新前列腺激肽释放酶过敏原的制作方法

专利名称：新前列腺激肽释放酶过敏原的制作方法
技术领域：
本发明涉及过敏反应领域。更具体，本发明涉及新的哺乳动物过敏原 的鉴定以及诊断和治疗对哺乳动物的过敏反应。
背景技术：
犬的毛皮垢屑是导致室内过敏反应的常见原因，症状包括鼻炎，结膜 炎，支气管感染和哮喘。犬过敏原不仅可在饲养宠物犬的室内检测到也可 在犬不经常存在的其他地方诸如学校和日托中心检测到(l)。
对犬的过敏反应伴随有并有赖于从犬毛和毛皮垢屑释放的蛋白的致敏 作用。在可疑对犬过敏的病例中，临床研究包括利用犬毛和/或毛皮垢屑提
取物通过皮肤针刺试验或特异性IgE抗体测定进行评估。特异性IgE的实 验室免疫分析，诸如Phadia ImmunoCAP，可利用天然犬毛皮垢屑提取物检 测出大多数对犬的过敏反应，这是由于实验条件有利并且存在大的允许过 敏原附着的固相。
犬毛和毛皮垢屑提取物包含过敏原性和非过敏原性蛋白的复合物(2， 3)。目前鉴定并详细研究了三种犬过敏原Canf 1，Canf2和Canf3。 Can f 1，其为脂质运载蛋白家族成员，报道的分子量21-25 kD，由de Groot et al. (4)首次纯化，随后克隆并表达为重组蛋白(5)。 Canf2属于相同的蛋白家 族但与Canf l不同(4, 5)。 Can f 3，犬血清白蛋白，是相对保守的蛋白，对 其他哺乳动物白蛋白显示广泛的交叉反应性(6)。
在已知的犬过敏原中，Can f 1是最为重要的，结合来自大约半数发生犬 过敏反应的对象的IgE抗体(7)。大约20%发生过敏反应的犬显示与Can f 2 结合的IgE，但大多数也对Can f 1过敏。尽管30-40%成年犬过敏反应个 体也显示结合Can f 3的IgE(2, 8),哺乳动物血清白蛋白的特定临床相关性 不确定。
很长时间以来，已知与啮齿类诸如小鼠和大鼠过敏反应有关的主要过 敏原存在动物尿液中并且它们已经被分离且定性(9-13)。 IgE抗体结合活性据报道存在其他动物包括猫和犬的尿液中(14)，但没有从这些动物的尿液中 纯化出过敏原并在分子水平定性。

发明内容
如上所述，利用犬毛皮垢屑提取物，特异性IgE的实验室免疫测定可 检测大多数对犬的过敏反应，这是由于实验条件有利并且存在大的允许过 敏原附着的固相。但是，在微型或非实验室免疫测定诸如过敏原微阵列或 医生办公室测定中，检测环境不佳，抗体结合过敏原试剂结合能力较低， 天然过敏原提取物效力有限，导致诊断敏感性不足。其他动物表皮的特异 性IgE的免疫测定也存在类似的情况。因此，需要在一些情况下使用纯过 敏原性蛋白来实现足够的特异性IgE诊断试验的敏感性。
此外，对犬过敏个体有很大一部分不对已知的犬过敏原产生任何反 应，并且最近在芬兰人群中得以证实(7)。
上述内容导致本发明人寻找另外的未知犬过敏原。所述新过敏原可用 作试剂增加常规诊断试验的敏感性，也可作为已知的犬过敏原的补充用于 不同类型的组分分辨诊断应用中(15， 16)。纯过敏原蛋白质，或其具有改善 的非致敏性的片段或变体也可用于组分分辨免疫治疗中(16-20)。
由此从犬尿液纯化新的主过敏原并鉴定为前列腺激肽释放酶。其在所 有方面都和已经知道的犬过敏原不同。此外，类似或相同的免疫等同的过 敏原存在犬毛皮垢屑提取物中。激肽释放酶是已知的犬过敏原的重要补充 并且可用于诊断犬过敏反应。还认为其他哺乳动物诸如猫，马和啮齿类的 同源蛋白也有相似的过敏原性质和诊断用途。
前列腺激肽释放酶不仅存在尿液中也存在犬类的毛屑中。然而，在前 列腺组织中特异性表达的蛋白仅限于雄性个体的事实提示雌性犬类缺乏这 种过敏原。本实验室的初步结果支持该观点并且如果被大量研究结果证 实，则仅仅对前列腺激肽释放酶过敏的犬类过敏反应个体可耐受雌性犬 类。
最近公开的报道中，证实了阴道对精液的超敏反应与对存在精液中的 人前列腺特异性抗原PSA的IgE敏化作用相关(21)。由于犬类和人前列腺激肽释放酶以及人前列腺4寺异性抗原具有部分序列相似性，有可能对犬类 前列腺特异性激肽释放酶过敏导致出现所述过敏反应的可能性增加。也可
预期对前列腺特异性激肽释放酶的IgE介导的免疫反应对于某些的人类不
育有一定影响。
本发明的一方面涉及利用激肽释放酶诊断I型过敏反应以及利用激肽 释放酶制备诊断I型过敏反应的组合物。
本发明的另一方面涉及与激肽释放酶"混合(spiked)"的过敏原组合 物。所述过敏原组合物可为过敏原提取物或具有低或无激肽释放酶成分的 纯化或重组过敏原组分的混合物，其中加入激肽释放酶以结合来自患者的 IgE，所述患者的IgE不结合或几乎不结合组合物中的其他过敏原成分。本 发明的该方面还涉及制备所述组合物的方法，包括将激肽释放酶加入过敏 原组合物诸如过敏原提取物(任选与其他组分混合)或纯化天然或重组过 敏原组分的步骤。
本发明另一方面涉及一种体外诊断方法，用于诊断患者中的I型过敏 反应，其中体液样品诸如患者的血液或血清样品与激肽释放酶或前一方面 的组合物接触，并且检测患者样品是否含有特异性结合激肽释放酶的IgE 抗体。所述诊断方法可以本领域已知的任何方式进行。所述激肽释放酶可 例如固定在固体支持物上，诸如在常规实验室免疫测定中，在微阵列中或 在支流测定法中。
本发明另一方面涉及用于进行前一方面所述方法的诊断试剂盒，其中 包括激肽释放酶。
上述的方面中，野生型激肽释放酶分子也可用激肽释放酶的片段或变 体取代，其可为天然或人工制造的，具有与野生型激肽释放酶相同的抗体 结合表位(epitopes for antibodies),如下所述。
