专利名称：去除前激肽释放酶的、血浆来源的白蛋白组分的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备前激肽释放酶活化因子(PKA)减少的富含白蛋白的组分的方法，和可根据本发明方法获得的前激肽释放酶活化因子(PKA)减少的含白蛋白的组分。
含白蛋白的制剂用作需要该制剂的患者的输注溶液。为了获得更接近生理的环境，灌注到患者体内的液体代用材料(substitution)不仅含有生理浓度的盐，还含有作为增容剂的白蛋白。白蛋白制剂可能会含有前激肽释放酶活化因子(PKA)，其导致非必要的副作用，这可能是由于前激肽释放酶活化因子干扰肾素-血管紧张素系统。
本发明的目的是降低血浆来源的、含白蛋白组分中的PKA含量。另一个目的是提供PKA值降低的含白蛋白的组分。
制备前激肽释放酶活化因子(PKA)减少的富含白蛋白的组分的方法实现了这一目的，该方法包括以下步骤(f)重构糊状物V(科恩分部分离)；(g)对步骤(a)中获得的组分进行浓缩步骤；(h)在50℃-70℃对步骤(b)中获得的组分加热足够的时间，以对组分进行巴氏杀菌；和(i)任选地灌注所得的组分，备用。
在本发明的一个实施方案中，在灌注后进行第二次巴氏杀菌步骤。
具体地，孵育步骤于50-70℃进行至少5小时，具体是10小时。
从重构糊状物V和任选地加入助滤剂开始，优选用孔径约为0.2μm的滤器进行过滤。必要的话，必须进行pH调节。pH应在7.2-7.6的范围内。通常超滤至8％(w/v)蛋白质含量，然后进行透滤和再一次超滤，用来浓缩蛋白质。这导致蛋白质浓度至少为20％。然后优选用孔径约为0.2μm的滤膜进行再一次过滤。
加入稳定剂，例如每g白蛋白加入各为0.08mmol的N-乙酰-DL-色氨酸和辛酸钠，然后将pH调节至6.7-7.3。调节蛋白质和钠含量，优选在58℃-65℃的范围内进行整体巴氏杀菌至少9小时。该步骤之后是除菌过滤。样品于2℃-25℃保存少于2周。将白蛋白无菌体进行进一步的最终除菌过滤和灌注。灌注后可以在如前所述的相似条件下进行第二次巴氏杀菌步骤。还可以增加另一孵育步骤。经肉眼检查后，制剂即可保存和施用。
本发明的方法还提供了前激肽释放酶活化因子(PKA)减少的含白蛋白的组分。
本发明白蛋白中PKA含量小于12IU/ml，优选小于10IU/ml，其中PKA根据欧洲药典第四版，2.6.15，第147-148页加以测定。
还通过下面的非限制性实施例进一步描述了本发明。
实施例实施例1于-2±2℃将糊状物V悬浮于1.6倍重量的注射用水中＞6小时。向产物中加入助滤剂，并将制剂搅拌30分钟。将深滤器(depth filter)用注射用水并随后用10％(v/v)的乙醇预洗涤。将溶液通过深滤器和随后的0.2μm膜滤器进行净化。滤器再用10％的乙醇注射用水溶液洗涤。用3M氢氧化钠溶液调节pH至7.4±0.2。
通过排阻限为10kDalton的膜进行超滤，获得8％的蛋白质浓度。将浓缩物用≥3倍量的0.5M氯化钠溶液进行透滤，然后用≤3倍量的注射用水进行透滤。透滤后，于≤+15℃进行超滤，将白蛋白溶液浓缩至蛋白质浓度约为22％。将溶液通过深滤器和随后的0.2μm膜滤器进行净化。深滤器用注射用水预洗涤。
然后，将0.0106g辛酸/g蛋白质和0.0182gN-乙酰-DL-色氨酸/g蛋白质溶解于10％(w/v)的氢氧化钠中，并缓慢搅拌加入到白蛋白溶液中。将pH调节至7.0±0.3。加入注射用水将白蛋白溶液调节至蛋白质浓度为200±10g/l。加入氯化钠将钠含量调节至150±7.5mmol/l。于58-65℃将溶液搅拌至少9小时。将白蛋白溶液通过标称孔径通常为0.2μm的除菌级滤膜进行除菌过滤。通过生产商说明书所推荐的合适测试方法验证使用前后除菌滤器的完整性。将经除菌过滤的白蛋白于+2℃-+25℃保存不超过2周。使用终端0.2μm除菌滤器在无菌条件下将无菌溶液灌注到去除致热源(depyrogenated)的输注瓶中，用灭菌的丁基塞封闭，并用铝盖密封。通过生产商说明书所推荐的合适测试方法验证使用前后除菌滤器的完整性。在整个灌注过程中监测灌注体积。根据欧洲药典进行巴氏杀菌。根据欧洲药典对最终的容器进行孵育。孵育后，肉眼检查所有瓶的颗粒状杂质、浊度、瓶和封闭物的缺陷。弃除有缺陷的制剂。将所有瓶保存于+2℃-+25℃。
