专利名称：一种胃癌靶向性多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤的分子影像学技术领域，涉及一种胃癌靶向性多肽及其应用。
背景技术：
胃癌是起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，估计全球每年有70万人死于胃癌，占据肿瘤致死率第二位。2005年我国胃癌发病率在男性中达37. 1/10万，女性为17. 4/10万胃癌发病总人数达到全世界的42%以上。我国每年新发胃癌患者达40万人，死亡人数达 30万人。在卫生部组织的全国第二次死因调查中，我国胃癌的死亡率占到所有因癌症死亡人数的23. 2%，是严重危害我国人民健康的疾病之一。胃癌发病隐匿，近半数早期胃癌病人没有临床症状，仅部分有轻度消化不良等症状，如上腹隐痛不适、轻微饱胀、疼痛、恶心、嗳气等。胃癌尽管经过手术、放疗、化疗等积极治疗，各期总体5年生存率仍仅有30%左右，而早期胃癌(Early gastric cancer, EGC) 术后5年生存率超过90%，微小胃癌则几乎达到100%，因此早期发现、早期治疗是提高胃癌疗效的关键(Wai K Leung, Ming-shiang Wu, Yasuo Kakugawa, et al. Screening for gastric cancer in Asia :current evidence and practice. The Lancet Oncology,2008 ； 9(3) :279-287)。但由于种种原因我国早期胃癌的诊断率很低，早期胃癌手术率< 10%，而在早期胃癌诊断最先进的日本，早期胃癌手术率占50%以上。所以如何提高早期胃癌的诊断率和手术率，从而改善胃癌病人的整体5年生存率是我国胃癌研究的重大课题。胃癌的诊断主要涉及内镜、影像、病理、检验和消化内科、胃肠外科等专业，而胃镜检查是人群筛查的最终确诊方法。目前主要有下面两方面的因素影响胃癌的早期诊断1、早期胃癌发生发展的生物学特性胃癌的发生、发展被认为是在致癌因子作用下，从胃黏膜炎症开始的一个逐渐累积的慢性过程。目前较为认可的胃癌的发生模式是1988年Correa提出的“正常胃黏膜-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-小肠型肠上皮化生-轻度不典型增生(Low grade dysplasia，LGD)-重度不典型增生(high grade dysplasia，HGD)-胃癌(肠型)”(Correa P. A human model of gastric carcinogenesis. Cancer Res. 1988 ;48 :3554-60.),这是一个连续的、漫长的病理学过程。日本的研究发现，存在胃黏膜重度不典型增生的病人在4到48个月内的观察期内60-85%被诊断为胃癌，欧洲大宗病例的前瞻性研究表明，在10年的随访期内，萎缩性胃炎、肠上皮化生、LGD和HGD等癌前病变患者中，分别有0. 8%，1. 8%，3. 9%和32. 7%的病人发生胃癌。该结论是对2万多名病人进行长达10年的随访，每个病人进行3-5次胃镜、 活检的基础上才得出的。可见，按照目前的方法必须在高危人群反复随访筛查，才有可能做到胃癌的早期诊断。另外，2004年以来在日本“早期胃癌检诊协会”所属医疗机构中，检出的胃癌中超过70%为EGC，如此高的早期胃癌检出率则得益于对无症状的人群进行胃癌筛查。
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但是胃镜筛查费用高、周期长且占用大量的医疗资源，同时受到病人依从性、内镜医生水平等因素的制约。全世界除了日本以外，即使在发达国家，也无法针对胃癌进行癌前疾病的长期胃镜筛查。我国人口众多，潜在的癌前病变的病人基数大，缺少训练有素的内镜医生，进行大规模的、反复的前瞻性调查难度更大。在广大农村甚至有很多病人患慢性胃病多年都未接受胃镜检查，直到出现胃癌的严重并发症才开始积极治疗。所以，建立符合我国国情的经济、实用、高效的以胃镜活检为主的胃癌筛查方案，并努力开展无症状人群的早期胃癌筛查是当务之急。2、目前的胃镜诊疗技术有缺陷目前，胃镜检查仍是胃癌最直接、准确、可靠的诊断方法，但是常规的胃镜+活检组织病理学的诊断模式存在以下缺点①早期胃癌诊断率低，漏检率、误诊率高。