本发明还涉及治疗I型过敏反应的方法，包括给予需要所述治疗的患 者激肽释放酶或修饰的激肽释放酶，如下所述。本发明的该方面还涉及激 肽释放酶在所述免疫治疗包括例如组分分辨的免疫治疗中的应用(16)。该 方面的一个实施方案中，激肽释放酶可以天然形式或显示与天然分子相似 的免疫性质的重组形式使用。另一实施方案中，激肽释放酶可通过化学或遗传方法修饰，以消除或减弱其IgE抗体结合能力，同时优选能激发经过 治疗的个体中的IgG反应。修饰的实例包括但不限于，分子的片段化、截 短或串联，缺失内部片段，取代氮基酸残基，结构域重排或通过破坏二硫 桥或其与其他大分子结构的结合来破坏至少部分三维结构，或消除蛋白质 结合钙离子或其他低分子量化合物的能力。该方面的其他实施方案中，与 完整分子相比显示降低的IgE结合活性的单独的激肽释放酶10 kDa和域 18 kDa亚基用作修饰的激肽释放酶。
上述本发明的所有方面中，激肽释放酶可源自任何产生可在患者中诱 导过敏反应的激肽释放酶的哺乳动物。所述的激肽释放酶可纯化自其天然 来源，诸如目的哺乳动物的尿液、唾液或其他体液，或纯化自组织，诸如 毛发或毛皮垢屑。也可通过重组DNA技术或本领域技术人员已知的化学 合成方法制备。
本发明还涉及犬类前列腺激肽释放酶在诊断和治疗中的用途，例如诊 断和治疗对犬类的I型过敏反应。
本发明还涉及从哺乳动物尿液中纯化激肽释放酶的方法，包括以下步
骤
-过滤哺乳动物尿液；
-用适合疏水相互作用层析的缓冲液进行缓冲液交换； -过滤缓冲液交换后的尿液样品；
-将缓冲液交换后的尿液样品施加于疏水相互作用层析柱上;和
-收集包含激肽释放酶的流出级分。
所述哺乳动物尿液可为犬类的尿液。
定义
激肽释放酶是来自常规血液和尿液的丝氨酸内肽酶家族的蛋白水解 酶。在IUBMB酶命名法系统中，血浆激肽释放酶编号为EC 3.4.21.34，组 织激肽释放酶编号为EC 3.4.21.35。犬尿激肽释放酶是28 kDa异源二聚体 蛋白，包含分别大约为10±2和18±2 kDa的两个亚基，在本发明中分别记 为10和18 kDa亚基。其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1， GenBank登记号 P09582,并且在很多哺乳动物中描述了其同源蛋白，所述哺乳动物包括马，牛，猪，小鼠，大鼠和灵长类(例如登记号AAQ23713-4 (马)， NP_001008416 (牛)，P00752 (猪)，P00755-6和P15947 (小鼠)，P36373和 P00758 (大鼠)，Q28773 (狒狒)，XP—001174026 (黑猩猩)，Q07276 (短尾猿)， P20151, Q07276和AAM11874 (人)。
激肽释放酶的变体和片段可以是这样的蛋白质或肽，其长度为至少10 个氨基酸，优选至少50个，更优选至少75或IOO个氨基酸残基，并且与 所述激肽释放酶具有至少50 %，优选超过60 %, 70 %, 80 %, 90 %或95 %的 序列相同性。
修饰的激肽释放酶在本发明中理解为这样的激肽释放酶，其通过化学 或遗传方法进行修饰而改变了免疫学性质，例如本发明上文中与免疫治疗 方面有关的内容所示。
具有与野生型激肽释放酶相同的抗体结合表位的激肽释放酶的变体和 片段应理解为这样的片段和变体，其与来自代表性激肽释放酶敏化患者的 血清样品的IgE抗体的结合可被激肽释放酶显著抑制。所述抑制试验可例 如根据实施例8公开的方案进行。
低过敏原性修饰的激肽释放酶或激肽释放酶的变体或片段应理解为这 样的修饰的激肽释放酶或激肽释放酶的变体或片段，其不能结合来自代表 性激肽释放酶敏化患者的血清样品的激肽释放酶反应性IgE抗体，例如通 过实施例3所述的方法测定的那样，或其显示不具有生物过敏原活性或具 有明显降低的生物过敏原活性，如通过细胞活化实验如嗜碱性粒细胞组胺 释放实验测定的那样(22，23)。
附图简述


图1显示通过大小排阻层析对犬尿蛋白进行分级分离。包含图中所示 三个峰(标记为1-3)的每一个的级分被汇集用于分析IgE结合活性。
图2显示通过反相层析从图1的峰2纯化IgE结合蛋白。含有被选用 于进一步分析的蛋白的峰通过箭头标出。
图3是对通过大小排阻层析和反相层析纯化自犬尿的IgE结合蛋白的 还原(red)或非还原(ox)样品进行的SDS-PAGE分析。泳道M含有分 子量标记蛋白。图4显示激肽释放酶作为流体相抑制剂对特异性IgE与固定的犬毛皮 垢屑提取物的结合的影响。
图5a-b是通过对37份犬过敏反应对象血清中犬毛皮垢屑提取物的IgE 抗体反应性的免疫印迹分析进行的评估。在与膜条带保温之前，血清样品 如所指示的那样进行稀释。泳道M含有分子量标记蛋白。
图6显示通过实验性ImmunoCAP分析比较相对于血清稀释度校正的 28kDa条带的免疫印迹信号强度与激肽释放酶-特异性IgE的水平。应用的 ImmunoCAP和免疫印迹检测限用虚线表示。免疫印迹信号强度以任意单 位(AU)表示。
图7显示纯化的犬尿激肽释放酶对28kDa蛋白带的特异性免疫印迹抑 制。泳道M含有分子量标记蛋白。
图8显示通过大小排阻层析从犬毛皮街屑纯化激肽释放酶的第一步。 对图中所示的六个级分(标记为l-6)进行IgE结合活性分析。
图9显示通过反相层析从犬毛皮垢屑纯化激肽释放酶的第二步。分析 图中所示三个峰(标记为1-3)的上部级分的IgE抗体结合活性。
图10显示与犬毛皮垢屑提取物、从犬毛皮垢屑纯化的尿激肽释放酶 以及部分纯化的激肽释放酶的特异性IgE抗体结合的比较性免疫印迹分 析。使用了两种激肽释放酶-反应性血清(第6和第8)以及一种激肽释放酶 非反应性血清(第11)。分析了还原和非还原形式的过敏原制备物，如附图 说明中所述。泳道M含有分子量标记蛋白。
