一种高纯度胰激肽原酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种高纯度胰激肽原酶的制备方法，属于胰激肽原酶提取制备技术领域。
【背景技术】
[0002]胰激肽原酶，又称血管舒缓素或胰激肽释放酶，是一类内切型蛋白水解酶，它是从猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。
[0003]胰激肽原酶在药理和临床上的功用主要为:作为扩张血管改善微循环作用的周围血管扩张药、激活纤溶酶、抑制磷脂酶A2、具有降低血粘度，以及防止血小板聚集、防止血栓形成等作用。其主要用于微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病及缺血性脑血管病的治疗，也可用于高血压病的辅助治疗。
[0004]现有胰激肽原酶的纯化方法一种是使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离;或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖上，并分离之，但是该方法离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备;另外一种纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之，但是该方法不能够使产品在洗脱过程中除去不需要的杂质。
[0005]另外，国家卫生部批转作为生化药品执行部颁药品最初标准规定:胰激肽原酶系猪胰中提取的蛋白酶，干品效价每Img不得少于50单位，比活不得少于300单位/mg蛋白。直至2006年国家药典委员会对该标准进行了修订，增加了纯度指标，规定供口服用胰激肽原酶的纯度不得低于65%。这一指标的制定从一定程度上提高了对胰激肽原酶的品质要求，但是目前国内生产胰激肽原酶工艺水平不高，产品纯度所能达到的程度不均衡，质量稳定性差，因此在制定纯度限度要求时，对纯度要求只有65%。最新发布的中国药典2010版中将胰激肽原酶作为新品种收录其中，对纯度要求做了修订，胰激肽原酶的纯度要求也仅提高JlJ70% ο
【发明内容】
[0006]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统方法在纯化胰激肽原酶的过程中，虽然能够使得胰激肽原酶得到纯化，但是还是存在工艺水平不高，产品纯度所能够达到的程度不均衡，质量稳定性差，导致无法达到国家指标的现状，提供了一种利用茶籽提取液和腐殖质污泥混合、经过滤得过滤液，放入茶籽麸中蒸煮、挤压制成茶籽麸饼，随后收集猪胰腺和口水，待混合后程序升温，并依次与茶籽麸饼进行混合，混合过程中逐渐加量，并使用不同浓度的去离子水和氯化钠分别进行三次淋洗，随后收集淋洗液，通过氢氧化钠调节PH值后，加入乙醇过滤，最终将得到的滤液进行抽滤，干燥，从而得到高纯度胰激肽原酶的制备方法。本发明操作简单，工艺水平高，不仅使得比活达到了850单位/mg蛋白以上，而且纯度达到了 92 %以上，达到了国家指标，适合大规模应用。
[0007 ]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)取7?1cm厚的农村河道淤泥7?8kg，放置在干燥机中，在65?70°C下干燥处理，当河道淤泥中含水量为10?15%时，停止干燥，取出放入容器中，置于阴凉处自行冷却至室温，并使其上下分层，之后用刮刀轻轻刮去上层4?8cm后的河道淤泥，得下层河道腐殖质污泥；
(2)取500?600g干燥无霉菌的茶籽，放入清水中反复清洗，去除表面残留污物后，平铺在铺有纱布的钢筛中，置于干燥机中，在温度为100?105°C下干燥处理15?25min，使得茶籽含水量为3?5%，再将干燥后的茶籽放入烧杯中，加入800?100mL质量浓度为75%的乙醇溶液，混合均匀，置于超声振荡仪中，设置超声振荡频率为20?25KHz，超声功率为100?150W，超声振荡反应I?3h，过滤，得滤液；
(3)将上述得到的滤液放入索式抽提器中，抽提50?55min，得滤液抽提液，再将得打的滤液抽提液放入蒸馏装置中，在55?65°C下水浴加热35?40min，去除乙醇，得到茶油提取物；
(4)将上述得茶油提取物放入容器中，向其中加入上述步骤(I)得到的河道腐殖质污泥，以500?600r/min的转速搅拌20?30min，使其完全混合均匀，得混合物，随后将得到是混合物放入高速离心机中，在1200?1500r/min的转速下离心处理40?45min，去渣，得上清液；
