偶合到用于成像表达肽酶的组织和器官的肽酶结合部分的放射影像部分的制作方法

专利名称：偶合到用于成像表达肽酶的组织和器官的肽酶结合部分的放射影像部分的制作方法
偶合到用于成像表达肽酶的组织和器官的肽酶结合部分的放射影像
部分
相关申请的交叉应用
本申请要求2006年8月29日提交的美国临时申请60/823， 884的优先权，该临时申请公开的全部内容通过引用全部结合到申请中。
感谢
本项工作得到了全国健康协会(NIH)的拨款支持，即健康和人类服务部门，l-R43-HL075918-01。联邦政府对本发明有一定的权利。
引言
许多组织(包括血液)和器官表达不同水平的肽酶(也称为蛋白酶、朊酶和蛋白水解酶)。表达水平根据和组织或器官相关的病理学条件(或缺失病理学条件)也可能不同。例如，已经知道，在心力衰竭受害者的心肌中发现了高水平的血管紧张肽转化酶(ACE)。
，ft^5数据库G"tp:/'膨roi,s. s(mw「. m'"ik')是肽,及抑制
肽酶的蛋白质的信息源。i/fiw/^sm据库也含有所选择肽酶的小分子
抑制剂的清单。参考Rawlings， N. D. , Morton, F. R. & BarrcU，A. J. (2006)認the peptidase database,船c2eid/c^/ ca、34， D270-D272。该数据库的内容，特别是7. 5版，通过应用结合到本发明的说明书中。
作为肽酶的抑制剂，这些分子(无论是大分了如蛋白质，或小分子，包括肽酶和现有的药物或或候选药物)也结合到肽船上，它们抑制一定的亲和力。
ACE:示例的肽酶
尽管降低死亡率的趋势归因于缺血性心脏病和中风，但是，在美国，充血性心力衰竭的流行和由此导致的死亡率在过去三十年几
乎超过了三倍。参考S.Y. Chai， F. A. 0. Mendelsohn, G. Paxinos，7fe〃roscie/7ce， 20: 615-627 (1987)。据估计，在接下来的二十年，由于冠心病导致的心力衰竭将超过所有的传染病，从而变成世界上造成死亡的主要原因。参考M.R. Cowie， D. A. Wood, A. J. S Coats,S. G. Thompson, P. A. Poole-Wilson， V. Suresh， G. C. Sutton, f〃r.hearty: ， 20: 421-428 (1999)。
因此，需要更新和更好的方法来诊断、治疗和监测某些疾病的进展，如心力衰竭。
赖诺普利， 一个示例的肽酶结合部分
赖诺普利， 一种临床应用的ACE抑制剂，用于治疗充血性心力衰竭和高血压，己经显示能够直接对ACE抑制。根据充血性心力衰竭患者的心脏切片的初步放射自显影的结果，参考V. Dilsizian， J.Shirani， Y. H—C. Lee， D. Kiesewetter， E. M. Jagoda， M丄Loredo，W. C. Eckelman，104:17, 3276 (2001)，发明人确信ACE可能是有吸引力的、用于心力衰竭的诊断、确定和治疗的分子靶。类似的，发明人相信，在某些组织和器官中，其它肽酶的过表达可以开发用于诊断、治疗和监测多种病理症状的进展。这些病理症状包括但不限于心力衰竭、心肌症、肺病、肾功能不全、肾衰竭、炎症、动脉硬化、易损动脉斑块或肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌，等等。其它的病理症状包括心脏血管疾病，通常包括糖尿病肾病、过量组织ACE活性、非胰岛素依赖糖尿病或高血压导致的慢性肾病、高血压外围血管疾病、肺气肿(或慢性阻塞型肺气肿-C0PD)，等等。

发明内容
本发明涉及一系列的偶联物，该偶联物将肽酶结合部分(如抑制肽酶的物质)和放射性药物部分(包括放射性治疗和声像部分)或光学影像部分合并。肽酶包括但不限于外肽酶(如羧肽酶和氨妝酶)和内肽酶(如丝氨酸肽酶、半胱氨酸肽酶、天冬氨酸肽酶和金属内切肽酶)。"部分"是能够独立于另一部分存在的分子。因此，单独的取代基(如官能团)，如羟基、卤素，等等，在本发明中不是"部分"。
在本发明的具体实施方案中，公开了一系列的偶联物，该偶联
物基于金属螯合物和赖诺普利(二肽羧肽酶的抑制剂，a.k.a.血管
紧张肽转化酶)的偶联。因此，对一系列基于赖诺普利的配位体(下
