本发明属于生物科学领域，涉及microRNA的检测。
背景技术：
：MicroRNA是长度为22～25个核苷酸的单链小RNA，其不编码蛋白，但可以通过抑制同源mRNA的表达或诱导其降解而对mRNA进行调控，从而影响相关蛋白的生成。MicroRNA种类很多，表达位置和用途各不相同。其中，microRNA-34a在脑、心肌、肺、肝脏、前列腺、神经组织中有广泛表达，能够与多种基因的mRNA非特异性结合，常被用于研究在肿瘤发生中以及各系统疾病的病理生理过程中所起的作用。例如，肝细胞癌(HCC)是一种恶性程度极高的癌症，在全球的发病率和病死率均非常高。对于该病的研究持续多年，目前的治疗方法也多种多样，但总体的预后依然很差，这是由于肝细胞癌的早期诊断方法以及结果敏感性有局限。基于前人的研究成果，发明人发现了HCC组织中microRNA-34a的表达水平明显低于正常组织和癌旁组织，在转移性癌组织中microRNA-34a的表达水平明显低于非转移性癌组织；它在HCC组织中的表达与肿瘤恶性程度、肿瘤个数、肿瘤体积、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期密切相关，与其它因素，如患者年龄、性别、肝功能、肿瘤部位等无相关性。同时，还发现microRNA-34a与其靶标Notch1在HCC及癌旁组织中均负相关(MicroRNA-34a、Notch1在肝细胞癌组织中的表达以及临床意义，于泳等，世界华人消化杂志，2014年第22卷第14期)。在上述的肝细胞癌中，microRNA-34a在病灶区和癌旁区的表达量会有所不同；而在另一些情况下，外周血中的microRNA-34a的表达量与一些疾病的发生有相关性。例如，已经发现，在风湿性关节炎、肺癌、阿尔茨海默症中，外周血的microRNA-34a的表达量发生变化。现有技术对于microRNA-34a的研究已经取得了很多有价值的结论，针对它的研究依然继续。本领域中依然有能够精确检测microRNA-34a的表达量的需要。技术实现要素：本发明针对microRNA-34a的PCR检测，提供一种能够有效扩增microRNA-34a的体系和方法。在第一个方面，本发明的microRNA-34a的检测体系包括逆转录反应体系和PCR扩增反应体系，其中，所述逆转录反应体系包括逆转录引物，所述PCR扩增反应体系包括PCR正向引物和PCR反向引物；其中，逆转录引物的序列为：GAGTTGACTGTCCTGGACTGGTGGTACGTCAACTCACAACCAGC(SEQIDNO:1)；PCR正向引物的序列为：CTGGTCCTGGCAGTGTCTTG(SEQIDNO:2)；PCR反向引物的序列为：ACTGTCCTGGACTGGTGG(SEQIDNO:3)。优选地，所述逆转录反应体系还包括逆转录酶、dNTP、逆转录缓冲液、MgCl2、RNA酶抑制剂、无RNA酶水。优选地，所述PCR反应体系还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP。进一步地，在第二个方面，本发明提供一种microRNA-34a的检测试剂盒，包括逆转录反应中使用的逆转录引物和PCR扩增反应中使用的PCR正向引物和PCR反向引物；逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，PCR正向引物的序列如SEQIDNO:2所示，PCR反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。优选地，所述检测试剂盒还包括逆转录反应和PCR扩增反应中所使用的其它试剂，如逆转录酶、逆转录缓冲液、MgCl2、RNA酶抑制剂、无RNA酶水、DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTP。在第三个方面，本发明提供检测microRNA-34a的方法，包括逆转录和PCR扩增两个步骤，其中，所述逆转录步骤使用的逆转录引物的序列如SEQIDNO:1所示，PCR扩增步骤使用的PCR正向引物的序列如SEQIDNO:2所示，所使用的PCR反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。优选地，所述逆转录步骤的反应条件为25℃5min，42℃60min，60℃15min；所述PCR步骤的反应条件为95℃1min，40个循环的95℃15s、58℃40s、72℃30s，72℃1min。