检测先天性角化不良症WRAP53基因的方法和引物与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与先天性角化不良症有关的基因突变的引物和方法。

背景技术：

先天性角化不良症(dskeratosiseongenita，DC)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的DC患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起DC的突变基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为X-连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。X-连锁隐性遗传包括DKC1，常染色体显性遗传包括TERC及TINF2，常染色体隐性遗传包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有TERT。

端粒酶卡扎尔体蛋白1(telomerase cajal body protein 1，TCAB1又名WRAP53、WDR79)是2009年新发现的端粒酶关键核心蛋白组分，其主要存在于卡扎尔体蛋白中。WRAP53基因定位于染色体17p13上，共有10个外显子，与P53基因重叠，是P53的反义转录基因，它不仅能调节p53基因的表达还能调节端粒的合成。WRAP53表达的缺失不会影响端粒酶活性及TERC水平，但可在细胞的S期阻止端粒酶与端粒结合，最终导致端粒变短。Zhong等发现WRAP53的突变阻止了端粒酶定位于卡扎尔体蛋白，导致了先天性角化不良症的发生。近年来，通过全基因组测序，发现WRAP53基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见。目前文献报道在两个先天性角化不良症的家族中发现WRAP53基因存在4个突变点，分别为F164L(第2外显子)、H376Y(第7外显子)、R398W(第8外显子)、G435R(第9外显子)。目前国内文献报道的DC病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行WRAP53基因进行全外显子突变筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测遗传性WRAP53基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测先天性角化不良症患者体内WRAP53基因多态位点的突变情况。所述检测WRAP53基因多态热点突变情况的引物，包括：

扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

进一步地，引物序列WRAP53-Exon1A-F、WRAP53-Exon1A-R、WRAP53-Exon1B-F、WRAP53-Exon1B-R、WRAP53-Exon1C-R以及WRAP53-Exon1C-F是扩增WRAP53基因第1外显子序列的引物，引物序列WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R是扩增WRAP53基因第2外显子序列的引物，以此类推，引物序列WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R是扩增WRAP53基因第10外显子序列的引物。

本发明还提供了检测WRAP53基因全外显子突变情况的方法，包括以下步骤：

1.抽提外周血中的基因组DNA；

2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

3.对步骤2中的扩增产物进行测序；

4.对测序结果进行判断，确定WRAP53基因是否发生突变；

其中PCR扩增引物为：

扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

本发明还提供了一种检测WRAP53基因多态突变位点的试剂盒，包括：

(i)全血基因组DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中PCR扩增反应液引物为：

扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

进一步地，测序引物碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

有益效果：本发明设计了扩增WRAP5310个外显子序列的引物。通过加接头，使所有13对引物的PCR产物均可以用一种测序引物进行测序。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。WRAP53基因的突变类型种类多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述WRAP53全部外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。本发明的13对引物涵盖了WRAP53基因全部外显子区域，使得后续测序时的上下游引物均能测出目的片段，一定程度上保证了测序的准确性。

附图说明

图1为WRAP53基因在染色体上定位图。

图2和图3为WRAP53基因经13对引物扩增后所得产物的电泳图谱，每对引物的扩增均设有一个重复，M为Marker DL 2000，如图2和图3所示，引物扩增有效，且条带单一。

图4为样本4WRAP53基因第2号外显子引物扩增后的产物正反向测序图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测WRAP53基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对WRAP53全外显子设计的扩增引物，包括：

扩增WRAP53基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

一种检测WRAP53基因多态突变位点的试剂盒，包括

(i)全血基因组DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，外周血基因组DNA提取所用试剂盒由天根生物科技有限公司提供。

检测体系PCR扩增反应液包括：

测序体系试剂包括：

实施例2

血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)全血基因组DNA提取

1)于1.5ml离心管底部加入20μl QIAGEN Protease(或proteinase K)。.

