专利名称：一种胰激肽释放酶分离纯化的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种医药原料中间体-胰激肽释放酶分 离纯化的方法。
背景技术：
激肽释放酶(kallikein)，是一种具有重要临床价值的生化药物，具有舒展毛细血 管和小动脉的作用，在临床上常用来治疗高血脂，防治脂肪肝、动脉粥样硬化、高血压、心绞 痛等多种疾病。目前全球胰激肽释放酶的生产厂家仅有二十多家，大部分分布在我国境内，其中 包括北京恒业中远化工有限公司、重庆创龙经贸有限公司等11家公司。市场上现有的胰激 肽释放酶产品主要是从猪胰脏中提取，然而，以猪胰脏为原料提取胰激肽释放酶对环境污 染较大，能耗以及物耗较高，随着国家对环境以及节能减排的要求日益严格，以猪胰脏作为 提取原料势必被淘汰。尽管已有实验室报道成功构建了人组织激肽释放酶的真核表达系统 和原核表达系统，但由于其存在表达量低、产物活性低等缺点，至今仍主要依靠实验室理论 研究。因此，越来越多企业开始致力于转向利用胰酶粉为原料提取胰激肽释放酶工艺路线 的研究，同时联产胰蛋白酶以及糜蛋白酶等。国际上基于胰激肽释放酶的研究大多采用阴离子交换结合阳离子的方法，利用离 子交换树脂分离纯化胰激太释放酶仍是目前最具产业化应用前景的一种分离方法。然而， 利用离子交换树脂分离纯化激肽酶最大的问题之一是色素类物质以及油脂类物质对树脂 的污染，降低了树脂的使用寿命。对于该问题，目前多采用高速离心除去大颗粒物质后用活 性碳对其进行脱色的方法予以解决。实验表明利用活性碳对浸提液进行脱色，效果并不理 想，同时，浸提液中含有一定量油脂，活性碳无法对其进行脱除。我国发酵工业发展迅速，每年发酵工业在消耗粮食的同时，也产生了大量的发酵 菌丝体。菌丝体除啤酒和白酒行业产生的菌丝体主要作为饲料或用于制取酵母粉外，其他 菌丝体在应用方面都存在一定问题，如青霉素发酵菌丝体中含有青霉素，制成饲料可增加 畜禽的抗药性，欧盟和美国都已明确规定青霉素菌丝体不能作为饲料添加剂。此外，将柠檬 酸发酵菌丝体制成饲料会容易引起畜禽产生脱毛现象等，目前欧盟和美国也禁止将其作为 饲料添加剂。这导致了发酵工业产生大量的废弃菌丝体污染物，正是这个原因，国外主要发 达国家纷纷将这些发酵工业转移到发展中国家。目前，我国将发酵工业废弃菌丝体部分作 为饲料添加剂(如酵母、青霉素菌丝体、谷氨酸菌丝体等)，以补充氮源。其他一些菌丝体如 有机酸菌丝体则主要是废弃。这不但是资源的巨大浪费，亦将造成环境的严重污染。本发明探究采用菌体对胰酶粉浸提液进行脱色除脂，脱色效果明显高于活性碳， 同时油脂类物质也被菌体所吸附，降低了色素以及油脂类物质对树脂的污染，提高了树脂 的使用寿命，同时也降低了胰激肽释放酶的分离成本。该技术目前还未有文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种胰激肽释放酶分离纯化的方法，主要是利用产富马酸根 霉菌废弃菌体对胰酶粉浸提液中色素和油脂进行脱除的方法。本发明的目的可以通过以下措施达到一种胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，该方法利用根霉菌发酵产富 马酸得到的废弃菌体经碱处理后，再加入胰酶粉浸提液中进行吸附反应，从而对胰酶粉浸 提液脱色除脂。本发明所述的废弃菌体是将根霉菌经培养得到的菌球进行富马酸发酵结束后，纱 布过滤得到的。 所述的碱处理是将废弃菌体在0. 2 2. Qmol/LNaoH溶液中煮沸后保持20 30min， 纱布过滤取出菌体，用去离子水洗至中性，得到产富马酸根霉菌废弃菌体。碱处理使根霉菌菌 体在碱性环境下结构发生变化，使菌体更利于对胰酶粉浸提液中色素以及油脂的吸附。