沙门氏菌核酸快速检测试剂盒、试纸及检测方法与流程

本发明涉及核酸恒温扩增产物的快速检测方法，利用核酸薄膜层析检测试纸条检测目标序列，应用在食源性致病菌的检测过程中，具体涉及一种沙门氏菌解旋酶恒温扩增及核酸薄膜层析检测试纸条。

技术背景

分析以往发生的食品安全事件，细菌性污染引发的食物中毒情况发生频率高，影响程度大，涉及范围广。食源性致病菌导致人类及动物感染疾病的发病率仍居高不下，常见的病原体主要为沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等。沙门氏菌作为能够导致人畜共患病致病菌在自然界广泛存在，目前已经鉴定的沙门氏菌血清型有2500多种，其中致使食源性的沙门氏菌病发生主要的血清型为肠炎、鼠伤寒和猪霍乱沙门氏菌三种，菌体裂解后释放的内毒素侵袭肠道黏膜、神经及血管，引起头痛、呕吐、腹泻、发热等中毒症状。由此可见食品安全形势依然严峻，有效监控细菌性污染问题成为避免食品污染事件发生的主要解决途径。因此，快速、敏感、特异的检测方法对于临床诊断和保障食品安全是必不可少的。常规标准检测采取传统培养的方法，待测致病菌需按照规定的检测步骤单独进行检测，检测周期长，操作复杂，工作量大，检验人员需要具备专业经验，检测结果易受人为因素影响从而出现误判。

应用免疫学基本原理的检测方法主要依据其抗原与抗体的特异性免疫结合反应。通过微生物本身特异性抗原物质刺激生物体得到相应的特异性抗体。其中采用酶联免疫试剂盒及胶体金试纸条在检测食源性致病菌方面已发展成相当成熟的技术，涉及检测范围广泛。该类产品凭借其操作简便、方便快捷、价格低廉和结果准确等特点，已经逐步进入基层检测及医疗部门甚至被应用于普通家庭自主检测，给人们日常诊断疾病带来许多便利之处。然而免疫技术在目前研究阶段及实际应用中仍存在一些不足之处，主要原因在于单克隆抗体的制备程序繁琐，耗费大量人力及物质资源，由于多方面因素共同作用可能导致得到的抗体特异性并不理想，直接影响检测结果的特异性和灵敏度。在实际检测过程中时常发生假阳性或假阴性的报告，表现出该方法稳定性有待进一步提高。

近年来随着分子生物学的深入研究与快速发展，实际检验中细菌等病原体测定方法已经由传统的单一生化实验水平转移到分子生物学的方法如聚合酶链式反应(PCR)技术、基因芯片、探针杂交等技术。聚合酶链式反应通过特定引物有选择性的进行体外模拟细胞内部扩增DNA或RNA片段的方法，该DNA复制方法可以实现将极少量基因组中的特定基因片段在短暂几小时内呈现指数扩增，显著提高检测的灵敏度已成为目前研究水平上最灵敏的检测技术，具有精确度高和特异性强的优势，在微生物检测、感染性和遗传性疾病的诊断及基因突变的检测等诸多领域发挥重要作用。然而，PCR技术需要精确的热循环过程，局限于反应过程必需依赖精密仪器设备，因而限制了其在设施缺乏的现场检测和基层地区应用。

目前国内外核酸恒温扩增技术迅速发展，现已被广泛应用的有环介导恒温扩增、链替代扩增、滚环扩增、切口酶核酸恒温扩增、依赖解旋酶的恒温扩增等。其反应过程只需在恒定的温度下进行且能够实现DNA或RNA的特异性扩增，并且灵敏度能够达到PCR技术的检测水平。

发明专利“可避免假阴性的沙门氏菌恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法”(公开号CN105219870A)及“肠炎沙门氏菌的链置换恒温扩增(SDA)快速检测试剂盒及其检测方法”(公开号：CN102382884A)描述依据不同扩增原理均以恒温条件实现对沙门氏菌DNA核酸序列的扩增，但该类方法仍需结合凝胶电泳及成像系统对实验数据进行处理分析，没有明显简化检验操作步骤和无法在公共卫生突发事件中体现其优势。

