稳定的激肽释放酶-1注射液的制作方法

专利名称：：稳定的激肽释放酶-1注射液的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有蛋白酶的溶液，更具体地涉及稳定的激肽释放酶-1注射液。
背景技术：
：激肽释放酶-l(Kallikrein-l)是一种丝氨酸蛋白酶，在人或动物体内主要作用于激肽原，使之水解释放出激肽，通过激肽发挥扩张毛细血管、松弛血管平滑肌、改善微循环、增加血流量、抗凝、溶血栓、降低血液粘度和血压，以及具有治疗不育症等作用。其中更多相关的背景信息可另参考本专利申请人已经提交的中国专利申请2006100277541和200710038911.3PCT/CN2007/070800。激肽释放酶-l在溶液状态下极不稳定，因此通常需要将其冻干保存，该冻干制剂在配制成溶液，也需要尽快使用，以避免活性丧失。例如，在中国专利ZL200410096060.4中公开了一种水溶液，其中将甘露醇、水解明胶(或右旋糖酐)和柠檬酸钠组合，用以溶解从人尿中提取的人尿激肽原酶(人激肽释放酶-l)冻干粉，以达到保持主药活性的作用。这种采用冻干粉针剂，并再配以由一定的辅料组成的水溶液来溶解的制剂方式，不仅增加了生产成本，而且临床使用也不方便，此外，溶解后保持主药活性的时间也非常短暂。因此，本领域迫切需要提供能保持激肽释放酶-1长期稳定性的液体制剂。
发明内容本发明旨在提供稳定的含有激肽释放酶-1的注射液。本发明的另一个目的是提供上述稳定的含有激肽释放酶-1的注射液的制备方法。在本发明的第一方面，提供了一种稳定的激肽释放酶-l注射液，所述的注射液中含有(1)激肽释放酶-10.05-40.00AU/ml;(2)磷酸盐缓冲液10-50mmol/L，p服.0-8.0;(3)氯化钠0.01-0.2mol/L;和(4)蛋白酶保护剂0.01-20%(w/v)(以注射液的总体积为基准)。在另一优选例中，所述的蛋白酶保护剂为0.5—10%;优选1一5%。在另一优选例中，所述的蛋白酶保护剂选自下述的一种或多种甘露醇、水解明胶、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛烷酮、甘氨酸、聚乙二醇；所述的蛋白酶保护剂优选自下述的一种或多种甘露醇、水解明胶、右旋糖酐、甘氨酸。在另一优选例中，以注射液的总体积为基准，其中所述的甘露醇0.5-10%(w/v)，水解明胶O.1-10%(w/v)，右旋糖酐O.5-10%(w/v)，甘氨酸O.05-2%(w/v);优选所述的甘露醇l-4%(w/v)，水解明胶1-3%(w/v)，右旋糖酐l-4%(w/v)，甘氨酸0.5-l%(w/v)。在另一优选例中，激肽释放酶-1是天然提取或重组的；优选重组人激肽释放酶-l。在另一优选例中，其中所述的磷酸盐缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对；所述的氯化钠为0.卜0.2mol/L;所述的右旋糖酐选自右旋糖酐-20、右旋糖酐-40或右旋糖酐-70。在另一优选例中，以注射液的总体积为基准，所述的溶液中还含有0.005-0.02。/。(w/v)防腐剂。在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的注射液的制备方法，所述的方法包括步骤(a)将磷酸盐、氯化钠、蛋白酶保护剂和注射用水混合；(b)用磷酸或Na0H调节p朋.0—8.0;和(c)加入激肽释放酶-1后注射用水定容，得到如上所述的稳定的激肽释放酶-1注射液。在另一优选例中，所述的磷酸盐缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对。在另一优选例中，在步骤(a)中还可以加入防腐剂，使步骤(c)中所得到的注射液中，以注射液的总体积为基准含有0.005-0.02%(w/v)防腐剂。据此，本发明提供了能保持激肽释放酶-1长期稳定性的液体制剂。具体实施例方式发明人发现在含有激肽释放酶-1的水溶液中加入一定种类和一定量的蛋白酶保护剂，可以长时间地保持激肽释放酶-l在水溶液中的活性。