2)离心管中加入200μl血浆。

3)加入200μl Buffer AL，振荡15s。(注意：不可将QIAGEN Protease或proteinase K直接加入到Buffer AL中。若样本量较大，则QIAGEN Protease和Buffer AL按比例增加。)

4)56℃水浴10min，之后短暂离心，以除去离心管盖内沿的液体。

5)加入200μl乙醇(96％-100％)，振荡15s，短暂离心，以去除离心管盖内沿液体。

6)小心将以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp微型离心柱中(不要润湿离心柱边缘)将离心柱放入2ml收集管中，盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心柱取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。

7)小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp微型离心柱中(不要润湿离心柱边缘)。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心柱取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。

8)小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp微型离心柱中(不要润湿离心柱边缘)。盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min。

9)将QIAamp微型离心柱置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。全速离心1min。

10)将QIAamp微型离心柱置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。小心在QIAamp微型离心柱中加入100μl Buffer AE或蒸馏水。室温下(15-25℃)静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min。将收集管盖好，保存于-20℃。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：在分装好的PCR反应管中加入DNA，空白对照加等量生理盐水或不加任何物质。加样要求如下：

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。

如图2和图3所示，即为引物扩增后所得产物的电泳图谱。图2中1-A为WRAP53-Exon1A-F和WRAP53-Exon1A-R引物扩增后的片段Exon1A，1-B为WRAP53-Exon1B-F和WRAP53-Exon1B-R引物扩增后的片段Exon1B，1-C为WRAP53-Exon1C-F和WRAP53-Exon1C-R引物扩增后的片段Exon1C，2为WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R引物扩增后的片段Exon2，以此类推，图3中10为WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R引物扩增后的片段Exon10。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一。

(6)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15：l无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl l70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与WRAP53基因参考序列(Genbankaccn：AC_000184.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

为了验证引物和整个检测系统的可行性，取13例临床样本(每对引物设两个重复，每组按引物编号为1-13)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。取其中样本4加入引物扩增，电泳结果如图2和图3所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。测序结果如下表所示。

图4显示是样本4的WRAP53第2号外显子野生型正反测序截图，说明测序结果峰值清晰无杂峰和重峰等影响结果的干扰。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出WRAP53基因全部外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出WRAP53基因全外显子，通过结果表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出WRAP53基因所有外显子。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司

<120> 检测先天性角化不良症WRAP53基因的方法和引物

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtgg gaacgggaaa ccttctaa 38

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacagctatg accatggaca gcagtccgga gctaac 36

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtaaaacga cggccagtct aatctccgct gtgcttcc 38

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacagctatg accatgtctt ctgcaggaag gcttgt 36

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtaaaacga cggccagtgg gacccagttt ctctctcc 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacagctatg accatgctgg agaagtgggt ctcagg 36

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtaaaacga cggccagtgt ggagtctggg gagatgaa 38

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacagctatg accatggggc atccctctcc tagaaa 36

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtaaaacga cggccagtca gccctagccc tacacttg 38

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aacagctatg accatgtgct gccacaagaa attcac 36

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtaaaacga cggccagttc tgagctcacc cttgaaca 38

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aacagctatg accatgctga ccagcccctc tgataa 36

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtaaaacga cggccagtac acccagcctc atttttgt 38

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacagctatg accatgggaa ggaaagggct gaaaac 36

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgtaaaacga cggccagttc atatctggga cgcattca 38

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aacagctatg accatggtac agaggacggc gtgaac 36

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgtaaaacga cggccagtgc ttgtgacaga cagcatgg 38

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aacagctatg accatgtctc agggtgtgac ccctac 36

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgtaaaacga cggccagttc tgtatgcctg ggatgatg 38

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacagctatg accatgattg gtggtcacct ctcgac 36

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgtaaaacga cggccagtct gaaggagtgc ctggagac 38

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacagctatg accatgaccc tacagctggg ctctg 35

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgtaaaacga cggccagtcc tctgccagca aatctctc 38

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aacagctatg accatgtctc tgtgggctca ggaaac 36

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgtaaaacga cggccagtag agggagcaag tgtcctca 38

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aacagctatg accatggcct ggtttcagga ccaata 36

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aacagctatg accatg 16