马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及其应用
【技术领域】
[00011本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及 其应用。
【背景技术】
[0002] 马氏珠母贝（Pinctada martensii)是我国人工海水育珠的主要珍珠贝之一，近年 来因沿海水质的日趋恶化，各种病害也频繁发生，导致马氏珠母贝因病害发生大量死亡，对 我国珍珠产业造成了巨大的经济损失。因此，了解马氏珠母贝免疫机制并在此基础上提高 马氏珠母贝抗胁迫能力是目前亟需解决的问题。
[0003] 无脊椎动物，不具备高等动物的特异性免疫系统，所以对于天然免疫分子超氧化 物歧化酶(S0D)在体内发挥免疫功能十分重要。超氧化物歧化酶能够清除机体内的自由基 (〇 2勹，维持自由基生成与清除之间的失衡。超氧化物歧化酶一般为二聚体或四聚体，分子量 在20 kDa~80 kDa之间。大量的研究发现超氧化物歧化酶在一些疾病如炎症、自身免疫性 疾病、辐射以及抗衰老等有治疗作用。近年来，国内外对超氧化物歧化酶的研究逐渐增多， 相对起脊椎动物，在贝类仅有少数物种如海湾扇贝、太平洋长牡蛎以及缢蛏等的超氧化物 歧化酶被研究。对于马氏珠母贝，还未见超氧化物歧化酶的报道研究，研究马氏珠母贝的超 氧化物歧化酶不仅可以了解马氏珠母贝的免疫机制，做到疾病防治，还间接对人类的生活 有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶 PmECSOD〇
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因。
[0006] 本发明的另一个目的是提供马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的： 一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或 SEQ ID N0:3所示。SEQ ID N0:2所示序列为PmECSOD基因的DNA全长序列，全长1846bp，包含 42bp的5'UTR和382bp的3'UTR。SEQIDN0:3所示序列为PmECS0D基因的开放阅读框序列，开 放阅读框1422bp，编码473个氨基酸。
[0009] 目前对S0D研究的比较多的主要是它能清除机体中的自由基，治疗由自由基引起 的一些疾病，如抗衰老、抗肿瘤以及一些炎症等，而有少量的报道中有发现CuZnSOD具有参 与活化抗菌肽和溶酶菌的作用。本发明发现马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD具有抑制 大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用。因此本发明要求保护马氏珠母贝超氧化物歧化酶 PmECSOD在抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长中的用途。
[0010]另外，本发明设计了一对检测如上所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因 的荧光定量引物，用于分析马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因在各组织中的表达情 况，因此本发明要求保护一对检测如上所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的荧 光定量引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4~5所示。
[0011] 本发明还保护包含SEQ ID N0:2或3所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因 的重组载体。本发明还保护包含如上所述重组载体的重组菌。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明首次从马氏珠母贝血清中分离纯化获得一种新的超氧化物歧化酶，该酶有3个 结构域，分别是FRI(Frizzled)结构域，IGc2(免疫球蛋白）结构域和S0D_Cu结构域，但是在 Blastp中能比对上的只有S0D_Cu结构域，初步判断为一种新的S0D。另外发明人通过研究发 现马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD具有抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用。