首先，胃癌的癌前病变往往涉及胃粘膜广泛区域，常规的内镜活检采取分段、随机多点取样方法，漏检局灶癌变组织的可能性很大，特别是经验缺乏的内镜医生则更容易出现“视癌不见”；其次，在显微镜下对于不典型性增生和早期胃癌的判定需要大量的病例积累、训练，在不同的病理医生间或者同一病理医生多次诊断同一组胃镜活检标本，都存在着一定的差异；②内镜技术的“物理学”进展没有和肿瘤分子生物学研究进展进一步融合。近年来有多种新的内镜检查方法用于临床如放大内镜、染色内镜、超声内镜、荧光内镜、近红外线电子内镜、 窄谱成像技术、共聚焦激光显微内镜等。但是由于缺乏高特异性和敏感性的肿瘤分子生物学标记物，内窥镜操作者只能依据经验，从形态学(包括宏观和微观)上对胃粘膜的可疑病变进行判断，不能从胃癌相关基因或分子水平进行诊断，没有真正实现肿瘤的实时、原位诊断，这就有可能丧失了肿瘤亚临床期的诊断和治疗的时机。另外，这些方法在临床的应用都不久，大都缺乏循证医学证据，没有被广泛认可的操作规范和诊断标准可依，所以大都应用于临床研究用，很难普及。③内镜下胃粘膜切除技术的发展也存在瓶颈。日本早期胃癌治愈率的提高还得益于其内镜下粘膜切除手术的广泛开展(Endoscopic Mucosal Resection, EMR)，配合染色内镜和窄谱成像技术该手术能安全地切除直径3cm以内的胃粘膜病变。由于比常规活检能获取更多的组织，EMR不但能提高早期胃癌的确诊率，还可以选择性的治疗小胃癌及微小胃癌。但是对于直径超过5cm的癌前病变，应用该技术后出血及胃穿孔的并发症明显高发，应用受限。如果能在EMR术中实时定位，确认癌变灶，进行选择性的病变粘膜切除，缩小粘膜切除的范围，则有助于该技术的广泛开展。肿瘤的分子影像学(Molecular Imaging)技术，是寻找肿瘤细胞或肿瘤间质特异性的小分子探针(如抗体的Fab片段、多肽、酶的底物和配体等)，与同位素、荧光素、顺磁性复合物及声学对比剂连接组成肿瘤特异性探针，应用光学、超声、核医学及磁共振等显像手段对肿瘤进行诊断，这种新技术在分子水平诊断肿瘤，使得肿瘤的亚临床期诊断和治疗成为可能。荧光内镜、放大内镜、显微内镜和共聚焦内镜的发展，为消化道肿瘤的分子影像学诊断提供了契机。其中共聚焦激光显微内镜(confocal laserendomicroscopy, CLE)是近年来新开发出来的内镜系统，是在传统的可视内镜的顶端安装了共聚焦激光显微镜，在内镜检查的同时获得消化道上皮及上皮下高度放大的横切面的图像，这种放大1000倍的图像可清晰辨认组织结构、细胞及亚细胞结构，可做到实时的高分辨率的组织学诊断，号称可达到光学活检病理的结果。但是CLE设备昂贵，应用时间短，仍然属于肿瘤形态学诊断，而且图像色彩单一，缺乏被广泛认可的诊断标准，国内外都做为临床研究小规模开展，若能联合应用肿瘤分子生物学标记物做为探针，则其临床应用价值会大大提高。利用荧光标记的肿瘤组织特异性多肽诊断肿瘤，比目前常用的单克隆抗体诊断的方法有如下优点①筛选多肽无需预先确定肿瘤特异性抗原，后者是肿瘤诊治研究的最大难点；②多肽分子量小，免疫原性低，无明显的毒副作用，组织穿透力强，可以在病人活体应用；③相对于抗体制备，多肽合成费用低，易于规模化生产和应用。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种胃癌靶向性多肽及其应用，利用胃癌特异性多肽探针能靶向性识别早期癌变组织的特性，结合荧光内窥镜，可提高胃镜下早期胃癌的确诊率。本发明是通过以下技术方案来实现一种胃癌靶向性多肽，所述的多肽的序列如SEQ. ID. NO. 1所示。在所述的多肽还与荧光分子进行连接。所述的胃癌靶向性多肽应用于胃癌早期诊断试剂的制备。所述的多肽连接荧光分子之后作为靶向性的指示。所述的多肽被表达于噬菌体，以表面表达有多肽的噬菌体作为检测探针。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的胃癌靶向性多肽，能够与胃癌特异性结合，无论是表达该多肽的噬菌体还是合成的多肽探针，都能特异性的结合胃癌组织；表达该多肽的噬菌体与胃癌组织的结合力高于空载噬菌体约615倍，且几乎不与正常胃粘膜结合。在荧光共聚焦显微镜下联合使用该多肽探针能实现胃癌的实时、定位诊断，并能指导靶向性活检。在病人进行荧光内胃镜或共聚焦内窥镜检查中，在病人胃粘膜表面喷洒组合多肽探针，在探针的指引下实现靶向性胃粘膜活检。克服了目前常规光学内窥镜的不足，能在胃镜检查中实现胃癌的早期、实时和定位诊断。目前的胃癌筛查方案在普通光学内窥镜下进行，对于面积较大的胃粘膜可疑病变，只能采取随机(盲目)多点活检的方法，这样漏诊临床前期癌变的可能性很大。共聚焦内窥镜虽然能在人体观察到粘膜的显微结构，但是普通的共聚焦荧光显微内镜设备昂贵， 应用时间短，仍然属于肿瘤形态学诊断，而且色彩单一，缺乏被广泛认可的诊断标准；若能联合应用本发明提供的多肽作为探针，则其临床应用价值会大大提高。
