分泌牛白细胞介素-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分泌牛白细胞介素-2(IL-2)单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗 体及其应用。
【背景技术】
[0002] 1976年，Morgan等研究发现用丝裂原(PHA、ConA等)刺激淋巴细胞产生的一种促进 T细胞生长的因子，被称为T细胞生长因子(TCGF)，并于1979年在第二届国际淋巴因子会议 上正式命名为白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)。1986年，Cerretti等首次克隆了牛IL-2基因。作为一种具有多种生物学效应的细胞因子，IL-2在免疫系统中起到重要的调节作 用，主要以刺激T细胞的增殖为主;并诱导B细胞由分泌IgM转换为分泌IgG2;此外，还具有上 调NK细胞、CTL细胞和巨噬细胞等多种细胞活性的生物学功能。作为主要的Thl型细胞因子 之一，体内的IL-2水平能反映机体的免疫状况，通过对IL-2的检测为评价机体免疫状态和 诊断免疫相关疾病奠定了 一定的基础。
[0003] IL-2的免疫学检测是在特异性抗IL-2单克隆抗体(MAb)的基础上建立的用于对样 本中的IL-2进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，可建立多 种检测方法，如酶免疫分析法(EIA)，酶联免疫吸附法(Enzyme-1 inked Immunosorbent Assay，简称ELISA)，酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，简称ELISPOT)，流式细 胞术(Flow Cytometry，简称FCM)分析法等。
[0004] ELISA、ELISP0T和FCM具有高度的敏感性和应用广泛性，在疫苗的研发、临床诊断 以及基础研究等方面得到广泛应用。与传统的用于IL-2检测的刺激CTLL细胞增殖活性分析 方法相比，新建立的IL-2检测方法具有更高的灵敏度和特异性，作为细胞免疫状态的重要 指标之一，IL-2的双抗体夹心ELISA、ELISP0T和FCM检测方法将被广泛地用于研究基础和临 床医学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种病原感染的诊断等。
[0005] 但是，现有技术中制备的抗牛IL-2抗体，在应用于上述检测方法时往往遇到很大 问题，特别是当用于检测天然牛IL-2时效果不佳。因此，获得一种可用于临床检测的，效价 高、特异性好、与天然牛IL-2有抗原亲和力的牛IL-2单抗，对牛机体免疫状态的评价及感染 性疾病诊断相关的研究具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆 抗体在免疫检测领域的应用。
[0007] 本发明一方面提供了一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂 交瘤细胞株为杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株3D8,保藏名称为杂交 瘤细胞株3D8,保藏号为CCTCC N0:C2015213;保藏于中国典型培养物保藏中心;保藏地址为 中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
[0008] 本发明第二方面提供了一种上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8。
[0009] 本发明第三方面提供了一种牛IL-2的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述ELISA检 测试剂盒包括支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，其中，所述捕获抗体为 所述的杂交瘤细胞3D8株或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8,所述检测 抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应;所述捕获抗体包被在支持介质上或 所述捕获抗体与支持介质分别放置。
[0010] 本发明第四方面提供了一种牛IL-2的ELISP0T检测试剂盒，所述ELISP0T检测试剂 盒包括:支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，其中，所述捕获抗体为所述 的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8,所述检测抗体 为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，其中，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜，所述牛 IL-2单克隆抗体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结 合反应;所述捕获抗体包被在支持介质上或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
[0011]本发明第五方面提供了一种牛IL-2的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括异 硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体，其中，所述异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆 抗体为牛所述IL-2单克隆抗体MAb3D8;优选地，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂：1) 阻断剂Brefeldin(BFA); 2)APC标记针对牛⑶4单抗;3)固定剂、破膜剂；以及4)洗涤液。
[0012] 本发明第六方面提供了所述分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D8或其传代 细胞株，以及所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂 中的应用。
[0013] 本发明第七方面提供了所述试剂盒在用于非诊断目的检测牛IL-2中的应用，所述 非诊断目的检测包括重组表达牛IL-2的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究。
[0014] 本发明的技术效果：
[0015] 本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲 和力强的优势，可用于检测天然牛IL-2。
[0016] 基于此建立的牛IL-2双抗体夹心ELISA检测试剂盒，既可以有效检测出大肠杆菌、 毕赤酵母等多种表达系统表达的重组牛IL-2,也可用于分析牛外周血单核细胞培养上清和 牛血浆中分泌的天然牛IL-2样品，具有较好的灵敏度和特异性。
[0017] 同时，基于此建立的牛IL-2ELISP0T检测试剂盒，在检测牛外周血单核细胞样品和 牛抗凝血时，可以有效检测出ConA刺激牛外周血中分泌牛IL-2的T淋巴细胞，具有较好的灵 敏度和特异性，并且可用于直接检测牛抗凝血，大大简化操作步骤，缩短检测时间，进步显 著。
