白的分子量鉴定；采用二级质谱结合De novo测序技术分析蛋白经胰蛋白酶酶解后的片段的氨基酸序列。经过质谱测序得到的Cl组 分的质谱图见图4。将测得的氨基酸序列在NCBI中进行同源比对，发现组分C1与超氧化物 歧化酶的相似度极高，分别在NCBI的蛋白质数据库以及马氏珠母贝基因组筛选超氧化物歧 化酶同源序列，以得分最高的同源序列为模板设计扩增C1组分中间片段、5' RACE和3' RACE扩增引物。扩增引物序列如表1所示。
[0031 ] 4、提取马氏珠母贝血细胞总RNA，利用RT-PCR方法得到Cl组分基因的中间片段为 1342 bp(图5)，再根据中间片段的基因设计3 ' RACE和5 ' RACE的特异性引物(表1 )，通过RACE 技术获得1089 bp的3'端核苷酸序列（图6中的A)和137bp的5'端核苷酸序列（图6中的B)。最 终获得C1组分基因的cDNA序列全长，总长为1846bp。根据该cDNA所编码的蛋白质氨基酸序 列与质谱测的的肽段进行比对，最终确定该活性组分的全部氨基酸序列。通过序列分析，发 现C1组分是一种新的超氧化物歧化酶，将C1组分命名为马氏珠母贝超氧化物歧化酶 (PmECSODhPmECSOD基因的DNA全长为 1846 bp(序列如SEQ ID N0:2所示），包含42 bp的5' UTR和382 bp的3'UTR，开放阅读框为1422 bp(序列如SEQ ID N0:3所示），编码473个氨基酸 (序列如SEQ ID N0:1所示）。3'17^末端有加尾信号序列AATAAA和poly(A)尾巴。
[0032] 5、马氏珠母贝PmECSOD的cDNA序列及氨基酸序列功能位点预测结果见图7。 PmECSOD蛋白理论分子量(MW)为49.6 KDa，等电点pi为8.62;在N-末端含有20个氨基酸的信 号肽，而一般的CuZnSOD是没有信号肽的，这说明PmECSOD属于胞外型CuZnSOD，因此直接命 名为PmECSOD。对于贝类的CuZnSOD来说，大部分研究的是胞质型CuZnSOD，目前在贝类中仅 有太平洋长牡蛎和海湾扇贝中有发现胞外型CuZnSODCECSODhPmECSOD氨基酸序列中包含3 个N-糖基化位点，2个酰胺化位点，4个CAXX盒，6个微体C-末端定位信号序列，4个酪蛋白Π 磷酸位点，6个PKC磷酸位点和15个肉豆蔻酰化位点。其中氨基酸序列含有2个典型的铜/锌 超氧化物歧化酶信号序列，分别位于氨基酸359~369这一段，氨基酸特征是：[6八]_ [MFAT ] -H- [ LIVF ] -H- [ S ] -X- [GP ] - [ SDG ] -X- [ STAGDE ];马氏珠母贝 PmECSOD氨基酸所含的 特征序列是:GFHIHEYGGME;还有453~464这段，氨基酸特征是:G-[GNHD]-[SGA]-[GR]-x-R-x-[SGAWRV]-C-x(2)-[ IV]而马氏珠母贝CuZnSOD氨基酸所含的特征序列是:GNAGTRIACCTI。 [0033] 6、PmECS0D基因的开放阅读框编码生成的蛋白共有473个氨基酸，其中信号肽有20 个氨基酸，成熟肽有453个氨基酸。从SMART main page中获得结构域，如图8所示，图中显示 它有3个结构域，分别是FRI(Frizzled)结构域，IGc2(免疫球蛋白）结构域和S0D_Cu结构域。 但是在b las tp中能比对上的只有S0D_Cu结构域，初步判断为一种新的S0D。
[0034] 将PmECSOD和其它物种进行同源序列比较，结果如图9所示。PmECSOD和其他物种的 相似度很低，与斑马鱼（D. rerio)的相似度是37.01%，与果蝇（0.11&81^&)的相似度是 40.52%，与智人(H. sapiens)的相似度是19.9%，与太平洋长牡蛎(C.gigas)和海湾扇贝（A. irradians)相比，相似度依然很低，分别是28.32%和36.4%。
[0035] 运用MEGA 6.0软件(Neighbor-Joining法)建立进化树。由于PmECSOD的结构域与 其它物种的ECSOD有一些差别，进化树的建立结果如图10,图中显示进化树主要分为两大分 支，PmECSOD与太平洋长牡蛎在同一支上，而包永波研究的海湾扇贝ECS0D却在另外一分支 上。由此可以说明ECS0D这种超氧化物歧化酶除了少部分序列保守外，不同物种，它们的氨 基酸有明显的差异。
[0036] 实施例2 1、马氏珠母贝PmECSOD的组织差异表达分析:取10只成年马氏珠母贝做组织差异表达 分析，所取的组织包括闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃、性腺以及血细胞，分别提取它们总RNA， 反转录成cDNA，用于组织特异性表达分析。根据马氏珠母贝PmECSOD基因的保守序列，设计 荧光定量引物，所用的内参是GAPDH。荧光定量分析用的引物见表2。