实施例2于-2±2℃将糊状物V悬浮于1.6倍重量的注射用水中＞6小时。向产物中加入助滤剂，并将制剂搅拌30分钟。将深滤器用注射用水并随后用10％的乙醇预洗涤。将溶液通过深滤器和随后的0.2μm膜滤器进行净化。滤器再用10％的乙醇注射用水溶液洗涤。用3M氢氧化钠溶液调节pH至7.4±0.2。通过排阻限为10kDalton的膜进行超滤，获得8％的蛋白质浓度。将浓缩物用≥3倍量的0.5M氯化钠溶液进行透滤，然后用≤3倍量的注射用水进行透滤。透滤后，于＜+15℃进行超滤，将白蛋白溶液浓缩至蛋白质浓度约为26％。将溶液通过深滤器和随后的0.2μm膜滤器进行净化。深滤器用注射用水预洗涤。然后，将0.0106g辛酸/g蛋白质和0.0182gN-乙酰-DL-色氨酸/g蛋白质溶解于10％的氢氧化钠中，并缓慢搅拌加入到白蛋白溶液中。将pH调节至7.0±0.3。加入注射用水将白蛋白溶液调节至蛋白质浓度为250±12g/l。加入氯化钠将钠含量调节至150±7.5mmol/l。于58-65℃将溶液搅拌至少9小时。将白蛋白溶液通过标称孔径通常为0.2μm的除菌级滤膜进行除菌过滤。通过生产商说明书所推荐的合适测试方法验证使用前后除菌滤器的完整性。将经除菌过滤的白蛋白于+2℃-+25℃保存不超过2周。使用终端0.2μm除菌滤器在无菌条件下将无菌溶液灌注到去除致热源的输注瓶中，用灭菌的丁基塞封闭，并用铝盖密封。通过生产商说明书所推荐的合适测试方法验证使用前后除菌滤器的完整性。在整个灌注过程中监测灌注体积。根据欧洲药典进行巴氏杀菌。根据欧洲药典对最终的容器进行孵育。孵育后，肉眼检查所有瓶的颗粒状杂质、浊度、瓶和封闭物的缺陷。弃除有缺陷的制剂。将所有瓶保存于+2℃-+25℃。
实施例3于-2±2℃将糊状物V悬浮于1.6倍重量的注射用水中6小时。向产物中加入助滤剂，并将制剂搅拌30分钟。将深滤器用注射用水并随后用10％的乙醇预洗涤。将溶液通过深滤器和随后的0.2μm膜滤器进行净化。滤器再用10％的乙醇注射用水溶液洗涤。用3M氢氧化钠溶液调节pH至7.4±0.2。通过排阻限为10kDalton的膜进行超滤，获得8％的蛋白质浓度。将浓缩物用≥3倍量的0.5M氯化钠溶液进行透滤，然后用≤3倍量的注射用水进行透滤。透滤后，于低于+15℃进行超滤，将白蛋白溶液浓缩至蛋白质浓度约为22％。将溶液通过深滤器和随后的0.2μm膜滤器进行净化。深滤器用注射用水预洗涤。然后，将0.0106g辛酸/g蛋白质和0.0182g N-乙酰-DL-色氨酸/g蛋白质溶解于10％的氢氧化钠中，并缓慢搅拌加入到白蛋白溶液中。将pH调节至7.0±0.3。加入注射用水将白蛋白溶液调节至蛋白质浓度为200±10g/l。加入氯化钠将钠含量调节至150±7.5mmol/l。于58-65℃将溶液搅拌至少10小时。将白蛋白溶液通过标称孔径通常为0.2μm的除菌级滤膜进行除菌过滤。通过生产商说明书所推荐的合适测试方法验证使用前后除菌滤器的完整性。将经除菌过滤的白蛋白于+2℃-+25℃保存不超过2周。加入注射用水将白蛋白溶液调节至蛋白质浓度为50±2.5g/l。将pH调节至7.0±0.3。加入氯化钠将钠含量调节至150±7.5mmol/l。将白蛋白溶液于+2℃-+25℃保存不超过24小时，直至灌注。使用终端0.2μm除菌滤器在无菌条件下将无菌溶液灌注到去除致热源的输注瓶中，用灭菌的丁基塞封闭，并用铝盖密封。通过生产商说明书所推荐的合适测试方法验证使用前后除菌滤器的完整性。在整个灌注过程中监测灌注体积。根据欧洲药典进行巴氏杀菌。根据欧洲药典对最终的容器进行孵育。孵育后，肉眼检查所有瓶的颗粒状杂质、浊度、瓶和封闭物的缺陷。弃除有缺陷的制剂。将所有瓶保存于+2℃-+25℃。
前激肽释放酶活化因子前激肽释放酶活化因子(PKA)将前激肽释放酶活化为激肽释放酶，可以通过其从合成的肽底物切割生色团的能力来进行分析，通过分光光度法测定切割速率，通过和以国际单位校准的参照制剂相比较来计算PKA的浓度。
国际单位是由冻干的前激肽释放酶活化因子组成的规定量国际标准品的活性。国际标准品的国际单位当量由世界卫生组织规定。