图11显示纯化的重组犬尿激肽释放酶的SDSPage分析。
图12显示纯化的重组犬尿激肽释放酶的分析型胶体过滤分析法。
图13显示天然和重组犬尿激肽释放酶的特异性IgE抗体结合活性的比较。
发明详述
以下实施例举例说明了犬激肽释放酶的分离及其用途。所述实施例仅 仅用于举例不应被理解为限制权利要求所说明的本发明。实施例1:检测和分离犬尿IgE结合蛋白
为了研究犬尿是否含有与人类的犬过敏反应相关的过敏原，进行以下 试验。从7岁龄雄性Siberian Husky与Vorsteh杂交犬收集尿液。用0.45 pm混合纤维素酯滤膜过滤之后，将10 mL尿液加载于Superdex 75大小排 阻层析(SEC)柱(XK26/100, Vt= 505 mL， GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden),该柱用20 mM MOPS pH 7.6, 0.5 M NaCl (MBS)平衡，并用相同 的缓冲液以2mL/min的流速洗脱。收集来自图1所示的层析图中所示的三 个峰的级分，分析过敏原活性。每种级分的蛋白成分固定在ImmunoCAP (Phadia， Uppsala, Sweden)固相上，利用来自犬毛皮垢屑敏化的8名对象的 血清检测其IgE抗体结合活性。选择的这些血清中大部分具有高IgE与犬 毛皮垢屑提取物的结合，但与rCan f 1， rCan f 2和nCan f 3的结合相对较 低。在三个检测的峰中，峰2含有目前最高水平的IgE结合活性(表 1)。利用NuPAGE MES缓冲液系统(10% NuPAGE gel， Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)对峰2的还原样品的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE)显示两条明显的蛋白带，其表观分子量分别为大约10和18 kDa (未显示)。
从对应峰2的汇集物进一步纯化蛋白是利用Source 15反相层析(RPC) 柱(ST4.6/100， Vt= 1.66 mL, GE Healthcare Biosciences)进行的。加入三氟乙 酸(TFA)至终浓度为0.065%之后，将该汇集物施加在柱上，然后利用9倍柱 体积的0.065% TFA水溶液洗漆。利用0-45%含有0.05% TFA的乙腈水溶 液的线性梯度洗脱，产生一个独特但有些不对称的峰(图2，用箭头指示 峰)。含有该峰的级分的还原样品的SDS-PAGE显示存在10和18 kDa 带，似乎不能分开(图3)。覆盖整个峰的级分由此收集在一起，在图2中用 横条标示。该汇集物的非还原样品的SDS-PAGE显示另外的28 kD条带以 及10 kDa和18 kDa带的迁移率略有偏移(图3)。还原态中也可见大约55 kDa的蛋白带，其可能是28kDa蛋白的二聚体。非还原状态中出现28kDa 带提示该蛋白可能是10和18 kDa多肽通过一或多个半胱氨酸桥连接而成 的。随后的线性质谱分析(数据未显示)显示28kDa蛋白在还原和烷基化 之后解离进一步支持了这一观点。实施例2:鉴定犬尿IgE结合蛋白为前列腺激肽释放酶
利用质谱法和N末端测序确定分离自犬尿的IgE结合蛋白。 淑爐ZZ)/-靜遂疗颜量微分析
为了对PRC纯化的尿蛋白进行溶液内消化，通过依次分别以大约45-和100-倍摩尔过量加入样品DTT和碘代乙酰胺进行还原和烷基化。胰蛋 白酶消化随后在37。C进行过夜，其中利用猪胰蛋白酶(Trypsin Gold,质谱级， Promega, Madison, WI, USA)。含有消化的肽的样品点样在MALDI靶标板 上，加入含50%乙腈，10 mM NH4[H2P04]， 0.1 % TFA的oc-氰基基质溶液。 蒸发溶剂之后，在Bruker Daltonics Autoflex 2仪(Bruker Daltonics， Bremen, Germany)上进行肽质量指纹(PMF)。为了鉴定匹配获得的PMF结果的蛋白 质，利用Mascot服务器(Matrixscience, London, UK)搜索MSDB数据库。 对所选的肽进行源后裂解(Post source decay) (PSD)分析。利用肽校准标准 品(Bruker Daltonics)进行外部校准。
对SDS-PAGE的单个蛋白带的凝胶内消化分析基本上按照Shevchenko (24)进行。从考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶切下实施例1中所述的10， 18和28 kDa条带。凝胶片依次用含有50%乙腈的50 mM碳酸氢铵洗涤然 后在纯乙腈中收缩。用50 mM碳酸氢铵再水化该凝胶片之后，加入乙腈 至50%并再次用乙腈洗涤，真空离心干燥所述的凝胶片。利用50mM碳 酸氢铵中的45 mM DTT和100 mM碘代乙酰胺依次进行离析和垸基化。 用50mM碳酸氢铵中的50。/。乙腈重复洗涤，最后用100%乙腈洗涤，然后 再次通过真空离心干燥凝胶颗粒。利用猪胰蛋白酶如上所述在37°C消化 过夜。消化的样品随后经超声处理并在含有0.1% TFA的50%乙腈中从凝 胶颗粒提取肽。样品制备和肽质量指纹如上所述进行。