[0018] 另外，基于此建立的牛IL-2FCM检测试剂盒，在检测牛外周血单核细胞样品时，可 以检测出较高水平的分泌牛IL-2的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
[0019] 采用本发明的试剂盒操作简便，极大缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研 究，用作牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明ELISP0T试剂盒的牛外周血单核细胞样品检测结果图：A.未刺激牛外 周血单核细胞检测结果，B. ConA刺激牛外周血单核细胞检测结果；
[0021] 图2为本发明ELISP0T试剂盒的牛抗凝血样品检测结果图:A.未刺激牛抗凝血检测 结果，B. ConA刺激牛抗凝血检测结果；
[0022] 图3为本发明FCM试剂盒的牛外周血单核细胞样品检测结果图:A.未刺激牛外周血 单核细胞检测结果，B. ConA刺激牛外周血单核细胞检测结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下，对本发明的实施方式进行说明。
[0024] 本发明的目的是提供一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细 胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应 用。
[0025] 本发明一方面提供了一种分泌牛IL-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂 交瘤细胞株为杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株3D8,保藏名称为杂交 瘤细胞株3D8,保藏号为CCTCC N0:C2015213;保藏于中国典型培养物保藏中心;保藏地址为 中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年11月21日。
[0026] 本发明第二方面提供了一种本发明所述的杂交瘤细胞株3D8或其传代细胞株分泌 产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8。
[0027] 本发明第三方面提供了一种牛IL-2的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述ELISA检 测试剂盒包括支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，
[0028]其中，所述捕获抗体为所述的杂交瘤细胞3D8株或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8,所述检测抗体为生物素标记牛IL-2单克隆抗体，所述牛IL-2单克隆抗 体MAb3D8与生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应;所述捕 获抗体包被在支持介质中或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
[0029]所述ELISA检测试剂盒中，支持介质可以为酶标板。
[0030] 所述酶标板可以事先包被有捕获抗体，也可以只提供空白酶标板与捕获抗体，在 检测前由操作者自行采用常规方法在酶标板上包被捕获抗体。
[0031] 所述酶标板可为各种常见规格的酶标板，如96孔酶标板。
[0032] 所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体中的牛IL-2单克隆抗体不同于前述捕获抗体。 生物素标记牛IL-2单克隆抗体的方法采用常规。
[0033]作为本发明的一种实施方式，所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体中的牛IL-2单克 隆抗体为由杂交瘤细胞株6D7或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体MAb6D7。
[0034]其中，所述杂交瘤细胞株6D7,保藏名称为杂交瘤细胞株6D7,保藏号为CCTCC N0: C2015212;保藏于中国典型培养物保藏中心;保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为 2015年11月21日。
[0035]作为本发明的一种实施方式，所述ELISA检测试剂盒中还包括下列试剂中的一种 或多种：
[0036] 1)亲和素-辣根过氧化物酶结合物；
[0037] 2)底物液；以及
[0038] 3)洗涤液。
[0039]作为本发明的一种优选实施方式，所述ELISA检测试剂盒中还包括下列试剂：
[0040] 1)亲和素-辣根过氧化物酶结合物；
[0041] 2)底物液；以及
[0042] 3)洗涤液。
[0043] 上述试剂均为ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据 需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选 择是试剂盒中同时包括亲和素-辣根过氧化物酶结合物、底物液和洗涤液。
[0044] 所述底物液可为ELISA检测试剂盒中常用的通用底物液，如3，3 '，5，5 四甲基联 苯胺(TMB)底物液。
[0045]所述洗涤液可为ELISA检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据 需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
[0046]作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISA检测 所需通用试剂，如封闭液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。
[0047] 所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如FBS、BSA等。
[0048] 通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
[0049]本发明进一步基于上述牛IL-2ELISA检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏 度的牛IL-2的ELISA检测方法，用于检测牛IL-2含量，从而进行机体免疫状态评价。
[0050] 本发明的ELISA检测试剂盒既可用于分析大肠杆菌、毕赤酵母等多种表达系统表 达的重组牛IL-2样品，也可用于分析牛外周血单核细胞培养上清和牛血浆中分泌的天然牛 IL-2样品。
[0051] 利用本发明的ELISA检测试剂盒检测重组牛IL-2样品的检测方法包括下列步骤：
[0052] 1)捕获抗体包被酶标板；
[0053] 2)样品孵育及检测：
[0054] ①在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL7孔，37°C反应2h;
[0055] ②弃去样品，PBST洗3次，加入0.25yg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL 孔，37°C孵育2h;
[0056] ③弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物（5八-HRP)，1 OOyL/孔，37°C孵育 1 h;
[0057] ④弃去 SA-HRP，PBST