加入0.2mL氯仿，充分振荡混匀，室温静置5min;
[0030] 4°C、12000r/min 离心 15min;
[0031] 吸取上清500yL转移入另一新的DEPC水处理过的1.5mL灭菌EP管，加入500yL预冷 的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min;
[0032] 4°C、12000r/min 离心 lOmin;
[0033] 弃上清，加入lmL 75%乙醇，颠倒几次，4°C、12000r/min离心10min;
[0034] 弃上清，倒置EP管，室温干燥RNA沉淀5~lOmin;
[0035] 加入20yL RNAase-free水溶解RNA，置-70°C保存或直接用于反转录；
[0036]所述RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT的表达的PCR反应及电泳包括：
[0037] 采用20yL反应体系：上下游引物各lyL，2 X Taq酶Mix混合液10yL，模板cDNA 2yL， 最后用水补足20yL，混匀后置于PCR扩增仪中；
[0038] 反应程序：94°C4min; 94°C30s，58°C30s，72°C30s，32 个循环；72°C lOmin。扩增完成 后，PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳。
[0039] 本发明提供的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用，与现有技术 先比，具有以下优势：
[0040] 1.本发明的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系，其细胞形态与原代细胞一致，形态 均一，边界明显，解决了原代猪口腔黏膜上皮细胞培养难的问题。
[0041 ] 2.本发明的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系仍然保持了正常口腔黏膜上皮细胞 的基本生物学特性，表达上皮细胞特异性蛋白。为研究口蹄疫病毒、猪水泡病病毒、猪繁殖 与呼吸综合征病毒的入侵、复制、致病等机理提供一个可供选择的细胞模型，并为相关病原 疫苗的研发提供了基础材料。
【附图说明】
[0042] 图1是本发明实施例提供的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用
[0043] 图2是本发明实施例提供的组织块法培养的原代仔猪口腔黏膜上皮细胞示意图。
[0044] 图3是本发明实施例提供的G418筛选的阳性细胞克隆示意图。
[0045] 图4是本发明实施例提供的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系第100代示意图。
[0046] 图5是本发明实施例提供的特异性检测第10代、25代、50代、65代、80代永生化仔猪 口腔黏膜上皮细胞中hTERT基因的表达示意图。
[0047] 图6是本发明实施例提供的间接免疫荧光鉴定永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞中角 蛋白的表达不意图。
[0048]图7是本发明实施例提供的第80代永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞致瘤试验图。
[0049] 图8是本发明实施例提供的Hela细胞致瘤试验图。
[0050] 图9是本发明实施例提供的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞第85代细胞生长曲线示 意图。
【具体实施方式】
[0051] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0052] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。