在恒温扩增过程中利用分别修饰有特定标记物的上、下游引物将扩增产物中导入两种不同类型的核酸标记物能够被特异性结合的抗体或其配体捕获，检测原理依据近似双抗体夹心法胶体金免疫层析分析方法，该方法已应用在针对多种食源性致病菌及病毒基因的恒温扩增产物检测中，关于沙门氏菌的核酸检测，公开号为CN102329790A的发明专利“双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条”提供一种利用标记生物素和异硫氰酸荧光素的探针的方法对LAMP反应产物实现快速检测。但由于该扩增体系需要多条内外引物共同参与，难以避免形成引物二聚体等非特异性扩增产物的形成，故该类型扩增结果不适用于试纸条的检测。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用解旋酶恒温扩增检测具有危害性食源性致病菌-沙门氏菌(Salmonella)的快速检测技术，特别是一种快速、准确、灵敏的沙门氏菌核酸快速检测试剂盒、试纸及检测方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种沙门氏菌核酸快速检测试剂盒，包括正向引物invA-F:序列5’-ATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACC-3’,反向引物invA-R:序列：5’-ATGTAGAACGACCCCATAAACACCAA-3’，用地高辛和生物素分别标记上、下游引物的5’端，金标抗体，抗金标抗体种属的抗体，显色物生物素的配体物质。

而且，还包括扩增体系，所述扩增体系包括10×Annealing Buffer、dNTP、MgSO₄、NaCl、Enzyme Mix。

而且，所述金标抗体为地高辛和生物素。

而且，所述显色物生物素的配体物质链霉亲合素。

而且，所述金标抗体为鼠抗地高辛抗体，抗金标抗体为羊抗鼠二抗。

一种沙门氏菌核酸快速检测试纸，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫一端与金标垫一端端部重叠，金标垫另一端与硝酸纤维素膜端部重叠硝酸纤维素膜另一端部与吸水纸重叠，在硝酸纤维素膜间隔平行嵌装有检测线和质控线，检测线在金标垫一侧，质控线在检测线与吸水纸端部之间；

所述金标垫上喷涂金标抗体，检测线上包被显色物生物素的配体物质，质控线上包被抗金标抗体种属的抗体。

而且，所述金标垫上喷涂标抗地高辛抗体的胶体金，检测线上包被链霉亲合素，链霉亲合素浓度为2mg/mL，质控线上包被稀释80倍的羊抗鼠二抗。

而且，所述样品垫为玻璃纤维，各部分重叠部分为2-10mm，在检测试纸下部安装PVC背板。

而且，快速检测试纸使用上样展开液为添加0.1％BSA和0.1％Tween 20的PBS缓冲液pH 7.4。

一种沙门氏菌核酸快速检测方法，其包括如下步骤：

⑴将单克隆抗体如鼠抗地高辛抗体作为金标抗体吸附于显色物质胶体金颗粒上，形成稳定结构的结合体固定在金标垫上，金标垫就是一个玻璃纤维制成的垫；

⑵链霉亲和素作为标记物生物素的配体物质以线状形式包被在硝酸纤维素膜上形成检测线；

⑶选择抗金标抗体种属的抗体如羊抗鼠抗体同样以线状形式包被在质控线上结合过多的金标抗体；

⑷设计特异性恒温扩增的上游引物5’和下游引物5’上分别修饰抗原或半抗原物质如地高辛和生物素，当存在待测沙门核酸扩增产物时，在恒温条件下进行核酸的扩增反应得到同时连接两种标记物地高辛-目标片段-生物素的扩增产物；

⑸将步骤⑷产生的地高辛-目标片段-生物素首先与金标垫(玻璃纤维)上胶体金颗粒包被的地高辛抗体结合，形成地高辛抗体-地高辛-目标片段-生物素显色颗粒复合体；

⑹步骤⑸得到的显色颗粒复合物在上样缓冲液中通过毛细管作用沿纤维素膜向上移动至检测线被受体链霉亲合素捕获得到地高辛抗体-地高辛-目标片段-生物素-链霉亲合素复合体，在检测线上沉降形成肉眼可视的显色条带，且未结合扩增产物的胶体金颗粒上包被的金标抗体与质控线上的羊抗鼠抗体结合，出现两条显色条带即为阳性结果；

或者，当不存在沙门核酸扩增产物时，不发生上述步骤⑶-⑹，不能与金标垫(玻璃纤维)上胶体金颗粒包被的地高辛抗体结合，显色物质胶体金颗粒不能与检测线上包被的物质结合形成显色条带，质控线上的羊抗鼠抗体与胶体金颗粒上包被的金标抗体结合出现一条显色条带即为阴性结果。

本发明与其他技术相比具有以下优势：

本发明开发出以解旋酶恒温扩增技术并联合核酸薄膜层析检测试纸条检测沙门氏菌的一种更为高效的分子检测方法，引物的设计选择最适扩增片段位置及长度能够有效避免非特异性扩增的形成，并优化得到最佳展开缓冲液使核酸试纸条达到最理想的显色效果。该检测方法不会污染实验室和周围环境且不需要昂贵的仪器设备或专业操作技能，从而可以在实验条件不完善的情况下应对大规模样品的检测，具体有点体现在以下几个方面：