面将进一步叙述)进行了合成和评价，能够结合金属物质(如M(CO):,)。合适配位体的实例包括但不限于二-(2-吡啶甲撑基)胺、二-(2-喹啉甲撑基)胺、二-(2-异喹啉)胺及类似物，这些配位体通过脂肪系链配位到赖诺普利或其它肽酶结合部分。体外试验分析证实，增加脂肪系链中的甲撑基的数目，导致抑制剂效能的增加。在存在或不存在赖诺普利的情况下，用正常的鼠研究了针对ACE的体内试验。这些体内试验研究证实组织内放射指示剂和高含量的ACE—起定位，所述定位用赖诺普利预处理阻断。
在本发明的另一实施方案中，公开了系列新型的"'"Tc-标记的ACE抑制剂的制备。这些偶联物具有监测体内ACE表达的能力，可以用于心血管疾病的分级，特别是充血性心力衰竭的分级。令人惊讶的，该系列中最有效的化合物，99l'Tc-D(C8)L，是能忍受最长链的化合物。该偶联物在ACE过表达的动物模型中评价，目的是评价其针对和分级心力衰竭(如通过定量ACE在心肌中的表达)的能力。相应的，表达ACE的组织或器官的成像方法是本发明的一个应用。在ACE表达的一个具体实例中，公开了一种成像肺组织、肾组织、心肌组织、肿瘤组织或这些组织的结合的方法。
本发明也涉及偶联到肽酶结合部分的光学成像部分(如荧光、化学发光或磷光)，例如，非放射性(及"冷却的")铼螯合物以二-(2-喹啉甲撑基)胺或二- (2-异喹啉)胺作为螯合配位体，连接到肽酶结合部分。光学成像的应用实例在Wei L， BabichJW， OuellcttcW, ZubietaJ. ，Developing the {M (CO) 3} + core for fluorescenceapplications: Rhenium tricaxbonyl core complexes withbenzimidazole， quinoline, and tryptophan derivatives. InorgChem. 2006 Apr 3 ;45 (7) :3057-66和James S, Maresca KP， BabichJW， Valliant JF， Doering L， Zubieta J. ， Isostructural Re and99mTc complexes of biotin derivatives for fluorescence andradioimaging studies. Bioconjug Chem. 2006
May-Jun;17(3) :590-6中进行了公开。本发明也包括将放射性治疗部分作为肽酶结合部分的偶联剂。术语"放射性治疗部分"意指包括放射影像部分、放射治疗部分或二者。放射治疗部分的实例可能是铼-186或铼-188三(羰基)二_ (2-吡啶甲撑基)胺螯合物。


图l显示了偶联到赖诺普利(L)的二-(2-吡疲甲撑基)胺(D)螯合物制备的合成路线。
图2显示的是赖诺普利和D(CJL化合物在体内生化试验中的剂
量曲线。
图3显示的是"'"Tc-D(C5)L在正常和赖诺普利预处理(1 mg/kg,i.v. ) 15分钟的Sprague Dawley鼠中的组织分布。
图4显示的是Sprague Dawley鼠中，'Tc-D (C「、) L的放射成像(左侧没有用赖诺普利预处理；右侧用赖诺普利预处理)。
图5显示的是配位体和相应的配位体金属络合物。配位体和配位体金属络合物可以和肽序列的C-端或N-端连接。
图6显示的是连接到氨基官能度的配位体和相应的配位体金属络合物。
图7显示的是连接到羧基官能度的配位体和相应的配位体金属络合物。
图8显示的是本发明化合物包括螯合步骤的合成路线图。图9为对照(A)和，Tc(C0)處)L (MIP-1037)注射10分钟后赖诺普利预处理的(B)的体内分布所示的整体平面图的正视图。图10显示的是小动物SPECT/CT图，该图显示的是对照鼠(A)注射""'Tc(C0)3D(")L (MIP-1037)后肺的活性，其中在赖诺普利预处理的(B)中没有出现。
图ll显示的是条形图中表II的结果。
具体实施例方式
在本发明的优选实施例中，制备了成像ACE表达的探针。赖诺普利("L")， ACE的抑制剂，用作起始药理学基序。二- (2-吡啶甲基)胺("D")，能够结合1(0))3+ [M 二 Tc或Re]的配位体，通过在赖诺普利赖氨酸残基的e -胺处形成的酰胺键和赖诺普利结合。配位体包含有脂肪链，该脂肪链含有不同数目的次甲基间隔断基团(3、 4、 5和7;分别指定的D(C4)L、 D(Cs)L、 D(CJL和D(C8)L)。参考图1。
ACE抑制对照使用比色测定的鼠肺ACE在体外评价。用正常的雄性Sprague Dawley鼠在注射后15、 60和120分钟、通过研究存在& = 6/时点)或不存在(n二4/时点)赖诺普利(l mg/kg i.v.)的组织分布和间隔对ACE的体内特异性进行"7c-D (C。 L测定。