溶液内消化的尿蛋白的PMF分析的结果显示与犬前列腺激肽释放酶 (登记号P09582)高度明显匹配(p<0.05)。两种肽的PSD分析，m/z=1224.6 和m/z=l632.8,其也存在18kDa带的凝胶内消化分析中，显示与具有相同 蛋白质数据库入口的氨基酸序列FMLCAGVLEGK和 SHDLMLLHLEEPAK显著匹配，分别对应残基194-204和117-130。由于28 kDa带的PMF也与犬激肽释放酶(P09582)有非常显著的数据 库匹配(p0.05)，对其进行的凝胶内消化的蛋白带分析也支持上述分析结 果。10kDa带的凝胶内消化样品的分析也进一步证实了分离的尿蛋白的鉴 定，该肽的PSD分析结果m/z=1004.6显示其与氨基酸序列SFIHPLYK高 度显著(p〈0.05)数据库匹配，对应P09582的残基95-102。
赠端富基麼靜
为了进行N-末端测序，从SDS-PAGE凝胶分别切下还原的10kDa和 18 kDa蛋白带，并在6 M盐酸胍，20 mM Tris pH 8.0， 0.5 MNaCl中利用塑 料棒搅匀进行提取。提取的10 kDa和18 kDa带的N-末端测序利用 Hewlett-Packard G1000A仪(Hewlett-Packard， Palo Alto, CA)进行，分别产生 氨基酸序列IIGGREXLKN和AVIRPGEDRS，其与登记号P09582的犬前 列腺激肽释放酶前体序列中的残基25-34和108-117残基匹配。
总而言之，本实施例中描述的结果证实了纯化的犬尿蛋白的主要成分 (对应还原SDS-PAGE分析中的10和18 kDa带)与犬前列腺激肽释放酶相 同。此外，观察到的结果提示该10和18 kDa多肽通过最初的基因产物的 翻译后切割形成，并由二硫桥连接形成非还原条件下所见的28 kDa蛋白 质，与先前对于人激肽释放酶所述的情况相似(25)。
前列腺激肽释放酶也已知为精氨酸酯酶并且在描述相同或基本相同的 氨基酸序列的数据库入口中携带该标签，所述的氨基酸序列包括 NP_001003284， CAA68720和AAA30831。此外，我们注意到在肾、胰腺 和唾液腺组织中表达的激肽释放酶的另一变体，已经在犬中鉴定(登记号 CAA53210)并且与前列腺激肽释放酶具有68%的氨基酸相同性。
实施例3:评估激肽释放酶，rCan f 1, rCan f 2和nCan f 3的IgE结合
活性
纯化的重组和天然犬过敏原的体外IgE结合活性利用ImmunoCAP (Phadia， Uppsala, Sweden)检测，ImmunoCAP 为临床诊断遗传性过敏反应 中使用的特异性IgE抗体检测的免疫测定系统。克隆重组Can f 1和Can f 2 (5)并在大肠杆菌中表达(26)。犬白蛋白利用以离子交换层析和蓝色琼脂糖层析自血清纯化，如(27)所述。利用试验性ImmunoCAP检测进行血清 分析(26)。
本研究利用来自瑞典(n-9)、西班牙(11=23)和北美洲(11=4)的37名犬过 敏反应患者的血清。所有的患者都对犬毛皮垢屑提取物具有阳性皮肤针刺 试验结果并且经过医生诊断为患有犬过敏反应，症状为哮喘、过敏性鼻-结 膜炎和/或风疹。所有血清对犬毛皮垢屑提取物的特异性IgE试验 (ImmunoCAP)都呈阳性。
对犬毛皮垢屑提取物，rCan f 1， rCan f 2， nCan f 3以及纯化的激肽释放 酶的特异性IgE水平显示于表2，结果总结于表3。在受试血清中，29份 显示对激肽释放酶的IgE反应性，18份显示对rCan f 1的IgE反应性。 rCan f 2和nCan f 3对于受试者而言表现为较弱的过敏原，仅仅分别结合 37份中的8和6份。37份血清中的14份(38%)仅仅与激肽释放酶反应。激 肽释放酶-反应性血清平均而言，结合激肽释放酶的IgE水平达到结合犬毛 皮垢屑的IgE的64%。在对于那些过敏原有特异性反应的血清中，结合 rCan f 1, rCan f 2和nCan f 3的IgE相应的相对水平分别为45%, 25%和 47%。 37份受试血清中仅仅有2份缺乏对所有四种犬过敏原的IgE反应 性。IgE与激肽释放酶的结合显示与其他任何犬过敏原没有关系，证实了 对激肽释放酶的免疫反应是独立变量并且不是与Can f 1, Can f 2或Can f 3 交叉反应的结果。
所得结果明显说明犬前列腺激肽释放酶是本文所研究犬过敏反应对象 的主要独特过敏原。通过研究发病率和IgE结合程度，发现激肽释放酶是 目前最为重要的犬过敏反应过敏原，并且在所研究的对象中，超过三分之 一对激肽释放酶有反应但对其他检测的过敏原都没有反应。
实施例4:证实犬毛皮垢屑提取物中激肽释放酶-特异性IgE抗体结合
活性
进行IgE抑制试验检验犬毛皮垢屑是否含有能结合激肽释放酶反应性 IgE抗体的表位。具有对激肽释放酶的IgE反应性的来自三名对犬过敏的 对象(A-C)的血清样品首先在室温与终浓度100 ng/mL的纯化的激肽释放酶保温，同时作为阴性对照，与稀释的血清或大肠杆菌非过敏原性麦芽糖结
合蛋白(MBP)保温。所有样品随后一式双份进行分析，分析IgE与携带固 定的犬毛皮垢屑提取物的ImmimoCAP检测系统的结合以研究与激肽释放 酶预先保温是否阻止IgE与附着于固相的毛皮垢屑蛋白结合。作为激肽释 放酶抑制作用的特异性的对照，对Can f 1和Can f 2过敏但对激肽释放酶 不过敏的个体(D)的血清,与其他血清一并包括在试验内。
抑制试验的结果显示于图4。纯化自犬尿的激肽释放酶完全抑制IgE 结合三份激肽释放酶反应性血清中的两份(A和B)的犬毛皮垢屑并且部 分抑制第三份血清(C)中的结合，已知第三份血清也对其他犬过敏原有 反应性。阴性对照蛋白MBP与稀释的血清相比没有显示明显的抑制效 应。此外，激肽释放酶对于Can f l-和Can f 2-反应性血清(D)的IgE结 合没有抑制作用。