具体地，发明人向处于磷酸盐缓冲体系(pH6.0-8.0)中的激肽释放酶-l溶液中加入甘露醇、水解明胶、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛烷酮、甘氨酸、和聚乙二醇中的一种或多种作为蛋白酶保护剂，并适当再添加氯化钠用以调节水溶液的渗透压，就制成能长期保持活性(稳定性)，可供临床中方便使用的激肽释放酶-1液体制剂。如本文所用，"激肽释放酶-l"和"激肽原酶"可以互换使用，此外，目前文献中还有在这两个词前冠以来源的组织器官或代谢产物名称，如'胰激肽原酶'、'胰激肽释放酶'、'尿激肽原酶'等，均与本专利中所描述的，按国际上建议的'激肽释放酶-r这一名称所指的是同一种成分。它是一种丝氨酸蛋白酶，可作用于激肽原，使之水解释放出激肽，通过激肽发挥扩张毛细血管、松弛血管平滑肌、改善微循环、增加血流量、抗凝、溶血栓、降低血液粘度和血压等作用。英文名为Kallikrein与Kininogermse、Kallidinogenase、Kininogenin所描述的都是同一类成分，不过目前多用Kallikrein—词。已经从人和动物体的不同组织、器官或尿液中获得了许多Kallikrein类成分，其中将含量最高，发现也最早的命名为Kallikrein-1(激肽释放酶-1)。该成分在人或哺乳动物的胰腺和肾脏中含量最高，其代谢后又通过肾脏，随尿排出体外。因此，从人或动物尿中分离出来的早年所称的尿激肽原酶(或尿激肽释放酶)实际就是新分类中的激肽释放酶-l(Kallikrein-1)。不同来源的激肽释放酶-1的分子量差别很大。例如，从人尿中或胰腺中分离出的人激肽释放酶-1，其相对分子量为33800。而通过基因方法获得的重组人激肽释放酶-1的分子量从26000-35000不等，这主要取决于采用的表达系统(E.cli、酵母、昆虫细胞、CHO细胞等)以及表达的方式(细胞内或分泌表达)等不同，蛋白糖基化的修饰方式、修饰程度不同以及纯化方式对糖链影响等而引起的差别。例如，E.coli或酵母细胞内表达出的激肽释放酶-1其分子量约26000左右，而CHO细胞表达的激肽释放酶-l可达到35000左右。本专利中的激肽释放酶-1可以是天然提取或重组的，可以是尿激肽原酶或胰激肽原酶，较佳地是重组人激肽释放酶-1。在本发明中，"重组激肽释放酶-l"可以使用本领域技术人员熟知的方法获得，一种优选的方法可以如本发明实施例1中所提供的，也可以参考中国专利2006100277541以及200710038911.3、PCT/CN2007/070800中的相关内容。如本文所用，"蛋白酶保护剂"、"保护剂"和"稳定剂"可以互换使用，都是指可以保持激肽释放酶-1活性的物质，选自下述的一种或多种甘露醇、水解明胶、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛烷酮、甘氨酸、聚乙二醇；较佳地选自甘露醇、水解明胶、右旋糖酐、和甘氨酸中的一种或多种。在本发明中，含有激肽释放酶-1的水溶液在4-37'C放置，以激肽释放酶-1和溶液刚开始混合为时间的起始点(O时)，以0时每毫升(ml)水溶液中激肽释放酶-l的活性单位(AU)为起始活性值，如果放置0-300天，每ml水溶液中激肽释放酶-1的AU是起始活性值的80-120%，就是本发明所指的稳定，较佳地是90-110%，更佳地为95-105%。本发明提供的含有激肽释放酶-1的稳定的注射液中选用磷酸盐缓冲体系，pH6.0-8.0，优选pH7.0;所述的磷酸盐缓冲体系是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系。本发明使用氯化钠用以调节水溶液的渗透压，氯化钠的浓度为0.Olmol/L-0.2mol/L，优选0.lmol/L-0.2mol/L，更优选0.15mol/L。蛋白质(酶)类药物的保护剂一直是生物制品类新药开发的研究重点，也是蛋白质类药物制剂生产中必须要解决的关键问题之一。本发明中蛋白酶保护剂可以为水解明胶、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯烷酮、甘氨酸以及聚乙二醇等数种物质中的一种或几种组合，优选水解明胶、甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸及其组合物；右旋糖酐可以为右旋糖酐-20、右旋糖酐-40或右旋糖酐-70。