所述的吸附反应采用的PH4. 5 7. 5，优选PH5. 5 6. 0 ；温度4 10°C，优选为 6 8°C ；吸附时间为1 12h，优选为6 8h。经碱液处理后得到的产富马酸根霉菌废弃 菌体的直径为0. 5-2. 0mm，优选为1. 0-1. 5mm。胰酶粉浸提液中产富马酸根霉菌废弃菌体添 加量为 5g/L-20g/L，优选为 10g/L-15g/L。所述的胰酶粉浸提液的制备方法是使用去离子水溶解胰酶粉得到酶液，水和胰酶 粉的重量比为30 1 60 1，调节酶液pH4. 5 5. 5，充分混合后进行高速离心，抽取上 清液即胰酶粉浸提液。可采用lmol/L乙酸以及NaOH溶液调节酶液pH值。其中，所述的充 分混合可通过摇床对酶液进行充分混合，摇床温度4 10°C、转速100 200r/min，混合反 应时间达12 14h。高速离心为在温度为4 10°C条件下，离心速率为8000 12000r/ min，离心时间为20 30min。上述根霉菌可以是购自菌种保藏中心，也可以是按常规方法从森林树下土壤中筛 选出来，所述的产富马酸的根霉菌优选为米根霉菌或少根根霉菌这两类菌种。一种采用上述脱色除脂方法的胰激肽释放酶分离纯化的方法，该方法包括对胰酶 粉浸提液依次进行吸附反应和树脂分离纯化，其特征在于利用根霉菌发酵产富马酸得到的 废弃菌体经碱处理后，加入胰酶粉浸提液中进行吸附反应对胰酶粉浸提液脱色除脂，再通 过树脂进行分离纯化。该方法中所述的树脂为离子交换树脂；所述的离子交换树脂优选型 号为 QAE-S印hadex、DEAE-S印harose FF、Amberlite CG-50 或 Amberlite IRA-938 离子交 换树脂。可按常规方法对米根霉菌进行种子培养及发酵培养，具体培养方法可以按以下步 骤进行种子培养将根霉菌孢子悬浮液按照种子培养基 5% (v/v)的接种量接入 装有种子培养基的反应器中，置于温度为30 40°C、通气量0. 5 1. 5vvm，转速为300 500rpm，培养24 48小时后，排掉种子培养液，菌球用于发酵培养。发酵培养将灭菌后的发酵培养基倒入反应器中，置于温度为30 40°C、通气量 0. 5-1. 5vvm，转速为300 500rpm，发酵培养得到发酵培养液。上述种子培养基为pH2.0 4.0米根霉种子培养基；所述的发酵培养基为 PH5. 0-6. 0米根霉发酵培养基；其中，所述的种子培养基和发酵培养基为能提供碳源、氮源
4及无机盐的常用液体培养基。所述种子培养基具体可为葡萄糖30 50g/L，(NH4)2S04 1 4g/L，酵母膏 4 6g/L, KH2P04 0 . 6 1. Og/L, MgS04 0. 1 0. 4g/L, FeS04 0 . 00 04 0. 0008g/L, ZnS04 0 . 01 0. 03g/L, pH 2. 0-4. 0 ；所述发酵培养基具体可为葡萄糖99 150g/L, (NH4) 2S04 1 4g/L，酵母膏 0. 1 0. 6g/L，KH2P04 0. 3 0. 6g/L，MgS04 0. 3 0. 6g/L, FeS040 . 001 0. 002g/L, ZnS04 0 . 01 0. 03g/L,甲醇 10 20mL/L, pH 5. 0 6. 0。上述根霉菌孢子悬浮液为将米根霉接种于固体培养基，30 40°C培养4 6天， 待孢子成熟后，用无菌水、生理盐水、吐温溶液或磷酸盐缓冲溶液洗脱孢子，接于盛有玻璃 珠的三角瓶中，30 40°C及100 150rpm下充分振荡20 60min，过滤，即制得根霉菌孢子 悬浮液，孢子浓度控制在105 108个/ml备用。所述固体培养基为能提供碳源、氮源及无 机盐的常用固体培养基。