实施例
说明书中引用的文献的全部内容通过引用结合到本申请中。偶联物的制备
从LKT实验室(Saint Paul, MN)屮获得赖诺普利。根据文献中公开的方法，进行细微的变化，合成所有的配位体。参考M.K.Levadala, S. R. Banerjee, K. P. Maresca, J. W. Babich, J. Zubicta5>/7^ ew's 11: 1759-1766 (2004); L. Wei, J. Babich, W. C.Eckelman， J. Zubieta, /細？. C/ e瓜，44: 2198-2209 (2005)。用HT实验室(San Diego， CA)的电喷雾质谱和DesertAnalytics (Tucson, AZ)进行元素分析。
D(C4)L (1):产量二40% (0.68 g) 。 NMR (CDCl.,， ppm) : 8.50(m， 2H), 7.62 (tn 2H) ， 7.43 (m， 2H) ， 7.13 (m， 8H) ， 3.85 (m， 411)，3.69-2.60 (mm, IIH)， 2.26-1.41 (mm, 16H) 。 MS (ESI):历A 674 (M+ 1)， / A 672 (M— -1)。分析计算的C:,7仏美0,，. 1.5H20: C， 63.50; H，7.35; N， 12.01; 0, 17.15。实测:C' 63.44; H， 7.11; N， 12.24，0, 17, 17. (MIP-1039)
D(C5)L (2):产量二34% (0.61 g). 力NMR (CDC13，卯m) : 8.51(m， 2H)， 7.65 (m2H), 7.51 (m， 2H)， 7.13 (m， 8H)， 3.92 (d， 4H),3.69-2.65 (咖，IIH)， 2.27-1.46 (mm, 18H). MS (ESI): 688(M++1),历/z686 (M—-1). 分析计算C38H5()N6Ofi' H20: C, 64.75; H，7.44; N， 11.92; 0， 15.89。实观!j: C， 64.77; H， 7,35; N， 11.92;0， 16.07. (MIP-1003)。
D(C6)L (3):产量二13% (0. 23 g). 'H NMR (CDCL， ppm) : 8. 50(m, 2H), 7.64 (m 2H) ， 7.49 (m， 2H) ， 7.15 (m， 8H) ， 3.86 (d， 4H)，
3.68- 2.60 (mm， IIH)， 2.26-1.41 (mm, 20H). MS (ESI):历/z 702(M++l)，历/z 700 (M一-l).分析计算C39H52N6(V 2. 5 H20: C, 62.80;H， 7. 7。；N， 11.27;0， 18.23。实测:C， 62.82;H， 7. 47;N， 11.40;0, 17.91。
D(C8)L (4):产量=35°/。 (0.57 g). 'H NMR (CDC1:!， ppm): 8.50(d， 2H), 7.63 (m2H)， 7.50 (m， 2H) ， 7.13 (m， 8H) ， 3.85 (d， 4H)，
3.69- 2.53 (mm, IIH)， 2.23-1.22 (mm, 24H). MS (ESI):历/z 730(M+ +1)，历/z 728 (M— -1). 分析计算UH掘,,H": C， 65.93H， 7.83; N, 11.25; 0， 14.99。实领"C， 65.64; H， 8.21; N， 11.20;0, 14.48. (MIP-1037)。
体外分析
根据生产者的说明(Fujirebio)，用商业上获得的体外生物i式
验对每个化合物的浓度范围抑制/7"羟基苯甲酰-甘氨酸L-组気酰基
-L-亮氨酸的ACE分裂的能力进行了检测。选择用于分析的ACE酶源为提纯的鼠肺ACE (Sigma)， 3.3mU/样品。赖诺普利在每个试验中作为阳性对照。图2显示的是这种分析产生的数据实例。用鼠肺ACE、赖诺普利、D(CjL、 D(C。L、 D(Ce)L和D(C》L分别得到2. 5 nM、 83. 3 nM和42. 8 nM、 42. 5 nM禾口 19. 5 nM的IC4直。IC"直证实，尽管D(C。L (组织19.5 nM)不是和赖诺普利(组织2.5 nM)—样有功效，但是和D(C4)L (组织83.3 nM)相比，则更有功效。总之，体外分析证实随着联吡啶和核赖诺普利部分之间次甲基数目的增加，活性也在增加。
