洗6 次，加入TMB，100μL7孔，37°C 避光反应 10min;
[0058] ⑤加入2M H2S04,50yL/孔，使用酶标仪于0D45Q/55Q波长下测定吸光值。
[0059] 利用本发明的ELISA检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列 步骤：
[0060] 1)捕获抗体包被酶标板；
[0061] 2)制备牛外周血单核细胞悬液；
[0062] 3)细胞孵育及检测：
[0063]①将2)所制备的细胞加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至终浓度为10yg/ mL，置于37°C、5 % C02培养箱培养24-48小时，吸取培养上清作为检测样品；
[0064] ②在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL7孔，37°C反应2h;
[0065] ③弃去样品，PBST洗3次，加入0.25yg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μ L/孔，37°C 孵育 2h;
[0066] ④弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物（5八-HRP)，1 OOyL/孔，37°C孵育 1 h;
[0067] ⑤弃去 SA-HRP，PBST洗6 次，加入TMB，100μL7孔，37°C 避光反应 10min;
[0068] ⑥加入2M H2S04,50yL/孔，使用酶标仪于0D45Q/55Q波长下测定吸光值。
[0069] 上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单核细胞，以经ConA刺激的牛外周血单 核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单核细胞为对照样品，并以纯化的所述杂交瘤 细胞株3D8分泌的单抗为捕获抗体，以生物素标记的另一牛IL-2单抗为检测抗体，结果显 示，该方法可以有效检测出牛IL-2。
[0070] 利用本发明的试剂盒检测牛抗凝血样品的检测方法包括下列步骤：
[0071 ] 1)捕获抗体包被酶标板；
[0072] 2)抗凝血孵育及检测：
[0073] ①无菌采取牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血，将 血液加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至终浓度为10yg/mL，置于37°C、5%⑶2培养 箱培养24-48小时，吸取血浆作为检测样品；
[0074] ②在上述捕获抗体包被的酶标板中加入检测样品，100μL7孔，37°C反应2h;
[0075] ③弃去样品，PBST洗3次，加入0.25yg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL 孔，37°C孵育2h;
[0076] ④弃去检测抗体，PBST洗3次，加入稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物（5八_ HRP)，100μL7孔，37°C孵育 1 h;
[0077] ⑤弃去 SA-HRP，PBST洗6 次，加入TMB，100μL7孔，37°C 避光反应 10min;
[0078] ⑥加入2M H2S04,50yL/孔，使用酶标仪于0D45Q/55Q波长下测定吸光值。
[0079] 本发明第四方面提供了牛IL-2的ELISP0T检测试剂盒，所述ELISP0T检测试剂盒包 括:支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照，其中，所述捕获抗体为所述的杂 交瘤细胞株3D8或其传代细胞株分泌产生的牛IL-2单克隆抗体MAb3D8,所述检测抗体为生 物素标记牛IL-2单克隆抗体，
[0080] 其中，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜，所述牛IL-2单克隆抗体MAb3D8与 生物素标记牛IL-2单克隆抗体能同时与牛IL-2发生抗原抗体结合反应;所述捕获抗体包被 在支持介质中或所述捕获抗体与支持介质分别放置。
[0081] 所述ELISP0T检测试剂盒中，所述支持介质可以为微孔滤膜板。
[0082]所述ELI SPOT检测试剂盒中，微孔滤膜板可以事先包被有捕获抗体，也可以只提供 空白微孔滤膜板与捕获抗体，在检测前由操作者自行采用常规方法在微孔滤膜板上包被捕 获抗体。
[0083] 作为本发明的一种实施方式，所述捕获抗体包被在微孔滤膜板中。所述微孔滤膜 板可为各种常见规格的微孔滤膜板，如96孔滤膜板。
[0084] 所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体中的牛IL-2单克隆抗体不同于前述捕获抗体。 生物素标记牛IL-2单克隆抗体的方法采用常规。
[0085] 作为本发明的一种实施方式，所述生物素标记牛IL-2单克隆抗体为由杂交瘤细胞 株6D7或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体MAb6D7。
[0086] 作为本发明的一种实施方式，所述ELISP0T检测试剂盒中还包括下列试剂中的一 种或多种：
[0087] 1)亲和素 -碱性磷酸酶结合物；
[0088] 2)底物液；以及
[0089] 3)洗涤液。
[0090] 作为本发明的一种优选实施方式，所述ELISP0T检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒中还包括下列试剂：
[0091 ] 1)亲和素 -碱性磷酸酶结合物；
[0092] 2)底物液NBT/BCIP;以及
[0093] 3)洗涤液。
[0094] 上述试剂均为ELIS0PT检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根 据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的 选择是试剂盒中同时包括亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液和洗涤液。
[0095] 所述底物液可为ELISP0T检测试剂盒中常用的通用底物液，如液氮蓝四唑/5-溴- 4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)底物液。
[0096]所述洗涤液可为ELISP0T检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根 据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
[0097]进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISP0T检测所需通用试剂，如 封闭液、细胞培养液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。
[0098]所述封闭液可为包被微孔滤膜板常用的封闭液，如FBS、BSA等。
[0099 ]通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