结果表明能结合激肽释放酶-反应性IgE抗体的表位结构存在犬毛皮垢 屑中，而不限于尿液中。
实施例5:利用免疫印迹分析评估IgE与来自犬毛皮垢屑提取物的激肽 释放酶-样28kDa蛋白的结合
为了鉴定存在犬毛皮垢屑中的蛋白(其可能产生观察到的激肽释放酶样 过敏原活性),将具有已知水平的激肽释放酶反应性IgE的37份血清用于免 疫印迹实验中。对通过SDS-PAGE (12.5% Excel 2-D gel， GE Healthcare Biosciences)分离的非还原犬毛皮垢屑提取物进行免疫印迹分析，并电印迹 (electroblot)到硝酸纤维素膜(Hybond ECL， GE Healthcare Biosciences)。蛋 白质印迹在室温利用封闭缓冲液(50 mM磷酸盐pH 7.4， 0.1 % (v/v) Tween-20， 0.9°/。 (w/v) NaCl， 0.3% (w/v) Dextran T10)封闭lh，然后与每份患者血清 保温过夜，在封闭缓冲液中稀释1.5到20倍。每份血清的稀释因子显示在 图5中其相应膜条带的上方括号中。在封闭缓冲液中利用0.5% (v/v) Tween-20洗涤之后，在室温将膜与封闭缓冲液中的1251-标记的抗人IgE抗 体保温，并利用储存磷光质屏(storage phosphor screen)和Variable Mode Imager, Typhoon 9410 (GE Healthcare Biosciences)对结合的IgE进行放射图 像检测。实验结果显示于图5a-b。在使用的37份血清中，有30份显示IgE与 28kDa蛋白结合，21份显示IgE与23 kDa带结合，所述的23kDa带对应 Can f 1和/或可能对应Can f 2。免疫印迹信号强度利用Phoretix ID软件 (Nonlinear Dynamics Ltd, Newcastle upon Tyne， UK)定量。每种血清中IgE 与每条带的反应水平通过用信号强度乘以血清稀释因子来计算。图6显示 免疫印迹分析中IgE与28 kDa带结合水平与实施例3中所述激肽释放酶 ImmunoCAP测定的比较，显示密切相关。
为了直接检验尿激肽释放酶与犬毛皮垢屑中28kDa带的关系，进行免 疫印迹抑制试验。将与28 kDa带产生免疫反应的血清在室温与纯化的尿 激肽释放酶或rCan f 1预保温2hr，终浓度均为100 pg/mL，或与血清稀释 物预保温。携带免疫印迹的非还原犬毛皮垢屑提取物的膜条带随后与预保 温的血清样品接触，如上所述分析IgE结合。试验显示犬毛皮垢屑中 28kDa带的IgE结合完全被血清与激肽释放酶的预保温消除，但与单独的 rCanf 1和缓冲液预保温仍然保持所述的结合(图7)。
总而言之，本实施例的结果显示犬毛皮垢屑提取物中存在在电泳以及 免疫学性质方面与尿激肽释放酶非常相似的蛋白质。
实施例6:犬毛皮垢屑中激肽释放酶的部分纯化和鉴定
犬毛皮垢屑的激肽释放酶-样蛋白通过SEC和RPC纯化，进行生化定 性。将3克犬毛皮垢屑(Allergon， Valinge, Sweden)在室温在100 mL MBS 中通过持续滚动(end-over-end rotation" hr进行提取。20,000 x g离心并用 Amicon滤膜(PM-10， Millipore， Billerica， MA, USA)浓縮后，提取物施加在 XK50/100 Superdex 75柱(GE Healthcare Biosciences)上并用MBS洗脱(图 8)。汇集来自6个峰的级分(在图8中表示为l-6)并分析过敏原活性。每个 级分的蛋白成分固定在ImmunoCAP (Phadia， Uppsala, Sweden)固相上并且 利用来自犬毛皮标屑敏化的对象的8份血清检测IgE抗体结合活性，如表 4所示。这些血清中大多数对犬毛皮垢屑提取物具有高IgE结合但对rCan f 1，rCanf2或nCanf3的结合相对较低。从表4可见，SEC分离的3个峰含 有的IgE水平是测试的6个峰中最高的。选择该汇集物进一步纯化。加入TFA至终浓度0.065%,将该汇集物施加在ST4.6/100 Source 15 RPC柱(GE Healthcare Biosciences)上，利用含有0.05% TFA的0-54%线性 梯度乙腈水溶液进行洗脱(图8)。图9所示的三个峰的过敏原反应性分析利 用上述标准选出的5份血清进行。分析结果(表5)明显表明第1个峰具有最 高的IgE抗体结合水平。该峰的还原SDS-PAGE分析显示存在10 kDa, 18 kDa和23kDa蛋白带(未显示)。
峰1中存在的三条带从凝胶切下，并进行凝胶内消化和质谱分析，如 实施例2所述。对选择的肽的PSD分析(m/z4004.52和m/z-1632.98)之 后，23kDa条带鉴定为Canfl, 10kDa和18 kDa带鉴定为犬前列腺激肽释 放酶(登记号P09582)。
此外，从切下的凝胶带中洗脱10 kDa和18 kDa带，进行N末端氨基 酸测序。所得序列为xIGGRExLKN和AVxRPGEDRx(其中"x"表示不确定 残基)匹配犬前列腺激肽释放酶前体序列(登记号P09582)的残基25-34和 108-117。
本实施例的结果表明具有与前列腺激肽释放酶相同或非常相关的一级 结构的蛋白存在犬毛皮塘屑中。
实施例7:对来自犬毛皮垢屑和尿的激肽释放酶的相似的IgE抗体反应
性