本发明中蛋白酶保护剂的浓度是以所提供的注射液的总体积为基准，为0.01%-20%;较佳地为O.5—10%;更佳地为1—5%。本发明中具体保护剂用量(w/v)为水解明胶的浓度为0.1%-10%、甘露醇的浓度为0.5%_10%、右旋糖酐的浓度为0.5%-10%、甘氨酸的浓度为0.05%-2%;优选水解明胶浓度为1%-3%、甘露醇浓度为1%-4%、右旋糖酐浓度为1%-4%、甘氨酸浓度为0.5°/。-1%;蛋白酶保护剂可以选用上述任意一种或者它们的组合物。在另一优选例中，本发明提供的含有激肽释放酶-1的稳定的注射液可以使用下述方法制备获得称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、蛋白酶保护剂，加入适量的注射用水充分溶解后，用磷酸或NaOH调节至适当的pH值，再量取适量的激肽释放酶-1，加入注射用水进行定容，过滤除菌，灌装，压塞、轧盖即可。本发明提供的含有激肽释放酶-1的稳定的注射液不仅可以保证重组或自人的组织、体液或代谢物中生物提取的人激肽释放酶-1在水溶液中保持长期稳定性，而且也对从动物胰腺中提取的动物的激肽释放酶-l(或动物胰激肽原酶)活性保持有很好的效果。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于1、本发明提供的含有激肽释放酶-1的稳定的注射液中蛋白的稳定性好；2、本发明提供的注射液制作简便，成本低；3、本发明提供的稳定的含有激肽释放酶-1的注射液中不含人血白蛋白作为保护剂，避免了增加引入外源性病毒的潜在危险。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明中激肽释放酶-1活性和比活性的检测方法和计算公式如下激肽释放酶-1能优先酶切生色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA，Chromogenix)，释放出对405nm波长的光波有最大吸收值的-pNA。所以，用生色底物S-2266，采用比色法可以测定激肽释放酶-1的活性。一个激肽释放酶-1活性单位(AU)是指在37°C，Tris-HC1pH8.0缓冲体系中，1分钟内能水解底物S-2266释放1umol游离pNA的酶量。测定的过程①.估计待测定样品活性，用稀释缓冲液(20mmol/LPBS，pH7.0)准确地将待测定样品作一系列稀释，如10X、IOOX、200X等。②.在洁净、干烤过的试管中加入400uL反应缓冲液(0.2mol/lTris-HC1,pH8.2)，再加入20uL稀释后的待测定样品溶液，对照样中则加入20uL稀释缓冲液，混匀后，37t:水浴保温5分钟，确保样品反应时温度一致。③.分别向各待测样品中分别加入40uL底物S-2266溶液(2mmol/L)，混匀，精确计时，并于37'C(水浴)之中反应15min。.反应时间一到，即向各反应样品中加入40uL反应终止液(50%乙酸溶液)终止反应，选用405nm波长，以对照样将分光光度计调零后测定各待测管的A4。5值，A4。s值应在0.1-0.2，不在此范围时，则增加或减少稀释倍数，重新游离型pNA的摩尔消光系数e=9，600Lmol—1cm—'，每毫升待测定样品中激肽释放酶-1的活性单位，则可按下面公式计算活性(AU/mL)二0.1736XA4。5X待测样的稀释倍数该方法测定激肽释放酶-1溶液活性浓度的最佳线性范围是0.017-0.034AU/mL，也就是说只要将待测定样品能稀释到该范围内就能被准确测定。以下实施例配方中各成分来源如下磷酸氢二钠购自湖南九典制药有限公司磷酸二氢钠购自湖南九典制药有限公司氯化钠购自江苏省勤奋药业有限公司甘露醇购自广西南林化学制药公司右旋糖酐-40:购自上海华茂药业有限公司水解明胶购自北京华达杰瑞生物技术有限公司甘氨酸购自生工生物工程(上海)有限公司尼泊金乙脂购自中国医药(集团)上海化学试剂公司尼泊金丙脂购自中国医药(集团)上海化学试剂公司实施例1重组人激肽释放酶-1的制备(以在甲醇酵母系统中分泌表达人激肽释放酶-1为例，采用其他表达系统、表达方式或表达基因，其基本操作相似。)