[0037] 荧光定量结果如图11所示，最高的表达组织是鳃，约为血液的2.9倍，具有统计学 差异(P〈0.05);其次是肝胰腺约为血淋巴的0.29倍，也具有显著差异(P〈0.05);而外套膜和 性腺约为血液的1.15倍和0.67倍。最低的是闭壳肌，约为血液的0.11倍，具有显著的差异(P <0.05)； 马氏珠母贝的PmECSOD在组织中表达含量与其它物种的ECS0D截然不同，它在闭壳肌、 外套膜、肝胰腺、鳃、性腺和血液中均有表达，鳃是PmECSOD的主要表达场所;然后是是外套 膜、血液和性腺，这三者含量差不多；表达量最少的是肝胰腺和闭壳肌。这与同为贝类的海 湾扇贝有明显的差异，海湾扇贝超氧化物歧化酶(AiECSOD)在血细胞中表达量最高，鳃中较 低，性腺和外套膜中几乎没有。Gonzalez等研究太平洋长牡蛎的ECS0D在血循环系统和细胞 间隙中发现。与脊椎动物小鼠相比，也有所不同，Folz等发现小鼠的肺和肾中含有很多 ECS0D，而在骨骼肌中没有检测到。可见不同的物种，ECS0D在组织中的含量各不相同，就算 是同一物种，不同的组织表达含量也是有差别的。
[0038] 2、细菌刺激之后PmECSOD的mRNA在血细胞中的时序表达:取暂养3天的健康马氏珠 母贝140只，分2组:细菌刺激组、PBS对照组，每组60只贝。采用从闭壳肌注射的方法，以灭活 的大肠杆菌和藤黄微球菌进行诱导，每只注射l〇yL灭活的大肠杆菌和20yL灭活的藤黄微球 菌，实验期间，不投喂饵料，整个实验过程未引起死亡。注射后的0 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48h，各组分别取5只贝作为各时间点样品。每个时间点中的5只贝分别取等量的血液，取 好的血清800 g离心5 min后，去上清，加1 mL Trizol，用枪吸打使其重新悬浮，提取总RNA 并反转录成cDNA，用于荧光定量分析。荧光定量分析的引物同表2。
[0039] 用灭菌后的大肠杆菌和藤黄微球菌刺激后，PmECSOD在血细胞各时期的含量都不 相同（见图12)。诱导48h之后，PmCuZnSOD的表达量最高，与空白对照组比较之后，发现是对 照组的27.9倍(P〈0.01)，表现为极显著差异；而诱导16h时，PmECSOD在血细胞中表达量最 低，约为对照组的0.22倍(P〈0.05)。
【主权项】
1. 一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。2. -种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO: 2或3所示。3. 权利要求1所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD在抑制大肠杆菌和藤黄微球菌 生长中的用途。4. 一对检测权利要求2所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的荧光定量引物， 其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:4~5所示。5. 包含权利要求2所述马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的重组载体。6. 含有权利要求5所述重组载体的重组菌。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD及其应用。马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示；马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:2或3所示。马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD相比于传统的SOD，具有很多区别，初步鉴定是一种新的SOD，而且本发明的马氏珠母贝超氧化物歧化酶PmECSOD具有抑制大肠杆菌和藤黄微球菌生长的作用。具有良好的应用前景。
【IPC分类】A61P31/04, C12Q1/68, C12N9/02, C12N15/11, C12N15/53
【公开号】CN105483094
【申请号】CN201610077049
【发明人】梁海鹰, 朱家萍, 雷倩楠, 吴羽媛, 王志新
【申请人】广东海洋大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年2月3日