Ⅱ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用图
【专利说明】Μ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用途
[0001] 相关申请的参考文献
[0002] 本申请要求于2005年6月23日提交的临时申请第60/693，157号的优先权，在此通 过参考的方式将其整体并入。
[0003] 对于在联邦资助的研究或开发下所做出发明的权利的声明
[0004] 本发明的研发至少部分地使用了由美国政府依照ΝΙΗ基金号R01 CA106671-01提 供的资金。美国政府可以拥有本发明的某些权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及包括癌症治疗学在内的病毒学、癌症生物学、细胞生物学、分子生物学 和医学领域。具体地，本发明提供包含I CP 10基因修饰的II型单纯疱疹病毒(HSV-2)突变体 以及该HSV-2突变体在治疗恶性疾病中的用途。
[0006] 发明背景
[0007] 作为治疗实体瘤的抗肿瘤试剂，复制选择性的溶瘤病毒已显示出巨大的潜力。这 些病毒能够偏爱地在肿瘤细胞中进行复制，而在正常细胞中其复制能力却受到限制。这种 溶瘤病毒主要的抗肿瘤机理是通过当其繁殖和从最初感染的肿瘤细胞向周围肿瘤细胞扩 散时的直接细胞病变效应，以达到更大限度的分布和抗癌效力。已出于溶瘤目的对单纯疱 疹病毒(HSV)进行了修饰，最普遍的是通过删除在正常(非分裂的）细胞而非肿瘤细胞中复 制所必须的病毒基因。这种修饰包括删除病毒γ 34.5基因或ICP6基因。病毒γ 34.5基因在 HSV感染过程中作为神经毒性因子发挥功能（Chou, et al, (1990)Science 250:1262-1266)。删除这个基因阻断非分裂细胞中的病毒复制(Mckie，et al.，（1996)Br J Cancer 74(5) :745-52)。病毒ICP6基因编码核糖核苷酸还原酶的大亚基，该酶为病毒DNA有效的复 制产生充足的dNTP池，并且在肿瘤细胞中大量表达，但不在非分裂细胞中大量表达。于是， 在此基因发生突变的病毒能够偏爱地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞。已经在动物研究 中进行广泛测试的溶瘤性HSV G207目前已经进入临床试验阶段，该病毒在γ34.5基因座 的两个拷贝中都有缺失且通过大肠杆菌(E.coliHacZ基因造成了ICP6基因中的插入突变 (Walker，et al.，（1999)Human Gene Ther. 10(13) :2237-2243)。或者，通过使用肿瘤特异 性启动子来驱动γ 34.5或其它批￥复制所必需的基因能够构建溶瘤性的1型批￥(〇111即，的 al.,(1999)J Virol 73(9):7556-64)〇
[0008] 最初，溶瘤性的单纯疱疹病毒(HSV)是为治疗脑瘤而设计并构建的(Andreansky， et al.，（lgge^roc.Natl.AcacL Sci .92(21): 11313-11318)。后来发现该病毒在多种其它 人类实体瘤中也是有效的，包括乳腺癌（Toda，et al.，（1998)Human Gene Ther.9(15): 2177-2185)，前列腺癌（Walker,et al.，（1999)Human Gene Ther. 10(13) :2237-2243)，肺 癌（Toyoizumi，et al.，（1999)Human Gene Ther.10( 18) :3013-3029)，卵巢癌（Coukos，et al.，（1999)Clin.Cancer Res.5(6):1523-1527)，结肠癌和肝癌（Pawlik，et al. ,(2000) Cancer Res.61(ll): 2790-2795)。溶瘤性 HSVs 的安全性也已在小鼠（Sundaresan，et al ·， (2000) J. Virol. 74(8): 3832-3841)，以及对HSV感染非常敏感的灵长类动物(夜猴(Aotus)) 中被广泛测试(Todo，et al.，（2000)Cancer Gene Ther.7(6):939-946)。这些研究证实溶 瘤性HSVs对于体内给药是非常安全的。