1、本发明所述的检测沙门氏菌解旋酶恒温扩增产物的核酸薄膜层析检测试纸条的特异性强，灵敏度高，操作简便，稳定性强；

2、扩增过程在封闭的反应体系中进行有效的避免扩增产物的污染；

3、反应速度快，完成样品的全部检测步骤只需1小时左右；

4、检测过程不需要复杂昂贵的仪器设备及专业技术人员操作；

5、适应于食品致病菌的现场快速检测的初步判断。

附图说明

图1为沙门氏菌引物特异性验证。图中M：DNA分子量标记DL2000；1：空白对照；2：肠炎沙门氏菌；3：甲型副伤寒沙门氏菌；4：肠沙门氏菌肠亚种；5：猪霍乱沙门氏菌；6：肠沙门氏菌肠亚种伤寒血清型；7：大肠杆菌O157:H7；8：大肠杆菌(非O157:H7)；9：宋内氏志贺氏菌；10：福氏志贺氏菌；11：产气肠杆菌；12：单增李斯特菌；13：金黄色葡萄球菌；14：空肠弯曲杆菌。

图2为核酸薄膜层析检测试纸条结构。图中1：样品垫；2：硝酸纤维素膜；3：背板；4：金标垫(玻璃纤维)；5：检测线；6：质控线；7：吸水纸。

图3为沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条特异性验证。图中1：肠炎沙门氏菌；2：甲型副伤寒沙门氏菌；3：肠沙门氏菌肠亚种；4：猪霍乱沙门氏菌；5：肠沙门氏菌肠亚种伤寒血清型；6：大肠杆菌O157:H7；7：大肠杆菌(非O157:H7)；8：宋内氏志贺氏菌；9：福氏志贺氏菌；10：产气肠杆菌；11：单增李斯特菌；12：金黄色葡萄球菌；13：空肠弯曲杆菌。

具体的实施方式

为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明结合解旋酶恒温扩增技术和核酸薄膜层析检测技术，建立沙门氏菌核酸快速检测的方法。本发明旨在利用核酸薄膜层析检测试纸条检测的解旋酶恒温扩增产物，从而实现核酸的快速检测。设计分别标记生物素和地高辛的沙门氏菌的特异性引物，目标核酸经过解旋酶恒温扩增形成修饰有两种标记物的扩增产物，该扩增产物能够被包被有特异性识别的配体和抗体核酸薄膜层析检测试纸条检出。应用抗原或半抗原生物小分子标记的核酸分子能够被其特异性的抗体或配体识别免疫学检测原理实现对目标核酸的检测。常用的核酸标记物中生物素能够特异性结合其配体链霉亲合素，而地高辛易于获得其特异性抗体。因此选择上述两种物质作为引物标记物。

1、本发明提供两条沙门氏菌的特异性扩增引物，选择沙门氏菌特异性invA基因设计正向引物invA-F:序列5’-ATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACC-3’,反向引物invA-R:序列：5’-ATGTAGAACGACCCCATAAACACCAA-3’，地高辛和生物素分别标记上、下游引物的5’端，当目标核酸存在时，经过解旋酶恒温扩增能够得到大小为101bp的DNA片段；若没有目标核酸存在时，则无扩增产物形成，如图1所示。

2、本发明提供沙门氏菌的解旋酶恒温扩增方法：沙门氏菌的解旋酶恒温扩增反应体系包括正向、反向引物(75nM)、10×Annealing Buffer(7μL)、dNTP(3.5μL)、MgSO₄(2μL)、NaCl(4μL)、Enzyme Mix(3.5μL)，用无菌超纯水补充到50μL。将提取得到的1μL沙门氏菌DNA作为阳性对照的模板，等量的无菌超纯水作为阴性对照加入含有沙门氏菌解旋酶恒温扩增反应液的PCR管中，将上述反应体系置于68℃下反应90min进行沙门氏菌的恒温扩增。

3、本发明提供的沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条的检测方法，其包括如下步骤(原理如图2所示)：

⑴将单克隆抗体如鼠抗地高辛抗体作为金标抗体吸附于显色物质胶体金颗粒上，形成稳定结构的结合体固定在金标垫(就是一个玻璃纤维垫)上。

⑵链霉亲和素作为标记物生物素的配体物质以线状形式包被在硝酸纤维素膜上形成检测线。

⑶选择抗金标抗体种属的抗体如羊抗鼠抗体同样以线状形式包被在质控线上结合过多的金标抗体。

⑷设计特异性恒温扩增的上游引物5’和下游引物5’上分别修饰抗原或半抗原物质如地高辛和生物素，当存在待测沙门核酸扩增产物时，在恒温条件下进行核酸的扩增反应得到同时连接两种标记物地高辛-目标片段-生物素的扩增产物。