图1为多个噬菌体克隆与胃癌细胞BGC823的结合活性的检测结果图；图2为阳性噬菌体克隆的多个组织的免疫组化染色结果图；图3为AAD多肽与胃癌组织结合的免疫荧光染色结果图；图4为阳性克隆噬菌体AAD-phage、空载噬菌体WT-phage与胃癌细胞BGE823和胃正常细胞GEC-I的结合力对比图；图5为表达多肽AAD的噬菌体与胃癌组织的特异性结合的检测结果图；图6为AAD-phage和AAD-ρ印tide对胃癌组织的竞争结合能力的检测结果图；图7为荧光内窥镜下联合使用AAD多肽探针的靶向性指示及局部放大图。
具体实施例方式本发明提供胃癌靶向性多肽，该多肽是通过噬菌体随机十二肽库进行胃癌新鲜组织淘选而获得。以人正常胃粘膜组织为阴性消减靶组织，手术切除的人胃癌组织为阳性筛选的靶组织，按照噬菌体随机肽库的淘选的方法，与噬菌体共孵育，洗去不结合或结合较弱的噬菌体，再洗脱下与靶细胞特异性结合的噬菌体。用洗脱下来的噬菌体再感染宿主细菌， 繁殖扩增、纯化，经过3轮消减淘选，并逐渐增加淘选压力后，出现富集现象。从而获得能与人胃癌细胞与胃癌组织特异结合的多肽。下面结合具体的筛选过程和对胃癌特异性的靶向对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。1、人胃癌组织结合的噬菌体的淘筛具体采用的噬菌体随机肽库M13 (购于NEB公司)进行筛选，其噬菌体含量约为 3. OX IO10Pfu ；噬菌体的宿主细胞采用大肠杆菌ER2738。所采用的靶组织为取术中切下的胃癌组织和正常胃组织，迅速切除坏死组织、分离胃癌粘膜上皮，并用LRS(复方乳酸钠)冲洗后，切成直径<0. Icm的组织糜，入干净离心管内，0. OlM PBS冲洗五次后，置于BSA封组缓冲液中封闭。所采用的噬菌体的淘筛步骤为(共进行三轮梯度强度筛选)向正常胃组织内加入:3ml 20% DMEM内含10 μ L噬菌体肽库(> 1.0X IO8)， 37°C水浴震荡孵育30min后，吸取上清转移至干净试管；将胃癌组织加入所制备的上清液， 37°C水浴震荡孵育lh，取出水浴产物后弃上清液；PBST洗涤后，用非特异性缓冲液0. 2M Glycine-HCl (pH2. 2), lmg/ml BSA温和摇动> IOmin以进行洗脱，将洗脱液收集后再用 150 μ IlM Tris-HCl (ρΗ9. 1)中和上述洗脱液，得到噬菌体淘洗液；选取1μ 1进行滴度测定，将剩余的噬菌体淘洗液4°C贮存过夜，并在第二天侵染大肠杆菌ER2738进行扩增，然后进行下一轮的淘筛。经3轮筛选后，每轮筛选结果都由洗脱得到的噬菌体的滴度来评定，具体筛选结果如表1所示表1噬菌体淘筛选择性富集情况
权利要求
1.一种胃癌靶向性多肽，其特征在于，所述的多肽的序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2.如权利要求1所述的胃癌靶向性多肽，其特征在于，在所述的多肽还与荧光分子进行连接。
3.权利要求1或2所述的胃癌靶向性多肽应用于胃癌早期诊断试剂的制备。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的多肽连接荧光分子之后作为靶向性的指示。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的多肽被表达于噬菌体，以表面表达有多肽的噬菌体作为检测探针。
全文摘要
本发明公开了一种胃癌靶向性多肽及其应用，所述的多肽的序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明提供的胃癌靶向性多肽，能够与胃癌特异性结合，无论是表达该多肽的噬菌体还是合成的多肽探针，都能特异性的结合胃癌组织；表达该多肽的噬菌体与胃癌组织的结合力高于空载噬菌体约615倍，且几乎不与正常胃粘膜结合。在荧光共聚焦显微镜下联合使用该多肽探针能实现胃癌的实时、定位诊断，并能指导靶向性活检。
文档编号A61K49/00GK102329374SQ20111026437
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者张文杰, 禄韶英 申请人:西安交通大学