固体培养基具体可为葡萄糖2 4g/L，乳糖4 8g/L，甘油8 14g/L, (NH4) 2S04 0. 5 2g/L，酵母膏 1. 0 5. Og/L, KH2P04 0. 3 0. 6g/L, MgS04 0. 3 0. 6g/L, FeS04 0 . 001 0. 002g/L, ZnS04 0. 01 0. 03g/L, NaCl 20 50g/L,琼脂 20g/L。此外，还可按米根霉菌种子培养方法和发酵培养方法对少根根霉进行种子培养及 发酵培养。种子培养基和发酵培养基也与米根霉种子培养基和发酵培养基相同；其中，所述 的种子培养基和发酵培养基为能提供碳源、氮源及无机盐的常用液体培养基。少根根霉菌 孢子悬浮液制备方法与米根霉菌孢子悬浮液制备方法也可相同，所用固体培养基为能提供 碳源、氮源及无机盐的常用固体培养基。以下说明本发明的主要参数筛选过程1.色素吸附过程中菌体直径大小的优化在色素吸附过程中，不同直径大小菌球 对色素去除率及油脂去除率有重要影响。因此，在色素吸附过程中，使菌体直径大小分别控 制在0. 5-1. 0mm, 1. 0-1. 5mm与1. 5-2. 0mm三个范围，进行色素吸附，来优化色素吸附过程中 菌球的直径大小。优化结果分析色素吸附过程中，菌球直径大小控制在1. 0-1. 5mm时，相同质量下 菌球的相对表面积最大，对胰酶粉浸提液中色素类物质以及油脂类物质吸附彻底。2.色素吸附过程中浸提液中菌体添加量的优化在色素吸附过程中，不同菌体添 加量对色素去除率及油脂去除率有重要影响。因此，在色素吸附过程中，使浸提液中菌体添 加量分别控制在5g/L 10g/L、10g/L 15g/L、15g/L 20g/L三个范围，进行色素吸附， 来优化色素吸附过程中浸提液中菌体的添加量。优化结果分析色素吸附过程中浸提液中菌体最优添加量为10g/L 15g/L。此 时，菌体对胰酶粉浸提液中色素类物质以及油脂类物质吸附效率达到最优值。3.色素吸附过程中对胰酶粉浸提液与菌体混合液PH值的优化在色素吸附过程 中，不同PH值对菌体吸附色素类物质以及油脂类物质有着重要影响。因此，在吸附过程中 将 PH 值分别控制在 4. 5 5. 0,5. 0 5. 5,5. 5 6. 0,6. 0 6. 5,6. 5 7. 0,7. 0 7. 5 六个范围，进行色素吸附，来优化色素吸附过程中混合液的PH值。优化结果分析上述PH值条件下均可吸附，当色素吸附混合液pH值控制在5. 5 6. 0。此时，菌体对胰酶粉浸提液中色素类物质以及油脂类物质吸附效率能够达到最优值， 于此同时，此PH值最大限度地确保胰激肽释放酶的活性与含量在脱色除脂过程保持正常 水平。4.色素吸附时间的优化在吸附过程中，不同吸附时间会影响菌体对胰酶粉浸提
5液中色素类物质及油脂类物质的吸附效果。因此，在吸附过程中时间分别控制在1 2h、 2 4h、4 6h、6 8h、8 10h、10 12h六个范围，进行色素吸附，来优化色素吸附时间。优化结果分析生物吸附时间控制在6 8h时，色素去除率高达90%以上、油脂 去除率高达85%以上，效果最明显。5.色素吸附温度的优化在吸附过程中，不同吸附温度对菌体吸附色素及油脂类 物质有所影响，同时，也会对浸提液中的胰激肽释放酶产生一定的影响。因此，在吸附过程 中将温度分别控制在4 6°C、6 8°C、8 10°C三个范围，进行色素吸附，来优化吸附温度。优化结果分析生物吸附温度控制在6 8°C时即保证了胰激肽释放酶的含量与 活性也有利于菌体对色素及油脂类物质的吸附。当温度高于10°c时，胰酶粉浸提液易变质。6.色素吸附菌体种类的优化在吸附过程中，不同类菌体对胰酶粉浸提液脱色除 脂的效率不一，但均具有明显效果。