⑸将步骤⑷产生的地高辛-目标片段-生物素首先与金标垫(玻璃纤维)上胶体金颗粒包被的地高辛抗体结合，形成地高辛抗体-地高辛-目标片段-生物素显色颗粒复合体。

⑹步骤⑸得到的显色颗粒复合物在上样缓冲液中通过毛细管作用沿纤维素膜向上移动至检测线被受体链霉亲合素捕获得到地高辛抗体-地高辛-目标片段-生物素-链霉亲合素复合体，在检测线上沉降形成肉眼可视的显色条带，且未结合扩增产物的胶体金颗粒上包被的金标抗体与质控线上的羊抗鼠抗体结合，出现两条显色条带即为阳性结果；

或者，当不存在沙门核酸扩增产物时，不发生上述步骤⑶-⑹，不能与金标垫(玻璃纤维)上胶体金颗粒包被的地高辛抗体结合，显色物质胶体金颗粒不能与检测线上包被的物质结合形成显色条带，质控线上的羊抗鼠抗体与胶体金颗粒上包被的金标抗体结合出现一条显色条带即为阴性结果。

4、本发明还提供沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条结构如图2所示：其包括PVC背板上依次为样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC)和吸水纸，上述各部分重叠部分至少保留2mm，硝酸纤维素膜上分别设有检测线(包含标记物生物素的配体物质)和质控线(包含链霉亲和素)，所有的材料需在37℃下过夜干燥。

5、本发明对沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条优化：首先对沙门氏菌解旋酶恒温扩增的反应条件分别进行优化，其中包括引物浓度、MgSO₄浓度、dNTP浓度及反应温度，得到最佳的反应条件使扩增反应达到最理想的效果。同时优化胶体金检测试纸条的设计，包括硝酸纤维素膜的类型、检测线与质控线包被浓度及上样展开液，使试纸条呈现最佳的显色效果。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中使用的试剂材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1

沙门氏菌解旋酶恒温扩增体系的优化

以引物浓度，MgSO₄，dNTP及反应温度为变量对沙门氏菌进行正交试验，引物浓度分别为75nm、80nm和85nm；MgSO₄浓度分别为3mM、3.5mM和4mM；dNTP添加量分别2.5μL、3.5μL和4.5μL；反应温度分别为63℃、64℃和65℃。其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳扩增后利用凝胶成像仪观察扩增效果，经验证得出沙门氏菌扩增50μL总反应体系，其中包括DNA模板1μL，引物浓度为80nM，MgSO₄浓度为3.5mM，dNTP添加量为4.5μL，最后添加3.5μL Enzyme Mix，置于64℃温度下反应60min。

实施例2

沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条制备

1、胶体金标记抗体的制备

⑴取1mL的10nm胶体金溶液置于1.5mL干净的离心管中，滴加一定量的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液至最适pH；

⑵取15μL的浓度为1μg/μL抗体滴加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃条件下静置1h；

⑶滴加20μL 20％的BSA溶液，10μL 20％的PEG 20000溶液，混匀后的溶液于4℃条件下静置30min；

⑷在2000rpm，4℃低温条件下，离心15min，小心移取上清液至干净的离心管中，弃去未标记的胶体金沉淀物；

⑸将上清液在10000rpm，4℃低温条件下，离心30min，弃上清液，保留标记的胶体金颗粒沉淀，用金标工作液复溶5倍，4℃保存。

2、沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条工作条件的优化

⑴选取四种不同型号的硝酸纤维素膜AE 98、Milipore HF90s、Milipore HF135s、Milipore HF180s，验证试纸条显色效果；

⑵检测线包被链酶亲和素浓度分别选取0.5、1.0、1.5、2mg/mL，质控线包被的羊抗鼠二抗分别选取稀释60、80、100、120倍，验证试纸条显色效果；

⑶上样展开液分别采用PBS缓冲液(pH 7.4)、含0.1％BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)，0.1％Tween 20的PBS缓冲液(pH 7.4)以及Tris EDTA(TE，pH 8.0)，验证试纸条显色效果；

其中选择型号为Milipore HF 135s的硝酸硝酸纤维素膜，检测线包被链酶亲和素浓度2mg/mL，质控线包被稀释80倍的羊抗鼠二抗，采用Tris EDTA上样缓冲液的条件下试纸条显色效果最佳。