将PCR获得的人激肽释放酶-1基因(rhKl)插入到pPICZaA(Invitrogen)公司商品化载体之中，构造分泌型表达载体pPICZa-hKl，按分子生物学基本操作进行转化筛选，获得能分泌表达人激肽释放酶-1的rhKl/X33工程菌种。1.rhKl/X33工程菌株在30L罐中发酵条件确定将种子液按l:15接种量接入装有15LBSM培养基的发酵罐中，开始菌体增殖培养阶段生长温度30'C，起始转速300rpm培养，通气量15L/min，用氨水将pH值调为5.0，通过调节转速、通气量、罐压维持溶氧值不低于209L约20小时左右，DO迅速上升，菌体湿重约120g/L时表明此阶段结束。甘油补料的菌体增殖阶段以150-350mL/小时的速率补加50%的甘油溶液，补加约4小时至菌体湿重约达200g/L;停止补料，DO值上升，维持此状态(饥饿)半小时；再用氨水将PH值调为6.0，准备诱导。诱导表达阶段缓慢增加甲醇的加入量，待其适应后，以120mL/小时的速率补加，同时维持DO值不低于20%，温度保持在3(TC,诱导约64小时，停止发酵，离心收获发酵上清液。2.纯化工艺研究重组人激肽释放酶-1的纯化制备过程共分四步第一步疏水层析向发酵上清液中加入等体积的40mmol/LPB+2mol/LNa2S04，pH7.0溶液，混匀，调节pH至7.0。0.22um膜过滤，上已用20隨ol/LPB+1.0mol/LNa2S04，pH7.0缓冲液平衡过的PhenylS印harose6FF(HS)介质，依次用洗脱缓冲液20mmol/LPB+0.58mol/LNa2S04，pH7.0;20mmol/LPB+0.23mol/LNa2S04，pH7.0和注射用水分段洗脱，收集第二个洗脱缓冲液的洗脱峰。第二步Ni"螯合层析将第一步收集的洗脱峰上经过20mmol/LPB+0.5mol/LNaCl，pH7.0缓冲液平衡过的Ni2+-ChelatingS印haroseFF介质，用20mmol/LPB，pH7,0缓冲液洗脱并收集洗脱峰。第三步C,螯合层析将第二步收集的洗脱峰上经20mmol/LPB+0.15mol/LNaCl，pH7.0缓冲液平衡过的Cu2+—ChelatingS印haroseFF介质，分别用20關ol/LPB，pH7.0和20mmol/LPB+10mmol/L咪唑，pH7.0洗脱缓冲液进行洗脱，收集第二个洗脱缓冲液的洗脱峰。第四步阴离子层析将第三步收集的洗脱峰上QS印haroseFF介质，分别用20mmol/LPB+0.15mol/LNaCl,pH7.0禾卩20mtnol/LPB+0.25mol/LNaCl，pH7.0洗脱缓冲液进行洗脱，收集第二个洗脱缓冲液的洗脱峰，经0.22滤膜无菌过滤，即得到高纯度的可供制剂稳定性研究的重组人激肽释放酶-1原液。实施例2重组人激肽释放酶-1注射液I的制备处方重组人激肽释放酶-1(甲醇酵母)磷酸氢二钠磷酸二氢钠一水合物氯化钠甘露醇右旋糖酐-40200AU(活性终浓度为0.2AU/mL)1.732g1.077g8.775g10g10g制备工艺按上述处方中的量，称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、甘露醇、右旋糖酐-40，加入适量的注射用水充分溶解辅料后，用磷酸或NaOH调节pH值至7.0，再量取适量的重组人激肽释放酶-1加入其中，混匀，用注射水定容至lOOOml，过滤除菌，灌装，压塞、轧盖即可，得到重组人激肽释放酶-1注射液I。本发明在采用45。C加速试验时发现在pH7.0，含0.15mol/L氯化钠的20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系中，不含任何蛋白酶保护剂条件下配制0.2AU/ml规格的重组人激肽释放酶-1溶液，在45。C条件放置2周后重组人激肽释放酶-1活性会下降50%左右，而同时加入1%甘露醇与1%右旋糖酐-40组合用作重组人激肽释放酶-l保护剂的溶液，其活性基本稳定。见表l。表l45'C条件下，重组人激肽释放酶-l注射液I活性的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>试验显示，1%甘露醇与1%右旋糖酐-40组合应用对重组人激肽释放酶-1活性具有良好的保护作用。