因此，本发明优选利用产富马酸的两大类菌体米根霉菌 和少根根霉菌来进行色素吸附，材料易得，使该方法具有较强的实用性与可取性。与现有技术比较本发明的有益效果采用离子交换树脂分离纯化胰激肽释放酶 时，树脂成本较高(如常用树脂型号为QAE-S印hadex、DEAE-Sepharose FF、Amberlite CG-50、Amberlite IRA-938等离子交换树脂)，而且树脂再生处理步骤繁琐，本发明在树脂 分离纯化步骤中，先采用富马酸发酵菌体对胰酶粉浸提液进行脱色除脂，在保证有效成分 胰激肽释放酶含量不损失的情况下，具有显著的脱色除脂效果，降低了色素以及油脂类物 质对树脂的污染，提高了树脂的使用寿命，同时，还大大降低针对胰激肽释放酶进一步分离 纯化的实验成本，具有良好的经济效益与现实意义。在越来越多企业开始致力于以胰酶粉 为原料提取胰激肽释放酶工艺路线的研究现状与国家对环境保护以及节能减排的大力倡 导这一大背景下，本发明作为一种高效、新型的生物吸附技术，拥有操作条件温和、环境污 染小；步骤简单、易操作；吸附效果快速、完全、操作稳定性佳等优点，在切实解决国内发酵 工业废弃菌体废物利用方面意义重大，具有较广的工业化生产前景。
具体实施例方式实施例1利用产富马酸米根霉菌废弃菌体对胰酶粉浸提液中色素和油脂进行脱除的方 法采用根霉菌种米根霉(Rhizopus 0ryZae)ME-Fll (中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为CCTCC NO :M 207066)。根霉菌种少根根霉菌(Rhizopus arrhizus) TZ-F21 (中国普 通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC NO 3. 2744)。(1)废弃菌体的获得将米根霉ME-F11或少根根霉菌TZ-F21经种子培养得到的 菌球进行富马酸发酵结束后，纱布过滤，得到所需废弃菌体。(2)废弃菌体处理将废弃菌体在0. 2mol/LNa0H溶液中煮沸后保持20 30min， 纱布过滤取出菌体，用去离子水洗至中性，放入去离子水中在温度1 ;rc条件下保存备用。(3)胰酶粉浸提液的制备去离子水溶解胰酶粉得到酶液，水胰酶粉=30 1， 用lmol/L乙酸和lmol/L NaOH溶液调节酶液pH4. 5 5. 5，通过摇瓶对酶液充分混合后，
6进行高速离心，最后抽取上清液即胰酶粉浸提液，于温度1 3°C条件下保存备用；摇床温 度10°C，转速150r/min，反应时间达12 14h ；高速离心时，在温度为10°C条件下、离心速 率为12000r/min、离心时间为20 30min。(4)色素吸附将经碱液处理后得到的产富马酸根霉菌废弃菌体加入胰酶粉浸 提液中，进行反应吸附脱色除脂。所述的胰酶粉浸提液中根霉菌废弃菌体添加量为10g/ L-15g/L ；根霉菌废弃菌体直径大小为1.0-1. 5mm;所述的吸附采用的PH5. 5 6.0 ；温度为 6 8°C ；吸附时间为6 8h。(5)离子交换树脂分离纯化。经脱色的胰酶粉浸提液进入离子交换层析柱进行离 子吸附(平衡缓冲液0.02mol/L乙酸(HOAc)溶液，pH5. 1)，吸附平衡后，用去离子水洗至 中性后，对离子交换树脂进行洗脱(洗脱缓冲液0. 5mol/L HOAc, pH5. 1)，收集胰激肽释放 酶的洗脱峰。所用树脂型号为QAE-S印hadex的离子交换树脂。以下对米根霉菌或少根根霉菌进行种子培养及发酵培养。制备根霉菌孢子悬浮液将米根霉(Rhizopus Oryzae)ME_Fll或少根根霉菌 (Rhizopus arrhizus)TZ-F21接种于固体培养基(酵母浸出汁5. 0g/L，麦芽浸出汁5. 