[0009] 溶瘤性HSVs全部由HSV-1构建而成。尚未研究HSV-2用于构建溶瘤性病毒。然而， HSV-2具有某些独特的特征增强了其作为溶瘤性试剂的潜力。例如，已报道与HSV-1不同， HSV-2编码糖蛋白G(gG)的分泌形式，该蛋白影响嗜中性粒细胞、单核细胞核和自然杀伤性 细胞的功能(Bellner，et al ·，（2005)J Immunol · 174(4): 2235-41)。这种性质可能提供衍 生自HSV-2的溶瘤性病毒，而该病毒具有抵制机体固有免疫的抑制效应的能力。固有免疫是 宿主对于侵入的微生物作出的快速应答，并且发现其为体内限制HSV复制的主要因素 (Dalloul,et al.,(2004)J Clin Virol.30(4):329-36；ffakimoto,et al.,(2003)Gene Ther. 10(11): 983-90)。因此，甚至当病人机体发展出抗HSV的固有免疫功能时，衍生自HSV-2的溶瘤性病毒也应该复制并扩散。
[0010] 尽管临床前研究令人鼓舞，但早期临床试验的结果显示当前形式的溶瘤病毒虽然 安全，但其自身可能仅具有有限的抗肿瘤活性（Nemunaitis，et al·，（2001)J.Clin Onco 1.19 (2): 289-298)。来自本发明人工作的研究已经证明将细胞膜融合活性包括到溶瘤 性HSV中能够显著地改善病毒的抗肿瘤能力(Fu，et al.，（2002)Mol.Ther.7(6):748-754; Fu，et al.，（2003)Cancer Res.62:2301-2312)。这种膜融合的溶瘤病毒在肿瘤中产生合胞 体形成，直接增强了病毒的破坏力并促进了其肿瘤内的扩散(Fu，et al.，（2003)Cancer Res. 62:2301-2312)。这种合胞体形成和通过膜融合的溶瘤HSV直接进行细胞溶解的独特的 联合肿瘤破坏机制还促进原位肿瘤抗原呈递，导致有效的抗肿瘤免疫应答(Nakamori， et al .，（2004)Mol .Ther.9(5) :658-665)。此外，通过形成合胞体的膜融合溶瘤HSV的扩散将使 其保持抗肿瘤活性，甚至是在宿主中存在中和抗病毒抗体的情况下。病毒仅能在活细胞内 复制，且它们的复制通常需要某些细胞信号通路的激活。很多病毒在其进化过程中已经获 得了多种激活这些信号通路以有益于其复制的方法。II型单纯疱疹病毒(HSV-2)核糖核苷 酸还原酶(ICP10或RR1)的大亚基包含具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PK)活性的独特的氨基 末端结构域。已发现该？1(活性激活细胞的1^8/1^1(/1^1 31(通路（3111丨认，6七31.，（2000)了 Virol.74(22):10417-29)〇
[0011] Luo和Aurelian描述了多种包含HSV-2中ICP10基因不同删除的载体以证明特定基 序和某些活性之间的关系（Luo and Aurelian，（1992)J Biol Chem 267(14):9645-53)〇 HSV-2 ICP10基因的修饰和删除构建体已经被用于证明核糖核苷酸还原酶结构域的特殊性 质（Peng，et al.，（1996)Virology 216(1):184_96)〇
[0012] 从核糖核苷酸还原酶基因中删除PK结构域(ICP10PK)严重地损害病毒在没有预先 激活的Ras信号通路的细胞中复制的能力（Smith，et al·，（1998)J Virol.72(ll) :9131-9141)。
[0013] 美国专利第6013265号涉及提供针对HSV-2的保护的疫苗，其中ICP10的蛋白激酶 结构域被删除，导致了对HSV-2感染和转化细胞能力的有害影响。
[0014] 本发明通过提供利用经修饰的HSV-2治疗癌症的新治疗方法而满足了本领域的需 要。
[0015]发明的简明概要
[0016]本发明通过提供有效的经修饰的具有溶瘤特性的II型单纯疱疹病毒(HSV-2)满足 了本领域的长期需求。在本发明的具体实施方案中，病毒含有经修饰的、编码具有核糖核 苷酸还原酶活性但缺乏蛋白激酶活性的ICP10多肽的ICP10多聚核苷酸。在特定方面，该病 毒用于治疗恶性细胞。在具体实施方案中，病毒选择性地在肿瘤细胞中复制。在其它具体实 施方案中，病毒产生细胞膜融合，使培养物、组织或生物体摆脱至少一些不期望的细胞。在 其它具体实施方案中，病毒至少抑制一些不期望细胞的增殖，和/或在至少一些期望的细胞 中诱导凋亡，和/或诱导强烈的抗肿瘤免疫应答，和/或其组合。