[0100]本发明进一步基于上述牛IL-2ELISP0T检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵 敏度的牛IL-2的ELISP0T检测方法，用于检测分泌牛IL-2的T淋巴细胞，从而进行机体免疫 状态评价及疾病诊断方面的研究。
[0101]本发明的ELISP0T检测试剂盒既可用于分析牛外周血单核细胞样品，也可用于分 析牛抗凝血样品。
[0102] 利用本发明的ELISP0T检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下 列步骤：
[0103] 1)捕获抗体包被微孔滤膜板；
[0104] 2)制备牛外周血单核细胞悬液；
[0105] 3)细胞孵育及检测：
[0106] ①在上述捕获抗体包被的微孔滤膜板中加入下列试剂:50yL细胞培养液至每个对 照孔，50yL 10yg/mL的刀豆蛋白A(ConA)至每个阳性孔。每孔加入50yL细胞悬液，将96孔滤 膜板置于37°C、5 % C02培养箱培养24-48小时；
[0107] ②弃培养上清，洗板后，加入lyg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL孔， 置于37°C孵育1小时；
[0108] ③洗板后，加入稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL孔，置于37°C孵育1小 时；
[0109] ④每孔加入100yL底物液，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止 反应，去除液体，室温下过夜或37°C烤箱中2-3小时烘干；
[0110] ⑤使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛IL-2 的T细胞;或将微孔滤膜板放入ELISP0T仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。
[0111] 上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单核细胞，以经刀豆蛋白A刺激的牛外 周血单核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单核细胞为对照样品，并以纯化的本发 明所述杂交瘤细胞株3D8分泌的单抗为捕获抗体，以生物素标记的另一牛IL-2单抗为检测 抗体，结果显示，该方法可以有效检测出分泌牛IL-2的T淋巴细胞。
[0112] 利用本发明的ELISP0T检测试剂盒，检测牛抗凝血样品的检测方法包括下列步骤：
[0113] 1)捕获抗体包被微孔滤膜板；
[0114] 2)抗凝血孵育及检测：
[0115] ①无菌采取lmL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
[0116] ②在上述捕获抗体包被的微孔滤膜板中加入下列试剂：50yL培养液至每个对照 孔，50yL 10yg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50yL牛抗凝血(与灭菌PBS 1:1稀释），将 96孔滤膜板置于37°C、5 % C02培养箱培养24-48小时；
[0117] ③弃培养上清，洗板后，加入lyg/mL的生物素标记牛IL-2单克隆抗体，100μL孔， 置于37°C孵育1小时；
[0118] ④洗板，加入1:1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL孔，置于37°C孵育1 小时；
[0119]⑤每孔加入100yL底物液，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止 反应，去除液体，室温下过夜或37°C烤箱中2-3小时烘干；
[0120] ⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛IL-2 的T细胞;或将96孔滤膜板放入ELISP0T仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。
[0121] 本发明第五方面提供了牛IL-2的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括异硫氰 酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体，其中，所述异硫氰酸荧光素标记的牛IL-2单克隆抗体 为牛所述IL-2单克隆抗体MAb3D8;优选地，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂的一种或 多种：
[0122] 1)阻断剂 Brefeldin(BFA);
[0123] 2)APC标记针对牛CD4单抗；
[0124] 3)固定剂、破膜剂；以及
[0125] 4)洗涤液。
[0126] 更优选地，所述FCM检测试剂盒中还包括下列试剂：
[0127] 1)阻断剂 Brefeldin(BFA);
[0128] 2)APC标记针对牛CD4单抗；
[0129] 3)固定剂、破膜剂；以及
[0130] 4)洗涤液。
[0131]上述试剂均为FCM检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需 要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择 是试剂盒中同时包括阻断剂Brefeldin(BFA)、APC标记针对牛CD4单抗、固定剂、破膜剂和 洗涤液。
[0132] 所述洗涤液可为FCM检测试剂盒中常用的洗涤液，如含1 % BSA的磷酸盐缓冲液等。 可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
[0133] 作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他FCM检测所 需通用试剂，如细胞培养液、磷酸盐缓冲液等。
[0134] 通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
[0135] 本发明进一步基于上述牛IL-2FCM检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度 的牛IL-2的FCM检测方法，用于检测分泌牛IL-2的T淋巴细胞，从而进行机体免疫状态评价 及疾病诊断方面的研究。
[0136] 本发明的FCM检测试剂盒可用于分析牛外周血单核细胞样品。
[0137] 利用本发明的FCM检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步 骤：
[0138] 1)制备牛外周血单核细胞悬液；
[0139] 2)细胞孵育：
[0140] ①在96孔细胞培养板中加入下列试剂:50yL培养液至每个对照孔，50yL 10yg/mL 的ConA至每个阳性孔。每孔加入50yL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37°C、5 % C02培养箱 培养8小时；
[0141] ②加入细胞因子分泌阻断剂Brefeldin A(BFA)，再放入37°C、5%C02培养箱培养 16小时。
[0142] 3)细胞因子检测：
[0143] ①次日收集细胞，使用含1 %BSA的PBS洗涤细胞，于4°C2000r