专利名称：人尿激肽原酶在制备急性冠脉疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域。具体而言，本发明涉及人尿激肽原酶的新医药用途，即人尿激肽原酶在制备治疗急性冠状动脉疾病药物中的应用。
背景技术：
心血管疾病已成为21世纪人类健康的头号杀手，其中最为凶险的是急性冠状动脉综合征(ACS)。ACS包括不稳定心绞痛和急性心肌梗塞。统计资料显示，全球每年有1700万人死于心血管疾病，其中一半以上死于急性心肌梗塞。
人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)，是从健康男性人尿中提取精制的糖蛋白，分子量约54000道尔顿，具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血液粘稠的作用。本申请人的在先专利申请“0211678 3.4人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用”公开了它的一种医药用途。本发明人经过认真研究和动物试验证明，人尿激肽原酶对急性冠状动脉疾病有明显的治疗作用。
不稳定心绞痛是心肌急剧的暂时的缺血与缺氧所引起的临床症候。急性心肌梗塞是由于冠状动脉粥样硬化、血栓形成或冠状动脉持续痉挛，使冠状动脉或分枝闭塞，导致心肌因持久缺血缺氧而发生坏死。尽快地改善心脏供血，改善冠状动脉系统的血液循环，改善心肌细胞的氧供，减少心脏的负荷和心肌耗氧量是目前临床上普遍的治疗原则。目前对心绞痛发作最有效的处置措施是含服硝酸甘油片，而硝酸甘油呈速效但短效的特征，并不能满足对心绞痛的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供人尿激肽原酶用于治疗急性冠状动脉疾病的用途，即用于制备治疗急性冠状动脉疾病的药物的用途。本发明的另一目的是提供一种用于治疗急性冠状动脉疾病的含有人尿激肽原酶的药物组合物。
本发明的人尿激肽原酶对急性冠状动脉疾病有明显的治疗作用，一般以药物组合物的形式使用。这种组合物含有治疗有效量的作为活性成分的人尿激肽原酶和可药用辅料，主要剂型包括冻干粉针剂和注射液剂，通常以静脉注射途径给药。
经静脉注射给药的人尿激肽原酶组合物，一般是固体的灭菌组合物形式。这些组合物还可以含有添加剂，特别是甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸等。在使用时溶解于灭菌注射用水或其它注射用灭菌介质中。
经静脉注射给药的人尿激肽原酶组合物也可以是水溶液形式。组合物还可以含有添加剂，特别是甘露醇、氯化钠、葡萄糖等。
人尿激肽原酶组合物治疗急性冠状动脉疾病的剂量根据病情的严重程度、治疗时间而定，一般静脉注射给药每次0.1-0.2PNA单位，每天给药1-2次。
人尿激肽原酶具有腺性激肽原酶特征，在血液中促进胰激肽生成，后者再转化为缓激肽。在下述实验中人尿激肽原酶效应长于硝酸甘油的原因，可能与此转化过程有关。缓激肽能刺激血管内皮细胞释放NO，NO与平滑肌细胞内鸟苷酸环化酶(GC)的血红素基团(heme)结合，形成NO-heme-GC复合物，使GC激活，导致细胞内产生大量的cGMP，激活cGMP依赖性蛋白激酶，使许多钙依赖性的细胞内信号转导蛋白磷酸化，细胞内钙减少，从而抑制钙介导的肌球蛋白轻链磷酸化，使血管舒张。NO不仅在决定血管张力方面发挥重要作用，而且参与许多其它调节机制，如抑制单核白细胞和血小板粘附，血管平滑肌的增殖，血管通透性和炎症机制等，从而防止血管痉挛和血栓形成。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 制备人尿激肽原酶干粉针取过滤灭菌的人尿激肽原酶150PNA单位，加7.5克甘露醇、2克右旋糖酐40、5克柠檬酸钠溶解，调节PH至中性，加注射用水至500毫升，无菌过滤，分装1000个安瓿中，无菌条件下冷冻干燥，即得。
实施例2 制备人尿激肽原酶注射液取过滤灭菌的人尿激肽原酶水溶150PNA单位，调节PH至中性，加注射用水至500毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装1000个安瓿中，即得。
实施例3 人尿激肽原酶对犬实验性心肌缺血及心肌氧代谢的影响实验方法用注射垂体后叶素法制造心肌缺血模型。选用10～15kg健康家犬24只，雌雄各半，随机分成6组空白对照组(生理盐水)；垂体后叶素组(3U/kg)；人尿激肽原酶I组(1.5×10-3PNAu)；人尿激肽原酶II组(3×10-3PNAu)；人尿激肽原酶III组(6×10-3PNAu)；硝酸甘油治疗组(5mg/kg)。垂体后叶素3U/kg在1分钟内缓慢静脉推注，人尿激肽原酶和硝酸甘油各剂量药物在注射垂体后叶素后立即静脉注射。