为比较犬尿和毛皮垢屑激肽释放酶的IgE抗体结合活性，在犬毛皮垢 屑提取物的非还原样品、纯化的尿激肽释放酶以及部分纯化的犬毛皮垢屑 激肽释放酶的免疫印迹分析中使用两份激肽释放酶-反应血清(表2中的6 和8号血清)以及一种激肽释放酶非反应性血清(ll号)。两份激肽释放酶-反应性血清显示对所有3份制备物中的28 kDa带的IgE结合，表明犬毛皮 垢屑提取物中28 kDa的IgE结合是由于激肽释放酶导致的。此外，很明显 对纯化尿激肽释放酶中28 kDa带的显著反应性与相同制备物的考马斯染色 的蛋白带的情况一致。与非还原激肽释放酶制备物中大约55kDa的带的 IgE结合与实施例1中推定的激肽释放酶二聚体的情况一致。根据ImmunoCAP是非激肽释放酶反应性的血清显示与分析的三种过敏原制备 物中的28 kDa带都没有IgE结合。
对还原的含激肽释放酶样品的免疫印迹反应性明显弱于非还原样品中 的情况。仅仅纯化的尿激肽释放酶制备物(其激肽释放酶浓度高于其他分析 的制备物)产生与还原时形成的18kDa带的可检出的IgE反应。
观察到对免疫印迹分析中纯化的尿激肽释放酶的免疫反应性针对28 kDa的主要蛋白带的情况，支持实验性激肽释放酶ImmunoCAP检测的正 确性，其IgE结合不是所用蛋白质制备物中的污染物导致的。结果进一步 显示激肽释放酶上的至少一些IgE结合表位对于分子的还原敏感，如10 kDa和18 kDa亚基的结合比与28 kDa非还原分子的结合弱也表明了这一 点。
实施例8:评估修饰的激肽释放酶或激肽释放酶的变体或片段(分析 物)的IgE结合性质
将分析物固定于固体支持物，诸如ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)。来自至少三个对相关物种过敏的代表性人患者并显示对该物种 激肽释放酶的IgE反应性的血清样品在室温与终浓度100 lag/mL的激肽释 放酶保温3h，同时与单独的缓冲液和大肠杆菌非过敏性麦芽糖结合蛋白 (MBP)保温作为阴性对照。随后分析样品的IgE与携带固定的分析物的 ImmunoCAP (Phadia, Uppsala， Sweden)检测的结合来研究与激肽释放酶预 保温是否特异性已知或明显降低IgE结合。
实施例9:通过疏水相互作用层析(HIC)从犬尿纯化激肽释放酶
犬尿汇集样品用5 Mm和0.45 pm滤膜在氮压下过滤。所有层析操作均 用 AKTA Explorer 100 Air system (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)进行。4等份的120 ml过滤犬尿利用Sephadex G-25柱(GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden) (column volume 461 ml)进行缓冲液 交换，每次在走柱后洗涤该柱。使用的缓冲液为:50 mM磷酸钠，1M(NH4)2SO4,0.02%NaN3，pH = 7。样品(大约505 ml)随后通过0.45nm滤 膜过滤，施加在HIC柱(HiPrep Phenyl FF (high sub), 20ml， GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)上。用于HIC分离的缓冲液为A) 50 mM磷 酸钠，1 M (NH4)2S04, 0.02% NaN3, pH = 7，和B) 50 mM磷酸钠，0,02% NaN3, pH = 7。流出级分(含有激肽释放酶)以流速5 ml/min收集在10 ml级分 (Frac 950)中，汇集流出级分。吸收的物质利用100%缓冲液B在梯度中洗 脱。
所述级分利用BCA (bicinchoninic acid)测定和SDS-PAGE (非还原样 品，含银)分析。非还原条件下的SDS-PAGE显示激肽释放酶存在流出级 分中，随后汇集所述级分用于进一步处理。
两等份的大约125 ml和一等份大约87 ml的汇集HIC流出级分随后利 用Sephadex G-25 SF柱(GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)进行缓 冲液交换，所用缓冲液为20mM磷酸钠，0.02。/。NaN3,pH-8。激肽释放酶 汇集物(456 ml)随后在Amicon cell (350 ml， Millipore滤膜，PBCC，截留值 5000 kDa,直径76 mm)上浓缩到体积约为43 ml。利用BCA测定法，测定 最终的汇集物中的蛋白浓度为0.9 mg/ml (in 43 ml =共38，7 mg)。施加于 HIC-柱的样品含有101 mg蛋白质，其在HIC纯化后的激肽释放酶回收率 为38%。
激肽释放酶制备物的纯度通过在Superdex 75 HR 10/30柱上在AKTA purifier XT10系统中进行分析凝胶过滤来评估。对于该试验，样品体积为 100 |il，缓冲液为10 mM磷酸钠，150 mM NaCl, 0.02% NaN3, pH = 7.4。
实施例10:利用电泳和质谱法鉴定并定性犬尿激肽释放酶
利用电泳在相同的凝胶上比较下述样品，应用胶体考马斯亮蓝(CBB) 染色
1. 标准分子量标记物
2. 犬尿
3. HIC-洗脱物(还原型)
4. HIC流出级分(还原型)5. HIC流出级分(非还原型)
6. HIC-洗脱物(非还原型)
对于样品2， 3和6,检出大量蛋白。但是在样品4 (还原型HIC流出 级分)中，仅仅可见两条主带。这两条主带通过利用MALDI-TOF(-TOF) 分析(参见下文)，发现对应激肽释放酶的两种不同的变体(由于精氨酸 酯酶活性在R107的蛋白水解产生的)。样品5 (非还原HIC流出级分) 中，MALDI-TOF(-TOF)分析检测到7个不同的带(见下文)，其对应激肽 释放酶蛋白的不同变体。激肽释放酶包含12个半胱氨酸残基，由此可能在 非还原条件下由于形成半胱氨酸-半胱氨酸桥形成不同变体。因此，可能在 非还原条件下形成二聚体、三聚体等。