0g/ L，蛋白胨5. 0g/L，甘油20g/L，琼脂20g/L)，35°C培养6天，待孢子成熟后，用无菌水、生理盐 水、吐温溶液或磷酸盐缓冲溶液洗脱孢子，接于盛有玻璃珠的三角瓶中，35°C及120rpm下 充分振荡50min，过滤，即制得根霉菌孢子悬浮液，孢子浓度控制在106个/ml备用。种子培养将根霉菌孢子悬浮液按照种子培养基3% (v/v)的接种量接入装有 种子培养基(葡萄糖 40g/L，尿素 3g/L，KH2P04 0. 5g/L，MgS04 0. 5g/L，FeS04 0 . 00 06g/L， ZnS040. 02g/L,pH 2.0)的反应器中，置于温度为35°C、通气量lvvm，转速为500rpm，培养24 小时后，排掉种子培养液，菌球用于发酵培养。发酵培养将灭菌后的发酵培养基(葡萄糖99. 5g/L，KH2P04 0. 5g/L，MgS04 0. 5g/ L，FeS04 0 . 001g/L，ZnS04 0 . 02g/L，pH 6.0)倒入反应器中，置于温度为 35°C、通气量 lvvm， 转速为500rpm，发酵培养得到发酵培养液。表1中数据表示在实施例1所述的条件下产富马酸米根霉菌、少根根霉菌废弃菌 体及活性炭对胰酶粉浸提液的色素去除率、胰激肽释放酶回收率、胰蛋白酶回收率、油脂去 除效率结果及实验材料循环20次后树脂吸附率，实验过程中仅改变吸附材料，其余条件均 不变，实验对照为去离子水。以下是实验材料循环20次后树脂吸附率(％ )的检测方法，并按常规方法检测胰 蛋白酶与胰激肽释放酶含量，具体检测方法可按以下步骤进行(1)胰蛋白酶的检测量取25. 0°C 士0. 5°C水浴中预热的底物溶液3. 0ml，置于1cm比色池中，精密加入 供试品200ul，混勻，立即计时，使比色池内及室温保持在25°C 士0. 5°C，在253nm处，以底物 溶液3. 0ml加0. 001mol/L盐酸溶液200ul，混勻，作为空白，每隔30秒准确读取吸光度，共 五分钟，平行测定3次。以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图。每30秒钟吸光度的改变 应恒定在0. 015 0. 018之间，呈线性关系的时间不得少于三分钟。若不符合上述要求，应 调整供试品浓度，再做测定。在上述吸光度对时间的关系图中，取成直线部分的吸光度，按
1
(p为每lmg供试品中含胰蛋白酶的量，单位成为直线上终止的吸光度；A2为直线 上开始的吸光度；T为~至A2读数的时间，分；W为测定液中含供试品的量，mg ；0. 003为在 上述条件下，吸光度每分钟改变0. 003，即相当于1个胰蛋白酶单位。)(2)胰激肽释放酶的检测量取30°C 士0. 5°C水浴中预热的底物溶液2. 5ml，置于 lcm比色池中，分别精密加入供试品溶液或标准品溶液0. 1ml，混勻，立即计时，使比色池内 及室温保持在25°C 士0. 5°C，在253nm处，以底物溶液为空白，准确读取1分钟时的吸光度 4和3分钟时的吸光度A，平行测定3次，分别求得标准品溶液和供试品溶液的AA值(AA =A-A0)的平均值，代入下式计算
权利要求
一种胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征是利用根霉菌发酵产富马酸得到的废弃菌体经碱处理后，加入胰酶粉浸提液中进行吸附反应，从而对胰酶粉浸提液脱色除脂。
2.根据权利要求1所述的胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征在于 所述的废弃菌体是将根霉菌经培养得到的菌球进行富马酸发酵结束后，纱布过滤得到。