[0017] 天然HSV-2病毒含有ICP10多聚核苷酸(也可称为RR1多聚核苷酸），该多聚核苷酸 编码具有氨基末端结构域和C末端结构域的多肽，该氨基末端结构域具有蛋白激酶(PK)活 性，如丝氨酸/苏氨酸激酶活性，该C末端结构域具有核糖核苷酸还原酶活性。在本发明的特 定方面，内源性PK结构域经修饰，使病毒具有在肿瘤细胞中选择性复制的活性(因此包含破 坏肿瘤细胞的活性），和/或赋予病毒膜融合活性或增强病毒的融合活性，由于其包含膜融 合(合胞体形成)活性。在一些实施方案中，ICP10多聚核苷酸通过至少删除编码蛋白激酶结 构域的部分内源性序列而被修饰，以使被编码的多肽缺乏蛋白激酶活性。
[0018] 在本发明的另一个实施方案中，第二多聚核苷酸取代至少部分编码至少部分蛋白 激酶结构域的内源性ICP10多聚核苷酸。在本发明其它实施方案中，未被取代的ICP10序列 包含整个RR结构域。对至少部分内源性ICP10多聚核苷酸的取代可通过任意适当的方法进 行，如通过同源重组或其它适当的基因工程方法，包括使用PCR和本领域技术人员熟知的其 它方法。
[0019] 在本发明的其它方面中，取代ICP10的至少部分内源性PK结构域的多核苷酸可以 是任何适当的序列。例如，取代PK结构域的多聚核苷酸可以编码报告基因产物或治疗性基 因产物。经修饰的包含第二多聚核苷酸(至少取代PK结构域中的一部分）的ICP10多聚核苷 酸将编码由取代多聚核苷酸和ICP10基因中剩余的未取代部分组成的融合蛋白。适合本发 明使用的报告基因的非限制性实例包括绿色荧光蛋白（SEQ ID N0:16;GeneBank登录号 U55761)，i3-半乳糖苷酶，荧光素酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。治疗性多聚核苷酸 的非限制性实例可以包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，胞嘧啶脱氨酶，半胱天冬酶 (088口&86)3和野生型卩53。
[0020] 在本发明的其它实施方案中，取代至少部分ICP10内源性PK结构域的多聚核苷酸 可以是免疫调苄基因，或编码融合性膜糖蛋白（FMG)的多聚核苷酸。适合本发明使用的免疫 调苄基因的非限制性实例包括IL2、IL12或GM-CSF和其它细胞因子;F42K和其它细胞因子类 似物;或MIP-l、MIP-li3、MCP-l、RANTES和其它趋化因子。适合本发明使用的编码融合性膜糖 蛋白的多聚核苷酸的非限制性实例包括副粘病毒F蛋白、HIV gpl60蛋白、SIV gpl60蛋白、 逆转录病毒Env蛋白、埃博拉病毒Gp或流感病毒血凝素，来自长臂猿白血病病毒(GALV)的膜 糖蛋白或长臂猿白血病病毒包膜糖蛋白（GALV. fus)的C末端截短形式。
[0021] 在本发明的其它实施方案中，经修饰的ICP10多聚核苷酸与组成型启动子可操作 地连接。适合本发明使用的组成型启动子的非限制性实例包括即早期巨细胞病毒(CMV)启 动子、SV40早期启动子、RSV LTR、β鸡肌动蛋白启动子和HSV0-TK启动子。在本发明的其它实 施方案中，取代至少部分内源性ΡΚ结构域(或ΤΜ结构域)的多聚核苷酸包含与其可操作地连 接的调节序列。在具体实施方案中该调节序列在真核细胞中可操作，在其它方面中在癌细 胞中是可操作的。用于实施本文所述的方法和组合物的非限制性示例性启动子可以包括肿 瘤特异性启动子和/或组织特异性启动子，如前列腺特异性抗原(PSA)启动子、激肽释放酶2 启动子、probasin启动子（用于前列腺癌）、L-plastin启动子（用于乳腺癌、卵巢癌和结肠 癌）、甲状腺球蛋白核心启动子（用于甲状腺癌）、Midkine和环氧化酶-2启动子（用于胰腺 癌），以及用于大多数癌症的人的端粒酶启动子(hTERT)。
[0022] 在其它实施方案中，提供在第一细胞和第二细胞之间产生融合的方法，其包含通 过向第一细胞引入本发明的组合物使第二细胞膜与第一细胞膜融合的步骤。在具体实施方 案中，所述第一细胞，第二细胞或第一和第二细胞都是恶性细胞，如实体瘤中的细胞。适合 用来实施本文所描述的方法和组合物的恶性细胞的非限制性实例可以包括乳腺癌细胞、肺 癌细胞、皮肤癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、脑癌细胞、肝癌细胞、甲状腺 癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、脾癌细胞、白血病细胞和骨癌细胞。
[0023] 在具体实施方案中，所述引入步骤被进一步定义为向人递送病毒，例如通过向人 全身性地递送病毒。非限制性的给药途径可以包括将本文所描述的组合物通过静脉内、月中 瘤内、腹膜内或任何其组合给予。在具体实施方案中，该组合物被引入大量的细胞。
[0024] 在其它实施方案中，提供破坏恶性细胞的方法，如存在于人体内的恶性细胞，其包 含将本发明的组合物引入细胞的步骤，其中在所述引入之后，恶性细胞的胞膜与另一细胞 膜融合。