用戊巴比妥钠30mg/kg静脉注射麻醉，背位固定，气管切开并插管，连接电动呼吸机进行人工呼吸。描记二导联心电图，股动脉插管连接血压换能器，股静脉插管供注药用。血压、心率和心电图接八道生理记录仪监测和记录。自左侧颈外静脉插管至冠状静脉窦，定时采集心脏静脉血；右侧颈总动脉插管，定时采集心脏动脉血。
观察指标动物手术完成并观察各生理指标平稳后即开始实验。于注射药物前及注药后30秒、45秒、1分、1分30秒、2分，2分30秒、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、15分、20分、25分、30分描记心电图，测定T波的变化，用它作为判断心肌缺血的标准。同时，在注射药物前、注药后1分、3分、5分、10分、15分和30分采集心脏动静脉血进行血气分析。各指标进行组间和自身前后比较，用t检验判断其差异显著性。
实验结果1.人尿激肽原酶对家犬急性心肌缺血的治疗作用静脉注射垂体后叶素后连续描记30分钟心电图。结果表明，注射后T波即明显增高并一直持续到30分钟仍高于对照组，说明此模型是可靠的。然后采用人尿激肽原酶进行疗效观察，并与硝酸甘油进行对照，可见垂体后叶素组注射后5分钟，心电图T波波幅明显升高(以给药前T波值为100％计算)，与对照组比有非常显著差异(P＜0.01)，注射后30分钟T波值仍升高(P＜0.05)。四个治疗组注射药物5分钟后T波升高的幅度均明显减少(P＜0.05)，尤其以人尿激肽原酶III组降低最明显。静脉注药30分钟后，垂体后叶素组的T波仍比注射前升高(P＜0.05)，可见仍处于心肌缺血状态。人尿激肽原酶I、II、III组与垂体后叶素组比较，T波值有所下降，且均有显著差异(P＜0.05)。而硝酸甘油组T波值虽然下降，但与垂体后叶素组比较无显著差异(P＞0.05)。
2.人尿激肽原酶对急性心肌缺血犬心脏动静脉血气及心肌氧代谢的影响实验犬在注药前后按规定时间采集心脏动静脉血，观察血气及心肌氧代谢的变化。注射垂体后叶素后，心脏的氧摄取率比对照组显著提高，说明垂体后叶素组心肌耗氧量显著增加，证明该模型是成功的。利用此模型注射人尿激肽原酶I、II、III组三个剂量和硝酸甘油5分钟，各治疗组的心肌耗氧量虽未能下降到对照组注射前的耗氧量水平，但与垂体后叶素组比较却大大减少。人尿激肽原酶组和硝酸甘油治疗组相似，有显著降低心肌耗氧量的作用(P＜0.05)，且作用效果非常相近。人尿激肽原酶I、II、III组在注射30分钟后的心肌耗氧量比垂体后叶素组有所减少，且有统计学意义(P＜0.05)，而硝酸甘油在注射30分钟后的心肌耗氧量与垂体后叶素组比较无显著差异(P＞0.05)。
本实验表明，人尿激肽原酶对实验性心肌缺血具有保护作用，能减少缺血心肌的耗氧量。
实施例4 人尿激肽原酶对大鼠实验性心肌缺血的影响实验方法1.人尿激肽原酶对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血的影响选用健康大鼠60只，按体重随机分成6组空白对照组(生理盐水)；垂体后叶素组(6.5U/kg)；人尿激肽原酶I组(3.85×10-3PNAu)；人尿激肽原酶II组(8.75×10-3PNAu)；人尿激肽原酶III组(17.5×10-3PNAu)；硝酸甘油组(25mg/kg)。各剂量药物在注射垂体后叶素后立即尾静脉注射。大鼠腹腔注射10％水合氯醛3ml/kg麻醉，仰卧固定，将针状电极插入四肢皮下，并调节心电图灵敏度至1mv＝15mm，纸速为50mm/s，记录II导心电图，选择心电图正常动物进行舌静脉注射垂体后叶素(6.5U/kg)造成心肌缺血模型，注射速度为1min，注射后立即进行15s、30s、1min、2min、5min、10min重复记录心电图(可据示波器所见异常情况随时记录)。实验结束后，测量比较给药前、后规定时间S-T段和T波高度及心率的变化。
2.人尿激肽原酶对结扎冠状动脉所致大鼠急性心肌缺血的影响取体重200g±40g的雌性健康Wistar大鼠50只，按体重随机分成5组缺血对照组(生理盐水)；普萘洛尔组(5mg/kg)；人尿激肽原酶I组(3.85×10-3PNAu)；人尿激肽原酶II组(8.75×10-3PNAu)；人尿激肽原酶III组(17.5×10-3PNAu)。于给药后1h腹腔注射10％水合氯醛3ml/kg麻醉，记录正常心电图。沿左锁骨中线纵行切口，打开胸腔，在心脏右侧圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，缝合关闭，呼吸机辅助呼吸。结扎后即刻、1h、24h、48h分别描记一段心电图，并于24h、48h静脉注射各组药物及生理盐水。在冠脉结扎50h后断头取血，测定血清CPK、LDH，并于断头取血后迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。沿冠状沟切除心房，留下心室，称重，顺房室沟从心尖到心基部平行将心室肌横切成厚约0.1cm的心肌片4片，用生理盐水冲洗干净，将心肌片放在0.1％的N-BT溶液中，在37℃水浴条件下染色15min，立即用水洗去多余染料。梗死区不着色，非梗死区被N-BT溶液染成蓝色。剪去梗死心肌，称湿重，以梗死区湿重占全心湿重的百分比表示心肌梗死范围。