3、沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条组装

⑴将胶体金标记抗体按照30μL/cm逐滴均匀涂布在规格为83mm×3mm金标垫上，室温真空过夜烘干备用。

⑵检测线(T线)包被链霉亲合素，浓度为2mg/mL，质控线(C线)包被羊抗鼠二抗，稀释100倍，利用划膜仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上按照1μL/cm划出C、T线，37℃过夜烘干备用。

⑶同样将样品垫和吸水纸在37℃过夜烘干，与金标垫，NC膜，吸水纸组装成试纸条，利用切条机切割成规格为60mm×3.7mm的试纸条，固定在塑料外壳内，室温下密封、避光、干燥保存。

实施例3

沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条检测方法的建立

⑴以1μL沙门氏菌DNA作为模板加入含有沙门氏菌解旋酶恒温扩增反应体系的PCR管中，同时以等量的无菌双蒸水作为阴性对照，将上述反应体系置于68℃下反应60min进行沙门氏菌的解旋酶恒温扩增。

⑵选择0.1％BSA和0.1％Tween 20的PBS缓冲液(pH 7.4)作为上样展开液，取10μL扩增产物经上样展开液稀释10倍后滴加到胶体金试纸条上进行检测，试验需重复三次，5分钟后观察检测结果。沙门氏菌的扩增产物呈阳性结果检测线与质控线均显红色；空白对照成阴性只有质控线显红色。

实施例4

沙门氏菌核酸薄膜层析检测试纸条特异性实验

按照实例3中所述的方法检测其他常见食源性致病菌包括大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌、产气肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆，并以等量无菌超纯水作为阴性对照，除五株沙门氏菌结果成阳性，其他实验菌株结果均成阴性，实验结果如图3所示，表明该检测技术具备高特异性。

实施例5

沙门氏菌核酸薄膜检测试纸条纯培养物灵敏度实验

⑴纯菌液灵敏度检测沙门氏菌，将其接种于10mL LB液体培养基中，37℃过夜培养；

⑵各取1mL进行细菌计数，用0.9％无菌生理盐水对纯菌液进行10倍梯度稀释，各取1mL用于DNA的提取作为做实验模板；

⑶按照恒温扩增反应体系进行试验，取10μL扩增产物用上样展开液稀释至100μL，滴加到试纸条样品垫上，取试验重复三次，5min后观察检测结果，确定该方法在检测纯菌液的灵敏度。

将沙门氏菌纯培液浓度养梯度稀释至4.5×10¹CFU/mL，经解旋酶恒温扩增反应后滴加在试纸条上均能显示出阳性结果，表明沙门氏菌核酸薄膜层析试纸条的灵敏度为4.5×10¹CFU/mL。

实施例6

沙门氏菌核酸薄膜试纸条实际样品灵敏度实验

1、固态样品灵敏度实验

⑴在无菌条件下称取25g固体样品置于无菌均质袋中，均质3min。

⑵将样品注入225mL SC培养液中，将培养至浓度为10⁸CFU/mL的沙门氏菌，用0.9％无菌生理盐水10倍梯度稀释后，添加1mL的菌液置于样品增菌液中，使其终浓度为10¹CFU/mL，

⑶在37℃，200r/min条件下培养。期间每隔2h采集一次培养样品，

⑷每份设定两个平行实验组热处理法提取DNA，同时未添加菌的样品作为空白对照，按照恒温扩增反应体系进行试验，

⑸取10μL扩增产物用上样展开液稀释至100μL，滴加到试纸条样品垫上，试验重复三次，5min后观察检测结果，确定检测固体类样品该方法的灵敏度。

2、液态样品灵敏度实验

⑴在无菌条件下量取25mL液态或半固体样品，将样品注入225mL SC培养液中；

⑵将培养至浓度为10⁸CFU/mL的沙门氏菌，用0.9％无菌生理盐水10倍梯度稀释后，添加1mL的菌液置于样品增菌液中，使其终浓度为10¹CFU/mL；

⑶在37℃，200r/min条件下培养。期间每隔2h采集一次培养样品；

⑷每份设定两个平行实验组热处理法提取DNA，同时未添加菌的样品作为空白对照，按照恒温扩增反应体系进行试验；

⑸取10μL扩增产物用已优化的上样展开液稀释至100μL，滴加到试纸条样品垫上，试验重复三次，5min后观察检测结果，确定检测液态类样品该方法的灵敏度。

添加有浓度为10¹CFU/mL的沙门氏菌的实际样品，在增菌2h后能检出，同时未添菌的样品未检出，结果表明该方法可以应用在实际样品的快速检测中。