根据上述(实施例2)的配方和制备方法，分别获得三个批号的人激肽释放酶-1注射液(20070601，20070602，20070603)，对它们进行稳定性考察，见表2和3。表2人激肽释放酶-1注射液外观考察<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3人激肽释放酶-1注射液活性考察<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果表明人激肽释放酶-1注射液在4'C、25'C、37'C条件下放置九个月后溶液澄清无异常，活性稳定。实施例3重组人激肽释放酶-1注射液II的制备处方重组人激肽释放酶-1(CHO细胞)150AU(活性终浓度为0.15AL)/mL)磷酸氢二钠1.732g磷酸二氢钠一水合物1.077g氯化钠8.775g水解明胶10g制备工艺称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、水解明胶，加入适量的注射用水充分溶解辅料后，用磷酸或NaOH调节pH值至7.0，再量取适量的重组人激肽释放酶-1加入其中，充分混匀，用注射水定容至1000ml，过滤除菌，灌装，压塞、轧盖即可，得到人激肽释放酶-i注射液n。该处方选用了pH7.0，含0.15mol/L氯化钠的20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，1%水解明胶作蛋白酶保护剂。对该重组人激肽释放酶-1注射液II进行稳定性考察，见表4。表4重组人激肽释放酶-1注射液II于37'C条件放置的稳定'生考察放样时间(天)071421286090120150180外观溶液澄清未见变化未见变化未见变化未见变化未见变化未见变化未见变化未见变化未见变化活性(AU/ml)0.2200.2050.2010.2180.2070.1890.1930.1920.1800.172结果表明，本发明重组人激肽释放酶-1注射液n在0时检测的活性较理论活性提高了30%以上(水解明胶对照溶液本身无活性，而将其作为蛋白酶保护剂时可提高人激肽释放酶-1的生物活性值)，将重组人激肽释放酶-1注射液II在37'C条件下放置六个月后溶液澄清无异样、活性基本稳定。实施例4人激肽释放酶-1注射液III的制备处方人激肽释放酶-l(人尿中提取)1000AU(活性终浓度为1AU/mL)磷酸氢二钠1.732g磷酸二氢钠一水合物1.077g氯化钠8.775g右旋糖酐-4040g制备工艺称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、右旋糖酐-40，加入适量的注射用水充分溶解辅料后，用磷酸或NaOH调节pH值至7.0，再量取适量的重组人激肽释放酶-1加入其中，充分混匀，用注射水定容至1000ml，过滤除菌，灌装，压塞、轧盖即可，得到人激肽释放酶-i注射液ni。该处方选用了pH7.0，含0.15mol/L氯化钠的20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，4%右旋糖酐-40作蛋白酶保护剂。对人激肽释放酶-l注射液III进行稳定性考察。结果表明，本发明提供的人激肽释放酶-1注射液HI在37"C条件下放置六个月后溶液澄清无异样、活性基本稳定。实施例5激肽释放酶处方激肽释放酶-l(猪胰腺)磷酸氢二钠磷酸二氢钠一水合物氯化钠甘露醇甘氨酸注射液IV的制备200AU(活性终浓度为0.2AU/mL)1.732g1.077g8.775g40g10g制备工艺称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、甘露醇和甘氨酸，加入适量的注射用水充分溶解辅料后，用磷酸或NaOH调节pH值至7.0，再量取适量的激肽释放酶-1加入其中，充分混匀，用注射水定容至1000ml，过滤除菌，灌装，压塞、轧盖即可，得到激肽释放酶-i注射液iv。该处方选用了pH7.0,含0.15mol/L氯化钠的20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，4%甘露醇和1%甘氨酸组合作蛋白酶保护剂。