SDS-PAGE条件，胰蛋白酶消化和MDI-TOF-TOF分析 稀释样品利用SDS-PAGE cleanup试剂盒根据产品说明(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)制备。凝胶在MES缓冲液中在200 V、 35分钟。还原和 非还原样品在分离的聚集体中跑胶。利用胶状CBB染色过夜(随后在水中 浸泡大约5小时脱色)。利用移液管尖端从凝胶人工选出样品，根据标准方 案处理(利用乙醇取代乙腈)，与12.5 ng/Vl胰蛋白酶在37摄氏度保温过 夜。将0.5 pl消化样品施加在MALDI系统的靶标板上并与0.5 |il MALDI 基质溶液混合(HCCA在50%乙腈，0.1% TFA中的饱和溶液)。利用 MALDI-TOF-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)质谱仪分析所有样 品。为了鉴定匹配所得PMF结果的蛋白，利用Mascot服务器(Matrixscience: London, UK)搜索MSDB数据库。对所选肽进行MS-MS分析。利用肽校准 标准品(Bruker Daltonics)进行外部校准。利用如下搜索标准进行数据库搜 索
分类:哺乳动物 质量允差100 ppm
允许氧化的蛋氨酸和1个缺失的裂解。 数据库中的激肽释放酶序列FJ朋ZHK尸及---------
爿ra 户G^mSffl)丄肌丄肌^/MXITKAVRVMDLPKKEPPLGSTCYVSG
AKDTCKGDSGGPLICDGELVGITSWGATPCGKPQMPSLYTRPW肌AfW MZ)7MJTANT (SEQ ID NO: 1)
(斜粗体是通过MALDI-TOF (/TOF) MS (/MS)鉴定的肽序列)
实施例11:克隆、纯化和评估在巴斯德毕赤酵母中表达的重组犬激肽 释放酶的IgE结合活性
为了证实尿激肽释放酶作为犬过敏原的性质和重要性，制备所述蛋白 作为重组过敏原利用巴斯德毕赤酵母作为表达宿主，纯化并分析IgE抗体 结合活性。
虔y备编妈;^尿激iif释i^^游会y^^^^^達沐 合成犬尿激肽释放酶基因通过将犬前列腺精氨酸酯酶的报道的氨基酸 序列中对应成熟蛋白的部分回翻译成核苷酸序列设计(尿激肽释放酶，登记
号P09582)。核苷酸序列设计为最优密码子翻译并且经同义修饰最小化二 级结构并消除或增加合意的限制酶位点。获得并组装对应最终编码序列的 寡核苷酸，PCR扩增全长合成基因，并克隆入载体pPICZ A (Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)的屈ol和位点，添加C末端六组氨酸标记以使得 能通过固定金属离子亲和层析(IMAC)纯化蛋白。通过Sac I消化使得质粒 DNA构建体线性化，并转化进入巴斯德毕赤酵母X-33以同源重组进入染 色体A0X1基因座。
教微众激犬微做籐2
重组蛋白在巴斯德毕赤酵母X-33 (Invitrogen)中利用7 L生物反应器 (Belach Bioteknik, Solna， Sweden)产生。使用丰富肉汤培养基(20 g/L蛋白胨 10 g/L酵母提取物，3.4 g/L酵母氮源，10 g/L硫酸铵，0.4 mg/L生物素和0.1M磷酸钾)在30°C培养。诱导表达并通过向培养物中加入甲醇到稳态浓度 0.P/。(v/v)进行保持。发酵70hr之后，在+4。C在10 000 g离心10min收获 培养物并回收上清用于蛋白纯化。
根据说明，通过加入咪唑至5 mM以及加入NaCl至.15 M调节上清以 纯化，利用Tris base调节pH到7.2，然后将其施加到通过NiS04带电的 Streamline 25螯合柱(GE Healthcare Biosciences)。加样后，在分离的步骤 中用20 mM和60 mM咪唑洗柱，用500 mM咪唑洗脱重组蛋白，均在包 含20 mM Tris-HCl pH 8.0和0.15 M NaCl的缓冲液中进行。
利用阳离子交换层析进一步纯化重组蛋白。含有重组激肽释放酶的 IMAC级分通过SDS-PAGE鉴定，汇集并用2个体积的20 mM MES pH 6.0 稀释。调节pH到6.0，稀释的汇集物施加在XK26/100 SP琼脂糖FF柱(GE Healthcare Biosciences)上。该柱随后用2倍柱体积的20 mM MES pH 6.0中 的0.15 M NaCl洗涤，用相同缓冲液中的0.30 M NaCl洗脱重组蛋白。测 定所得蛋白在280 nm的吸光度，所用的计算的消光系数为1.46 per mg/mLo
尽管合成激肽释放酶基因构建体被设计为指导单多肽链的产生，从培 养基中纯化的蛋白部分裂解成18kDa和12kDa链(图11)，类似天然尿激肽 释放酶的加工。事实上，N末端测序显示重组激肽释放酶的裂解位置与天 然分子的相同(数据未显示)。
为了评估重组蛋白在生理条件下的聚合状态和完整度，对制备样品进 行分析性大小排阻层析。如图12所示，层析图主要包括单个对称峰，通 过LMW校准试剂盒(GE Healthcare Bioseiences)确定对应分子量为34 kDa。该分析显示重组蛋白尽管部分被加工，但在溶液中仍保持在一起并 为均质的很可能是单体的聚合状态。