[0013] PmECSOD在组织中表达含量与其它物种的ECS0D截然不同，它在闭壳肌、外套膜、肝 胰腺、鳃、性腺和血液中均有表达，鳃是PmECSOD的主要表达场所;然后是外套膜、血液和性 腺，这三者含量差不多;表达量最少的是肝胰腺和闭壳肌。用灭菌后的大肠杆菌和藤黄微球 菌刺激后，PmECSOD在血细胞各时期的含量都不相同。刺激之后4 h，PmECS0D的含量降低，之 后8 h升高少许，从8 h之后又开始降低，直到36 h含量开始回升，一直到48 h，PmECS0D的含 量达到最大值，与其它时间段有明显的差异。根据一些研究，可以推测，当某种物种受到外 界物（如细菌、真菌和寄生虫等）刺激时，活性氧R0S开始大量聚集，吞外来物质，大量的 R0S可能通过一些调控因子调控ECS0D的表达，产生的ECS0D与过量的R0S作用，防止过量的 R0S对机体造成伤害。
【附图说明】
[0014] 图1为马氏珠母贝血清用Sunfire?半制备型C18柱分离所得色谱图，收集有抑菌 活性的目的峰用"**"标注。
[0015] 图2为目的峰用分析型Vydac C18柱进一步分离纯化，收集有抑菌活性的峰用C1标 示对应的洗脱液做结构分析。
[0016] 图3为马氏珠母贝血清分离组分对藤黄微球菌和大肠杆菌生长抑制图。
[0017] 图4为PmECSOD肽段的质谱图。
[0018] 图5为PmECSOD基因的中间片段电泳图;M: Marker; 1: PmECSOD中间片段产物。
[0019] 图6为PmECSOD基因 RACE-PCR产物琼脂糖凝胶电泳;M: Marker ; A-1: 3' RACE产 物；B-2: 5' RACE产物。
[0020] 图7为马氏珠母贝PmECSOD的CDNA序列及氨基酸序列功能位点预测；图中的0RF区 域用大写字母表示，5'UTR和3'UTR用小写字母表示，PmECSOD的保守结构域用黑框表示，双 横线代表多聚A加尾信号，粗线代表测序得到的氨基酸。
[0021 ] 图8为SMART在线分析PmECSOD序列结构域结果图。
[0022]图9为PmECSOD的氨基酸序列与其它物种的ECS0D的氨基酸序列的比对分析。
[0023]图10为以NJ法构建的PmECSOD家族成员氨基酸序列系统进化树。
[0024]图11为PmECSOD基因表达定量分析;横坐标为组织，纵坐标为五次重复所得平均值 土标准偏差。
[0025] 图12为细菌刺激后PmECSOD基因在马氏珠母贝血淋巴的时序表达;差异显著0.01 <P〈0.05用星号表示，P〈0.01用两个星标示;纵坐标为平均值土标准偏差(n=3)。
【具体实施方式】
[0026]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0027] 实施例1 1、马氏珠母贝的诱导与血清的收集:马氏珠母贝饲养三天后，将灭活大肠杆菌和藤黄 微球菌注入马氏珠母贝的闭壳肌内进行诱导，每只注射10yL灭活大肠杆菌和20yL灭活藤黄 微球菌，重新放入海水中饲养12h后用无菌的注射器从马氏珠母贝的闭壳肌处收集血淋巴， 4°C，3000 rpm离心15min，取上清，冷冻干燥得马氏珠母贝的血清干粉。
[0028] 2、马氏珠母贝血清的分离纯化：用SunFire?半制备型C18柱分离纯化马氏珠母贝 血清，得到结果如图1所示，本轮洗脱共四个浓度梯度（5%乙腈、18%乙腈、40%乙腈和60%乙 腈），经抑菌检测发现第ΙΠ 梯度（即40%乙腈)洗脱的物质具有抗菌活性（图1中星号**表示）， 将该组分收集起来。该组分经分析型反相色谱柱C18分离，结果见图2。由图2可见，有抗菌活 性的组分中成分复杂，共收集超过20种洗脱峰。经冷冻干燥后分别进行抑菌活性检测。其中 有抗菌活性的组分标记为C1 (见图2)，收集并冷冻干燥后做进一步研究。
[0029] 采用酶标仪法，对照组去离子水，实验组为上述经HPLC分离后的组分，样品浓度为 100 yg/mL。以马氏珠母贝血清组分对藤黄微球菌和大肠杆菌的抑制作用为例，结果如图3 所示。A图为藤黄微球菌在加入样品后0和12小时所测得的0D值，由图3A可见，加入马氏珠母 贝血清组分后，藤黄微球菌的生长受到明显抑制(P〈〇.05);同时，马氏珠母贝血清组分对大 肠杆菌的生长液产生明显抑制作用(P〈〇.〇5)(图3B)。抑菌试验证明组分C1对藤黄微球菌和 大肠杆菌具有抑制作用。
[0030] 3、马氏珠母贝血清抗菌活性蛋白的质谱分析:将步骤2分离获得的抑菌活性成分 C1运用MALDI-T0F/T0F 5800质谱仪进行活性蛋