3.根据权利要求1所述的胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征在于 所述的碱处理是将废弃菌体在0. 2-2. Omol/LNaoH溶液中煮沸后保持20-30min，纱布过滤 取出菌体，用去离子水洗至中性，得到产富马酸根霉菌废弃菌体。
4.根据权利要求1所述的胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征在于 所述的吸附反应采用的PH4. 5-7. 5，优选PH5. 5-6. 0 ；温度4_10°C，优选为6_8°C ；吸附时间 为l_12h，优选为6-8h。
5.根据权利要求1所述的胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征在于 经碱液处理后的产富马酸根霉菌废弃菌体直径为0. 5-2. 0mm，优选为1. 0-1. 5mm ；胰酶粉浸 提液中的产富马酸根霉菌废弃菌体的添加量为5g/L-20g/L，优选为10g/L-15g/L。
6.根据权利要求1所述的胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征在于 所述的根霉菌为米根霉菌或少根根霉菌。
7.根据权利要求1所述的胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征在于 所述的胰酶粉浸提液的制备方法是使用去离子水溶解胰酶粉得到酶液，水和胰酶粉的重量 比为30:1-60:1，调节酶液pH4. 5-5. 5，充分混合后进行高速离心，抽取上清液即胰酶粉浸 提液。
8.根据权利要求7所述的胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，其特征在 于所述的充分混合是通过摇床对酶液进行充分混合，摇床温度4-10°C、转速100-200 r/ min，混合反应时间达12-14h ；所述的高速离心为在温度为4_10°C条件下，离心速率为 8000-12000 r/min，离心时间为 20_30min。
9.一种胰激肽释放酶分离纯化的方法，该方法包括对胰酶粉浸提液依次进行吸附反应 和树脂分离纯化，其特征在于利用根霉菌发酵产富马酸得到的废弃菌体经碱处理后，加入 胰酶粉浸提液中进行吸附反应对胰酶粉浸提液脱色除脂，再通过树脂进行分离纯化。
10.根据权利要求9所述的胰激肽释放酶分离纯化的方法，其特征在于该方法中所述 的树脂为离子交换树脂；所述的离子交换树脂优选型号为QAE-S印hadex、DEAE-Sepharose FF、Amberlite CG-50 或 Amberlite IRA-938 离子交换树脂。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种胰激肽释放酶制备过程中脱色除脂的方法。该方法利用根霉菌发酵产富马酸得到的废弃菌体经碱处理后，再加入胰酶粉浸提液中进行吸附反应，从而对胰酶粉浸提液脱色除脂。脱色除脂效果明显高于活性碳，降低了色素以及油脂类物质对树脂的污染，提高了树脂的使用寿命，同时也降低了胰激肽释放酶的分离成本。本发明作为一种高效、新型的生物吸附技术，拥有操作条件温和、环境污染小；步骤简单、易操作；吸附效果快速、完全、操作稳定性佳等优点，在切实解决国内发酵工业废弃菌体废物利用方面意义重大，具有较广的工业化生产前景。
文档编号C12N9/64GK101974504SQ20101051545
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者付永前, 张泉文, 朱华跃, 蒋茹, 谢寅波, 钱林广, 马国芳 申请人:台州学院