[0025] 在本发明的其它实施方案中，有包含本发明组合物的哺乳动物细胞。该哺乳动物 细胞可以是正常的淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤性细胞，或是任何可以作为载体将本发明 组合物送至肿瘤细胞的细胞类型。
[0026] 在本发明的其它实施方案中，本文所述的经修饰的HSV-2病毒或病毒载体诱导感 染该病毒的癌细胞发生凋亡。在本发明的其它实施方案中，未感染病毒的旁观细胞被诱导 凋亡，而非感染了本文所述的经修饰的HSV-2病毒的周围细胞。
[0027] 在本发明的其它实施方案中，本文所述的病毒或病毒载体包含部分用于测定病毒 溶解细胞和或形成合胞体的效力的体系。该体系包含与本文所述的病毒或病毒载体接触的 细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以是真核细胞，如原发的癌细胞，或来自癌细胞系的 细胞。在其它实施方案中，所述细胞可以是作为本文所述的病毒或病毒载体的宿主的原核 细胞。在本发明的其它实施方案中，还含有病毒或病毒载体的所述细胞可以在体外培养。在 本发明的其它实施方案中，还含有病毒或病毒载体的细胞被置于动物中，如小鼠。在本发明 的其它实施方案中，所述癌细胞能够在接触病毒或载体之前被移植到动物中。
[0028] 前述内容相当广泛地概述了本发明的特征和技术优势以便更好地理解以下对于 本发明的具体描述。本领域技术人员会理解所公开的概念和具体实施方案可以容易地被用 作为了实现本发明同样目的而修饰和设计其它结构的基础。本领域技术人员也会理解这些 等价结构不脱离如所附权利要求中阐述的本发明的精神和范围。当连同所附实施例和附图 考虑时，那些关于其组织和操作方法的被认为是本发明特点的新特征以及进一步的目的和 优势将通过以下描述更好地被理解。然而，应当清楚地理解，仅出于说明和描述的目的提 供每一实施例和附图，而不旨在作为对本发明限制的阐述。
[0029] 附图简述
[0030] 图1A-1C显示Fus0n-H2的构建方案。图1A. HSV-2基因组的图示。基因组由灰色条代 表，末端重复(TR)和内部重复（IR)由灰色方框表示。也显示了 ICP10基因的位置。图1B.放大 的ICP10基因视图，显示了PK和RR1结构域及天然启动子的位置。图1C.随后被插入病毒基因 组以构建Fus0n-H2的经修饰的ICP10基因。如图，PK结构域被EGFP基因取代（与RR基因符合 读框），基因的原始启动子被最强的哺乳动物基因启动子之一的巨细胞病毒即早期启动子 取代。标出了在未修饰和已修饰的ICP10位点中的BamHI限制性酶切位点。被标记为PKL、PK、 GFP和PKR的方框表示用于图2Southern杂交的4个探针将会杂交的位置。
[0031 ] 图2显示对Fus0n_H2的Southern印迹分析。Southern印迹杂交显示了来自亲本野 生型HSV-2(w)或Fus0n-H2(m)的BamHI酶切的病毒体DNA。用于Southern杂交的四个探针是： 从左翼制备的PKL;从PK结构域制备的PK;从右翼区域制备的PKR;从EGFP基因制备的GFP。
[0032] 图3显示使用抗GFP mAb对Fus0n_H2进行的western印迹分析。细胞裂解液由感染 了 Fus0n-H2(m)或其亲本野生型HSV-2(w)的Vero细胞，或转染了 pSZ-EGFP质粒DNA(p)的 Vero细胞制备。
[0033]图4显示培养细胞中Fus0n_H2的表形特征。细胞以O.Olpfu/细胞感染所标明的病 毒或未被感染。显微照片为感染后24小时拍摄的。合胞体为白色箭头所示。在被检测的细胞 中，MDA-MB-435是人乳腺癌细胞系，MPans-96是人胰腺癌细胞系，以及SK0V3是人卵巢癌细 胞系。原始放大倍率:200倍。
[0034]图5A-C显示Fus0n-H2的选择性复制。图5A.Vero细胞被保持处于完全周期状态 (10%FBS)，或在以lpfu/细胞被病毒感染前血清饥饿24小时。在所标明的时间点收集细胞， 病毒产量通过对单层Vero细胞进行空斑分析进行定量。图5B. Vero细胞在仅含低比例血清 (2%)的培养基中孵育或在病毒感染期间存在50μΜ PD98059下孵育。在感染后24小时和48 小时收集细胞。病毒复制的下降倍数通过用不含TO98059的孔中的总病毒产量除以含有药 物的孔中的总病毒产量计算而得。图5C.用标明的病毒以lpfu/细胞感染体外培养的原代肝 细胞。感染后在标明的时间收集病毒并通过对单层Vero细胞的空斑分析进行定量。*p〈 0.01，Fus0n