(5)再取500?600g干燥无霉菌的茶籽，放入清水中反复清洗，去除表面残留污物后，平铺在铺有纱布的钢筛中，放置于太阳光下翻晒，其中每隔2h翻晒一次，直至茶籽含水量为8?12%为止，随后将翻晒后的茶籽放入锅中，在45?55°C下翻炒30?60min，待翻炒完毕，将炒后的茶籽送入螺旋挤出机中进行挤压、排油，得茶籽麸；
(6)将上述步骤(4)得到的上清液加入到上述得到的茶籽麸中，以300?450r/min的速度搅拌10?15min，使其完全混合，随后将混合后的物质放入蒸锅中，在90?100°C下蒸煮30?35min，待蒸煮结束，自行冷却至室温，并移入挤压机中挤压成直径为10?15cm的圆形茶籽麸饼；
(7)取400?800g新鲜冷冻猪胰腺洗净，用清水反复搓洗后，置于打浆机中，打浆3?5min，得猪胰腺浆，随后将得到的猪胰腺浆置于烧杯中，并向烧杯中加入猪胰腺浆质量60?65%的人体唾液，用搅拌棒充分混合均匀，在搅拌过程中，以5?6°C/min的速率程序升温至58?65°C时，停止搅拌，得混合物；
(8)将上述混合物进行过滤，得滤液，随后取5?30%的滤液放入容器中，向其中加入55?65g上述步骤(6)得到的圆形茶籽麸饼，搅拌浸泡15?ISmin后取出，用去离子对其进行淋洗，使得PH值为6?8，收集淋洗液I，再取30?40 %的滤液放入烧杯中，向其中加入62?75g上述步骤(6)得到的圆形茶籽麸饼，搅拌浸泡20?25min后取出，用质量浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液淋洗3?4h，收集淋洗液2，再取30?60%的滤液放入反应釜中，向其中加入100?120g上述步骤(6)得到的圆形茶籽麸饼，搅拌浸泡25?30min后取出，用质量浓度为Imol/L的氯化钠溶液淋洗I?2h，收集淋洗液3 ；
(9)将上述得到的淋洗液1、淋洗液2、淋洗液3置于容器中，充分混合均匀，向容器中加入20?35mL质量浓度为30%的氢氧化钠溶液，调节pH值为9?10后，静置4?6h，待静置结束，再在其中加入淋洗液总体积I?2倍质量浓度为98 %的乙醇溶液，搅拌均匀后，沉淀20?22h，之后收集沉淀物放入布式漏斗中，对其抽滤，收集滤渣；
(10)将上述收集得到的滤渣放入干燥机中，在温度100?110°C下干燥处理30?45min，即可得到一种高纯度胰激肽原酶。
[0008]本发明制得的胰激肽原酶颜色为微黄色、干品效价每Img为80?95单位、比活达到了850单位/mg蛋白以上、纯度达到92%以上。
[0009]本发明的应用方法是:将本发明制得的胰激肽原酶放入医学制药机中，制成胰激肽原酶片，其中每片含量为100?120IU，食用时，配合300?350mL温开水口服即可，每天早晚一次，每次2?3片，坚持服用7?14天，可以明显感觉抵抗了得到了提高，高血压患者血压从收缩压180?185111111取降低到了 110?115mmHg，舒张压从110?118mmHg降低到了 75?79mmHg，达到了血压标准，减少了患者痛苦。
[0010]本发明的有益效果是:
(1)本发明方法独特新颖，工艺水平高，最终使得提取的胰激肽原酶纯度达到92%以上、比活达到了 850单位/mg蛋白以上，不含有杂质，达到国家标准；
(2)本发明制得的胰激肽原酶使用安全，使用后治愈率高，减少了患者的痛苦。
【具体实施方式】
[00?1 ] 首先取7?1cm厚的农村河道游泥7?8kg，放置在干燥机中，在65?70°C下干燥处理，当河道淤泥中含水量为10?15%时，停止干燥，取出放入容器中，置于阴凉处自行冷却至室温，并使其上下分层，之后用刮刀轻轻刮去上层4?8cm后的河道淤泥，得下层河道腐殖质污泥;然后取500?600g干燥无霉菌的茶籽，放入清水中反复清洗，去除表面残留污物后，平铺在铺有纱布的钢筛中，置于干燥机中，在温度为100?105°C下干燥处理15?25min，使得茶籽含水量为3?5%，再将干燥后的茶籽放入烧杯中，加入800?100mL质量浓度为75%的乙醇溶液，混合均匀，置于超声振荡仪中，设置超声振荡频率为20?25KHz，超声功率为100?150W，超声振荡反应I?3h，过滤，得滤液;将上述得到的滤液放入索式抽提器中，抽提50?55min，得滤液抽提液，再将得打的滤液抽提液放入蒸馏装置中，在55?65°C下水浴加热35?40min，去除乙醇，得到茶油提取物;将上述得茶油提取物放入容器中，向其中加入上述得到的河道腐殖质污泥，以500?600r/min的转速搅拌20?30min，使其完全混合均匀，得混合物，随后将得到是混合物放入高速离心机中，在1200?1500r/min的转速下离心处理40?45min，去渣，得上清液;再取500?