本发明提供的逆转录引物、PCR正向引物和PCR反向引物能够有效结合和扩增microRNA-34a，检测多种组织或血液中microRNA-34a的量。相比于常规指导设计的引物，其扩增效率更高、更灵敏，特别适合microRNA-34a表达量低的情况的检测。附图说明图1：使用本发明的检测体系对正常肝细胞和肝细胞癌细胞的检测结果，其中1为正常肝细胞检测结果，2为肝细胞癌细胞的检测结果；图2：本发明的检测体系与常规检测体系的扩增结果比较，其中1为本发明的结果，2为常规检测体系的结果。具体实施方式下面将结合具体实施方式说明本发明，但本发明的内容不限于此。以下实施例中，如未明确说明，则所使用的方法均为本领域常规的方法，本领域技术人员根据现有技术完全可以知道如何实施所述方法并获得相应结果，所使用的试剂和仪器均为本领域常规试剂和仪器，可以通过常规的商业途径获得。根据NCBI查询的结果，人microRNA-34a的成熟体序列为uggcagugucuugcugguugu。实施例1：microRNA-34a的扩增1、miRNA的提取取正常肝细胞和肝细胞癌细胞(这两种细胞获取自本医院的患者，患者知情同意做科学研究)的组织匀浆液，采用天根生物科技有限公司的miRNA提取试剂盒，按照说明书要求提取样本中的miRNA：200μL样本加入等体积的裂解液震荡后静置5min，然后加入5μL外源性参照cel-mir-39，按照说明书进行操作，最后用30μL的去核酸水溶解miRNA。测定miRNA的浓度和纯度，以A260/A280在1.6～2.2之间，浓度为2～20ng/μL的miRNA为模板做逆转录实验，备用。2、逆转录将逆转录体系的各种试剂在室温下溶解，震荡混匀后置于冰上，并按照表1配制反应液。表1：逆转录反应体系组分每管体积(μL)miRNA模板2MMLV逆转录酶(200单位/μL)(promega公司)0.4MMLV10倍逆转录酶缓冲液(promega公司)4dNTP混合物(10mmol)1.6RNA酶抑制剂(40单位/μL)0.4MicroRNA-34a逆转录引物(SEQIDNO:1)(1μmol)1cel-mir-39逆转录引物(1μmol)1无核酸水补充到40其中，cel-mir-39逆转录引物序列为：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGATACGACCTGTTTCCT。两管的模板分别为正常肝细胞和肝细胞癌细胞的miRNA。将配好的反应体系充分混匀并将液体轻离心至反应管底部，置于PCR仪上进行反应。逆转录反应的条件为：25℃5min，42℃60min，60℃15min。反应结束后置于冰上。3、PCR扩增反应按照下表2配制PCR扩增体系：表2：PCR扩增体系其中，cel-mir-39的探针为JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP，正向引物为CAGAGTCACCGGGTGTAAAT，反向引物为CAGTGCGTGTCGTGGAGT；microRNA-34a的探针为MAR-TGCACTGGATACGACGCTGGT-MAR。将反应物混匀，在以下条件下进行反应：95℃1min，(95℃15s，58℃40s，72℃30s)40个循环，72℃1min。在AppliedBiosystems的实时荧光定量PCR仪上进行反应。对正常组织中获得的PCR结果进行测序。测序结果与预期结果一致。由图1的结果可见，本发明的检测体系能够扩增出microRNA-34a，在正常组织中的表达量高于肝细胞癌中的表达量，这与之前的研究结果一致，可见本发明的检测体系能够有效地反应出检测样本中的microRNA-34a的量。实施例2：不同扩增引物的检测结果本领域技术人员已知，PCR反应扩增的关键因素包括引物与模板的匹配度、引物的扩增效率、Taq酶的效率、缓冲液的质量等，其中引物与模板的匹配度和引物的扩增效率是设计引物时需要仔细分析、比较的方面，也是引物设计中最不容易预测效果的因素。通过软件，如Primer等设计的高得分引物序列并不一定比低得分的引物序列具有更好的效果。因此，引物设计包括很强的创造性工作。关于miRNA的反转录和扩增，本领域已经给出了很多引物设计思路，最常规的是使用茎环结构引物，但针对不同模板，茎环结构的序列以及与模板匹配的引物序列都会对扩增结果产生影响。取正常肝细胞，以本发明的检测体系和对照检测体系进行对比。