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产生的重组激肽释放酶的免疫活性通过与纯化自犬尿的天然蛋白进行 比较来评估。两种蛋白分别固定在ImmunoCAP③固相，并且利用37份犬 过敏反应个体血清检验体外IgE结合能力，如实施例所述。如图13所示，两组数据显示非常强的相关性(产0.9988)，表明产生的重 组激肽释放酶与天然尿激肽释放酶在IgE抗体结合方面非常相似。由于重 组蛋白制备物中完全没有任何其他犬来源蛋白，因此所述结果消除了任何 关于上述实施例中的天然激肽释放酶制备物的活性组分的疑问。参考文献
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权利要求
1.激肽释放酶或其具有与野生型激肽释放酶相同的抗体结合表位的变体或片段在制备用于体外诊断I型过敏反应的诊断组合物中的用途。
2. 权利要求1的激肽释放酶，特征在于所述的激肽释放酶源自灵长类，包括人、犬、猫、马、牛、猪、大鼠或小鼠。
3. 权利要求1或2的激肽释放酶，特征在于所述激肽释放酶纯化自 哺乳动物来源或是重组产生的。
4. 权利要求1-3之一的激肽释放酶，特征在于所述的激肽释放酶 是前列腺激肽释放酶。
5. 权利要求1-4之一的激肽释放酶，特征在于所述的激肽释放酶 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1 。
6. 制备过敏原组合物的方法，包括将激肽释放酶或其具有与野生 型激肽释放酶相同的抗体结合表位的变体或片段加入包含过敏原提取物和/ 或至少一种纯化的过敏原组分的组合物中。
7. 权利要求6的方法，特征在于所述激肽释放酶源自灵长类，包 括人，犬，猫，马，牛，猪，大鼠或小鼠。
8. 权利要求6或7的方法，特征在于所述激肽释放酶纯化自哺乳 动物来源或是重组产生的。
9. 权利要求6-8之一的激肽释放酶，特征在于所述的激肽释放酶 是前列腺激肽释放酶。
10. 权利要求6-9之一的激肽释放酶，特征在于所述的激肽释放酶 具有氨基酸序列SEQIDNO: 1。
11. 过敏原组合物，其可通过权利要求6-10之一的方法获得。
12. 体外诊断I型过敏反应的方法，包括如下步骤 -将来自可疑患有I型过敏反应的患者的含有免疫球蛋白的体液样品与激肽释放酶或其具有相似IgE-结合特性的变体或片段接触，或与权利要求 ll的过敏原组合物接触；和-检测所述样品中与所述激肽释放酶特异性结合的IgE抗体的存在，其中所述特异性结合激肽释放酶的IgE抗体的存在指示I型过敏反应。
13. 权利要求12的方法，特征在于所述激肽释放酶源自灵长类，包 括人，犬，猫，马，牛，猪，大鼠或小鼠。
14. 权利要求12或13的方法，特征在于所述激肽释放酶纯化自哺乳 动物来源或是重组产生的。
15. 权利要求12-14之一的方法，特征在于所述激肽释放酶是前列腺 激肽释放酶。
16. 权利要求12-15之一的激肽释放酶，特征在于所述的激肽释放 酶具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1 。
17. 进行权利要求12-16之一的方法的诊断试剂盒，包含权利要求 l-6之一的激肽释放酶或权利要求11的组合物。
18. 治疗哺乳动物I型过敏反应的方法，包括给予对所述治疗易感 的个体来自所述哺乳动物的激肽释放酶或者所述激肽释放酶的经修饰消除 或减弱其IgE结合反应的形式。
19. 权利要求18的方法，其中所述哺乳动物选自灵长类组成的组， 包括人，犬，猫，马，牛，猪，大鼠或小鼠。
20. 权利要求18或19的方法，其中所述修饰的激肽释放酶是10 kDa 亚基或18kDa亚基。
21. 权利要求18-20之一的方法，其中所述低过敏原性激肽释放酶 衍生物是通过分子的片段化、截短或串联，内部片段的缺失，结构域重 排，氨基酸残基取代，二硫桥破坏进行修饰的激肽释放酶。
22. 药物组合物，包含激肽释放酶或所述激肽释放酶的经修饰消除 或减弱其IgE结合反应的形式，以及任选的药物可接受的载体、赋形剂， 缓冲液或稀释剂。
23. 权利要求22的药物组合物，其中所述低过敏原性激肽释放酶片 段是10kDa亚基。
24. 权利要求22或23的药物组合物，其中所述低过敏原性激肽释放 酶衍生物是通过分子的片段化、截短或串联，内部片段的缺失，结构域重 排，氨基酸残基取代，二硫桥破坏进行修饰的激肽释放酶。
25. 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的激肽释放酶在诊断中的用途， 诸如诊断犬的I型过敏反应。
26. 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的激肽释放酶在治疗中的用途， 诸如治疗犬的I型过敏反应。
27. 从哺乳动物尿液分离激肽释放酶的方法，包含以下步骤 -过滤哺乳动物尿液；-与适合疏水相互作用层析的缓冲液进行缓冲液交换； -过滤缓冲液交换后的尿液样品；-将缓冲液交换后的尿液样品施加于疏水相互作用层析柱上；和 -收集包含激肽释放酶的流出级分。
28. 权利要求26的方法,其中所述哺乳动物尿液是犬尿。
全文摘要
前列腺激肽释放酶在制备用于诊断/治疗I型过敏反应具体是对犬的过敏反应的诊断组合物或药物组合物中的用途。
文档编号A61P37/00GK101588815SQ200780047710
公开日2009年11月25日 申请日期2007年12月21日 优先权日2006年12月22日
发明者H·埃韦堡, J·利德霍尔姆, L·马特松 申请人:法蒂亚公司