对重组人激肽释放酶-1注射液IV进行稳定性考察。结果表明，本发明提供的激肽释放酶-l(猪胰腺)注射液IV在37t:条件下放置六个月后溶液澄清无异样、活性基本稳定。实施例6重组人激肽释放酶-1注射液V的制备按下表所列的配方和实施例2-5中所述的制备方法得到重组人激肽释放酶-l(甲醇酵母)注射液V。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>v代表选中表5中是重组人激肽释放酶-1注射液V存放在37'C下的活性结果(AU/mL)。表537'C条件下，重组人激肽释放酶-l注射液V活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>结果表明，本发明提供的重组人激肽释放酶-1注射液v中的保护剂在重组人激肽释放酶-1的保存过程中有很好的保护作用。对比例1-3各处方中成分如下所示，分别考察这三组处方在液体状态下，制剂中重组人激肽释放酶-1的生物活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>v代表该组配方选择了本辅料重组人激肽释放酶-1制剂规格定为0.1-0.3AU/mL/瓶，在进行制剂稳定性研究时，将原液浓度稀释致上述范围内进行。表6是重组人激肽释放酶-l在上述三组处方中，存放在37'C下，不同检测项目于各个检测点的活性结果(AU/mL)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>结果表明，所选用的保护剂能够较好地保持重组人激肽释放酶-1的稳定性37"C放样6个月后溶液澄清，活性保持在最初状态；与注射液V中的处方比较，对比例中重组人激肽释放酶-1的活性较低，说明水解明胶有提高其活性的作用，并保持很好的稳定性，这与实施例2的结果一致。实施例7-10含有人激肽释放酶-1的注射液VI-IX按下表所列的配方和实施例1-4中所述的制备方法得到含有人激肽释放酶-l(CHO细胞)的注射液VI—IX。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>v代表该组配方选择了本辅料表7所列是含有人激肽释放酶-1的注射液VI-IX存放在37"C下的活性结<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>结果表明，选用水解明胶作蛋白酶保护剂可以使人激肽释放酶-1保持在较高的活性，并具有很好的稳定性，水解明胶用量的越大，人激肽释放酶-l的活性越高；当水解明胶浓度在〉0.ly。(w/v)浓度时即可使人激肽释放酶-l在37°C条件放置6个月基本稳定。同时在上述实施例中，防腐剂尼泊金乙脂和尼泊金丙脂以0.02%等量混合时，于4'C放置一段时间后有晶体析出，表明0.02%的尼泊金乙脂和尼泊金丙脂等量混合不太适合在此温度下长时间存放，考虑到重组人激肽释放酶-1液体制剂主要是保存在4'C下，故而适当降低防腐剂的用量，选用两个剂量0.01%和0.005。/。。通过抑菌能力试验，最终确定0.01%的防腐剂用量，并且此用量在rc下并无任何晶体析出。实施例11含有重组人激肽释放酶-1的注射液x按下表所列的配方和实施例1-4中所述的制备方法得到含有重组人激肽释放酶-1(CHO细胞)的注射液X。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>V代表该组配方选择了本辅料表8所列是含有重组人激肽释放酶-1的注射液X存放在37t下的活性结果(AU/mL)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>置六结果表明，本发明提供的重组人激肽释放酶-1注射液X在37"C条件下放个月后溶液澄清无异样、活性稳定。实施例12含有重组人激肽释放酶-1的注射液XI按下表所列的配方和实施例2、6中所述的制备方法得到含有高浓度的重组人激肽释放酶-l(甲醇酵母)的注射液XI。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>v代表该组配方选择了本辅料结果表明，本发明提供的重组人激肽释放酶-i注射液XI在37X:条件下放置六个月后溶液澄清无异样、活性稳定。