制备前激肽释放酶底物为了避免凝血激活，用来制备前激肽释放酶的血液或血浆必须只和塑料或硅氧烷处理的玻璃表面接触。取9倍体积的人血液到1倍体积的、预先加有1mg/ml海地美溴铵的抗凝溶液(ACD、CPD或38g/l柠檬酸钠)中。将混合物于3600g离心5min。分离血浆，并再于6000g离心20min，以沉降血小板。分离贫血小板血浆，用10倍体积的缓冲液A透析20h。将透析后的血浆加到含琼脂糖-DEAE的层析柱上进行离子交换层析，所述的琼脂糖-DEAE事先用缓冲液A平衡，其等于血浆体积的两倍。用缓冲液A以20ml/cm2/h的速率从柱上洗脱。收集级分中的洗脱物，并记录280nm处的吸光度(2.2.25)。合并含第一蛋白峰的组分，从而使合并物的体积约为贫血小板血浆的1.2倍。
通过将1份和用于分析的20份预温生色底物溶液混合并于37℃孵育2min，验证底物合并物不存在激肽释放酶活性。如果吸光度的增加小于0.001/分钟，则底物是合适的。向每升合并的溶液加入7g氯化钠，并使用膜滤器(孔径0.45μm)过滤。将滤液分装(in portions)冷冻，并于-25℃保存；底物可以在保存之前冻干。
在一个工作日内进行从开始层析到分装冷冻的所有过程。
分析优选使用自动酶分析仪于37℃进行分析，调整底物的体积、浓度和孵育时间，使反应速率至少到35IU/ml时是线性的。必要的话，使用缓冲液B稀释标准品、样品和前激肽释放酶底物。
将稀释的标准品或样品与前激肽释放酶底物孵育10min，使未稀释样品的体积不超过孵育混合物总体积的1/10，以避免孵育混合物中离子强度和pH变化所导致的误差。将混合物或其一部分和至少等体积的、合适的、合成的、溶解于缓冲液B中的显色底物溶液一起孵育，所述的显色底物已知对激肽释放酶是特异的(例如N-苯甲酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酸4-硝基苯胺醋酸盐R或D-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酸4-硝基苯胺-二盐酸盐R)。记录所用底物特异的波长处每分钟的吸光度变化速率，记录2min-10min。使用缓冲液B而非前激肽释放酶底物制备每个样品或标准品混合物的空白对照。减去相应空白对照获得的值来校正ΔA/min。使用参照制剂和各浓度获得的值绘制标准曲线；使用该曲线确定待验证制剂的PKA活性。
缓冲液A三羟甲基氨基甲烷 6.055g氯化钠 1.17g海地美溴铵 50mg叠氮钠 0.100g
将这些成分溶解于水中，用2M盐酸调节至pH8.0，并用水稀释至1000ml。
缓冲液B三羟甲基氨基甲烷 6.055g氯化钠 8.77g将这些成分溶解于水中，用2M盐酸调节至pH8.0，并用水稀释至1000ml。
*IPBP大规模巴氏杀菌工艺中(in process bulk pasteurization)**n.a.不适用(not applicable)
权利要求
1.制备前激肽释放酶活化因子(PKA)含量降低的富含白蛋白的组分的方法，包括下述步骤(a)重构糊状物V(科恩分部分离)；(b)对步骤(a)中获得的组分进行浓缩步骤；(c)在50℃-70℃对步骤(b)中获得的组分加热足够的时间，以对组分进行巴氏杀菌；和(d)任选地灌注所得的组分，备用。
2.权利要求1的方法，其中灌注后进行第二次巴氏杀菌步骤。
3.权利要求1和/或2的方法，其中进行孵育步骤。
4.权利要求3的方法，其中在下列条件下进行孵育步骤30-32℃10天或20-25℃4周。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中巴氏杀菌在58-65℃温度下进行至少9h的时间。
6.根据权利要求1-5中任意一项的方法获得的前激肽释放酶活化因子(PKA)减少的含白蛋白的组分。
7.权利要求6的白蛋白，PKA含量小于12IU/ml，优选小于10IU/ml，其中PKA根据欧洲药典第四版加以测定。
全文摘要
前激肽释放酶活化因子(PKA)含量降低的含白蛋白的组分，和包括下列步骤的其制备方法(a)重构糊状物V(科恩分部分离)；(b)对步骤(a)中获得的组分进行浓缩步骤；(c)在50℃－70℃对步骤(b)中获得的组分加热足够的时间，以对组分进行巴氏杀菌；和(d)任选地灌注所得的组分，备用。
文档编号A61K38/38GK1717249SQ200380104131
公开日2006年1月4日 申请日期2003年11月25日 优先权日2002年11月25日
发明者维尔纳·格林格, 卡塔琳娜·波克 申请人:奥克塔法马股份有限公司