其中，对照检测体系的microRNA-34a的逆转录引物和PCR正向及反向引物均根据现有技术的指导进行设计，具体为：逆转录引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACCAG；PCR正向引物：ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTGC；PCR反向引物：TGGTGTCGTGGAGTCG；探针为：MAR-TGCACTGGATACGACGTCTTG-MAR。以与实施例1相同的方法进行逆转录和PCR扩增反应。实验结果如图2所示。由结果可见，本发明的扩增体系能够更有效地扩增microRNA-34a，比对照检测体系更敏感，扩增效率更高，说明本发明的引物与模板的结合性更高，扩增能力更强，适用于microRNA-34a表达量减少，比如患有癌症的情况，从而可以更灵敏地检测出microRNA-34a的表达量是否发生变化。实施例3：外周血单个核细胞中micro-34a的检测取类风湿关节炎患者的外周血单个核细胞样品20份(以下称实验组)，健康对照人群的外周血单个核细胞样品10份(以下称对照组)，利用TRIzol法提取样品中的总RNA，按照表3分别配制逆转录反应体系。表3：逆转录反应体系将配好的反应体系充分混匀并将液体轻离心至反应管底部，置于PCR仪上进行反应。逆转录反应的条件为：25℃5min，42℃60min，60℃15min。反应结束后置于冰上。以该反应产物为模板，按照下表4配制PCR扩增体系：表4：PCR扩增体系组分体积(μL)dNTP混合液(10mmol)2MgCl2(25mmol)210倍Taq缓冲液(无Mg离子，TAKARA)2Taq(5单位/μL，TAKARA)0.2正向引物(SEQIDNO:2)(10μmol)0.4反向引物(SEQIDNO:3)(10μmol)0.4去核酸酶水补充到20将反应物混匀，在以下条件下进行反应：95℃1min，(95℃15s，58℃40s，72℃30s)40个循环，72℃1min。将得到的产物进行定量分析(以对照组中表达量最低的一个样品测量值为基准，对其它样品的测量值进行统一化表示)。对照组的结果分别为：1.00、1.22、1.07、1.46、1.23、1.52、1.18、1.05、1.33、1.29；实验组的结果分别为：5.32、1.87、6.09、3.26、3.85、2.74、1.96、4.26、2.48、6.65、4.37、3.80、4.48、1.44、2.51、2.24、5.08、4.68、3.97、3.53。由结果可以看出，对照的健康人群组中，microRNA-34a的表达量个体间差异不大，数值较低。而实验组中，个体间的表达量差异很大，有2个样品的检测值与对照组相差不大。将这些结果与已确定的诊断结果相对照，microRNA-34a的表达量与类风湿性关节炎的病程相符性达到75％。进一步说明本发明的引物和检测体系能够有效扩增microRNA-34a，对组织样品和外周血样品均有效。上述实施例仅用于表明本发明的引物和方法能够灵敏、高效地检测microRNA-34a，并不代表可以通过本发明的检测microRNA-34a的方法来判断疾病的存在或进程。本领域技术人员已知，疾病是通过一些标准指标表征的；而microRNA-34a在组织或血液中的变化仅是疾病的一个现象，不能作为诊断标准。序列表<110>中国人民解放军第四军医大学第一附属医院<120>MicroRNA-34a的检测体系和方法<130>Y161264-OI<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>microRNA-34a逆转录引物<400>1gagttgactgtcctggactggtggtacgtcaactcacaaccagc44<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>mircroRNA-34aPCR正向引物<400>2ctggtcctggcagtgtcttg20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>microRNA-34aPCR反向引物<400>3actgtcctggactggtgg18当前第1页1 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