通过上述实施例2-12中各个不同实验组的37'C加速稳定性实验，发明人找到了几种对人激肽释放酶-1有稳定保护作用的物质一水解明胶、甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸及其组合物，能使激肽释放酶-1在37"C条件下，稳定180天。另外以尼泊金乙脂和尼泊金丙脂的等量混合(其优选用量为0.01%)作为防腐剂，能很好的抑制细菌等微生物污染。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。权利要求1.一种稳定的激肽释放酶-1注射液，其特征在于，所述的注射液中含有(1)激肽释放酶-10.05-40.00AU/ml；(2)磷酸盐缓冲液10-50mmol/L，pH6.0-8.0；(3)氯化钠0.01-0.2mol/L；和(4)蛋白酶保护剂0.01-20％(w/v)。2.如权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述的蛋白酶保护剂为0.5—10%;优选1一5%。3.如权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述的蛋白酶保护剂选自下述的一种或多种甘露醇、水解明胶、右旋糖酐、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡洛垸酮、甘氨酸、聚乙二醇；所述的蛋白酶保护剂优选自下述的一种或多种甘露醇、水解明胶、右旋糖酐、甘氨酸。4.如权利要求3所述的注射液注射剂，其特征在于，其中所述的甘露醇0.5-10%(w/v)，水解明胶0.1-10%(w/v)，右旋糖酐0.5-10%(w/v)，甘氨酸0.05-2%(w/v);优选所述的甘露醇l-4%(w/v),水解明胶1-3%(w/v)，右旋糖酐1-4%(w/v)，甘氨酸0.5-1°/。(w/v)。5.如权利要求1所述的注射液，其特征在于，激肽释放酶-1是天然提取或重组的；优选重组人激肽释放酶-l。6.如权利要求l所述的注射液，其特征在于，其中所述的磷酸盐缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对；所述的氯化钠为0.1-0.2mol/L;所述的右旋糖酐选自右旋糖酐-20、右旋糖酐-40或右旋糖酐-70。7.如权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述的溶液中还含有0.005-0.02。/。(w/v)防腐剂。8.—种如权利要求l所述的注射液的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(a)将磷酸盐、氯化钠、蛋白酶保护剂和注射用水混合；(b)用磷酸或NaOH调节pH6.0—8.0;和(c)加入激肽释放酶-1后注射用水定容，得到如权利要求1所述的稳定的激肽释放酶-l注射液。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对。10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中还可以加入防腐剂，使步骤(c)中所得到的注射液中含有O.005-0.02y。(w/v)防腐剂。全文摘要本发明公开了一种稳定的激肽释放酶-1注射液，所述的注射液中含有(1)激肽释放酶-10.05-40.00AU/ml；(2)磷酸盐缓冲液10-50mmol/L，pH6.0-8.0；(3)氯化钠0.01-0.2mol/L；和(4)蛋白酶保护剂0.01-20w/v％。本发明公开的含有激肽释放酶-1的稳定的注射液中蛋白的稳定性好；不含人血白蛋白作为保护剂，避免了增加引入外源性病毒的潜在危险；而且制作简便，成本低。文档编号A61K9/08GK101596311SQ20081003842公开日2009年12月9日申请日期2008年6月2日优先权日2008年6月2日发明者张淑芸,曹嘉炜,英沈,潘学工,王书生,陈佩新,陈耀国,黄秀东申请人:上海万兴生物制药有限公司