实验结果1.人尿激肽原酶对垂体后叶素引起S-T段、T波改变的影响对照组于注射垂体后叶素15S左右T波及ST段抬高最为明显，T波最高可达0.45mv、S-T段最高可达0.29mv，表明大鼠急性心肌缺血模型是成功的。人尿激肽原酶I、II、III组及硝酸甘油组T波、S-T段抬高幅度显著低于对照组水平(P＜0.01)；人尿激肽原酶I组较硝酸甘油作用为差(P＜0.05)，而人尿激肽原酶II、III组与硝酸甘油组作用相似(P＞0.05)。
2.人尿激肽原酶对冠状动脉结扎心肌缺血大鼠心电图的影响结扎大鼠冠状动脉造成缺血模型，可见ST段弓背上抬，T波逐渐高耸；少数动物先见ST段下移之后又上抬，整个缺血期缺血性ST-T变化非常显著。普萘洛尔组、人尿激肽原酶I、II、III组ST段抬高显著低于模型组(P＜0.01)，但各组间无显著差异(P＞0.05)。
3.人尿激肽原酶对冠状动脉结扎心肌缺血大鼠心律失常和存活率的影响结扎冠脉后各组动物均有心律失常者，以室性异位心律为主，包括室性早搏、阵发性室性心动过速和纤维颤动，其中以空白对照组发生率高且严重。空白对照组10只动物中有8只发生心律失常。其中有4只出现室颤，只有1只恢复窦性心律而继续存活，其余3只均死于室颤，另4组动物心律失常发生率明显低于空白对照组(P＜0.01)。其存活率各组相比无显著差异(P＞0.05)。
4.人尿激肽原酶对冠状动脉结扎心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响普萘洛尔组、人尿激肽原酶I、II、III组均可明显缩小大鼠心肌梗塞范围(P＜0.05)，其中普萘洛尔组优于人尿激肽原酶I、II组(P＜0.05)，与人尿激肽原酶III组无显著差异(P＞0.05)。
5.人尿激肽原酶对血清磷酸肌酸肌酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)的影响普萘洛尔组、人尿激肽原酶I、II、III组在大鼠结扎冠脉后，其血清CPK和LDH均明显低于对照组(P＜0.01)，但各组间无明显差异(P＞0.05)。
讨论心肌中的磷酸肌酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)在心肌梗塞时因缺血后膜损伤而释放入血，可用作观察心肌缺血的指标。本实验证明，人尿激肽原酶组大鼠结扎冠脉后的血清CPK和LDH含量明显低于模型组，提示人尿激肽原酶可保护心肌细胞，增加其耐缺血缺氧能力，提高膜的稳定性，CPK、LDH逸出减少，心肌梗塞范围缩小。
脑垂体后叶素能使冠状动脉痉挛，造成急性供血不足；加以外周阻力增加，导致心脏负荷加重，在心电图上可见到心肌缺血变化，主要为T波抬高、S-T段抬高或低平。当结扎动物冠脉时，心电图S-T段抬高亦为诊断急性心肌梗塞的一项重要指标。药物若能防止这种心肌缺血变化，就被认为有抗心肌缺血的价值。本实验证明，人尿激肽原酶可拮抗垂体后叶素引起的T波抬高、S-T段抬高，亦可使结扎大鼠冠脉后升高的ST段明显降低，因而有抗心肌缺血作用。其机理可能是通过扩张冠状动脉，增加冠脉流量等发挥作用。
缩小心肌梗塞后梗塞范围是评价抗心肌缺血药物疗效的主要指标。本实验NBT大体标本染色法测量心梗范围，证实人尿激肽原酶能明显缩小结扎大鼠冠脉所致急性心肌缺血的心肌梗塞范围，表明人尿激肽原酶有抗心肌缺血作用。
权利要求
1.人尿激肽原酶在制备治疗急性冠状动脉疾病药物中的用途。
2.权利要求1所述疾病临床诊断为不稳定性心绞痛。
3.权利要求1所述疾病临床诊断为急性心肌梗塞。
4.一种用于治疗急性冠状动脉疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的人尿激肽原酶和可药用辅料。
5.权利要求4所述的药物组合物是冻干粉针剂。
6.权利要求4所述的药物组合物是水溶液注射剂。
全文摘要
本发明涉及人尿激肽原酶用于治疗急性冠状动脉疾病的药物用途及按该方法制备的药物组合物。本发明的人尿激肽原酶对急性冠状动脉疾病有明显的治疗作用，通常以药物组合物配制成冻干粉针剂或注射液剂的形式使用。
文档编号A61K38/49GK1634575SQ200410088440
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者傅和亮, 苗丕渠, 孙铁, 谢永立 申请人:广东天普生化医药股份有限公司