类似的，可以评价基于偶联到给定肽酶小分子抑制剂的螯合部分的偶联能力。表1列出了实例的肽酶数目及其基质。表2列出了所选择的肽酶的小分子抑制剂的示例数目。参考Moskowitz， D. W.Z^"es :Tec力/ o^j《77 era，^z'cs (2002) 4 (4) : 519-532 ，其中进一步讨论了特定疾病状态及和ACE相关的小分子抑制剂。
体内分析
正常雄性Sprague Dawley鼠分组进行了^Tc-D(C5)L组织分布和间隔的定量分析。在接受测试化合物之前，动物接受1 mg/kg的赖诺普利5分钟，从而阻断靶器官的具体吸收，由此证实假设的体内作用机理。在所有测试的组织中检测""Tc-D(Cs)L，其在整个试验过程中稳步减少。在肺中观察到吸收在注射15分钟后接近0. 75±0. 14Q/oID/g (图3)。 ""'Tc-D(Cs)L通过肾、肝和肠中化合物的水平证实了肾和肝胆二者的间隔。在注射放射标记的化合物之前，用lmg/kg的赖诺普利预处理5分钟，降低了肺中化合物吸收和保留(O. 11±0.02%ID/g)，这表示"'"Tc-D (CJ L特别结合体内ACE。
对于成像研究，将动物放置在Y照相机上，得到由5个L分钟连续图像组成的基线平面正视图。当在肠胃道和肝脏屮检测到一个化合物的强信号，9%'Tc-D(CJL显示了肺吸收，该吸收被赖诺普利(图4)预处理阻断，证实了组织分布研究中的检测结果。
ACE比色测定试验报告
根据生产者的说明书，血管紧张素转换酶(ACE)的活性用ACE彩色套件(Fujirebio)进行测定。ACE作用于；^羟基苯甲酰-廿氨酸L-组氨酰基-L-亮氨酸，产生F羟基苯甲酰-甘氨酸，其通过马尿酸响:转化成r羟基苯甲酸。^羟基苯甲酸和氨基安替比林通过偏高碘酸钠氧化和浓縮生成醌亚胺染料。醌亚胺染料的浓缩通过其在505 nm处的最大吸收进行定量测定。在ACE比色测定中，该试验用于比较
铼标记的ACE抑制剂的组织和血浆特异性。
嚴虛淳游吝y备，不用抗凝剂，用注射器和16-规针心脏穿刺从正常鼠
取血，并将其输送到15 ml的圆锥管中。该管用冰冷却30分钟，使血凝结。除去凝结的血，剩下的血清在室温、5,000 X g分离10分钟。回收上清液，用0.22微米的过滤器过滤。
^^y虔/备，从Fujirebio购得ACE彩色套件，根据生产者的说明进行试验用5.6 ml的缓冲液重建基质，用5.6 ml的缓冲液重建对照，用15.5 ml的滴液(stopper solution)重建显色剂。鼠肺ACE (Sigma A6778)重构成1单位/3 ml水的浓度。
^f^^^法根据下表，将它们分别不同的量加入到样品或对照试管中，以测定血清和组织ACE的最佳浓度。
0 2. 5 5 10 15 20 uL血淸
5 10 25 50 uL组织ACL:
然后加入基质或对照溶液(125 u L)，在37 °C培养20分钟。加入显色剂溶液，在37 °C培养3分钟。通过在分光光度计上测定505 nM吸光度来测定测试化合物的活性。血清ACE (25 i^L)和组织ACE (3.3 m单位)的最佳量用于测定铼标记的ACE抑制剂的特异性。制备测试化合物，包括赖诺普利和卡托普利(50 uM备料)，并逐次稀释10倍，最终的浓度范围为1 uM-0. lnM (10 ixL/试管)。如上所述进行试验。
表l:选择的肽酶和肽酶的基质羧肽酶Al基质Bz-Gly-PheDns-Gly-Gly-PheDns-Gly-Gly-TrpDns-Gly-PheDns-Gly-TrpZ-Gly-Gly-LeuZ-Gly-Gly-PheZ-Gly-Gly-Val
羧肽酶A2基质
Z-Gly-Gly-LeuZ-Gly-Gly-PheZ-Gly-Gly-TrpZ-Gly-Trp
羧肽酶B基质
Bz-Gly-Arg Bz-Gly-基s呋喃丙烯酰基-Ala-Arg
肥大细胞羧肽酶A
羧肽酶D基质
丹酰-Phe-Ala-Arg
羧肽酶E
羧肽酶G，羧肽酶Gl，羧肽酶G2基质
叶酸
羧肽酶M
羧肽酶N
羧肽酶Y
基质
Z-Gly-Leu
羧肽酶Z
羧肽酶T
Serine羧肽酶A基质
Bz-Tyr-0Et
丹酰-D-Tyr-Val-NH2
呋喃丙烯酰基-Phe-Phe
Z-Glu-Tyr
Z-Phe-Ala
Z-Phe—Leu
Z-Phe-Phe
表2:所选择肽酶的小分子抑制剂
141W944-羟基-5， 6-二氢-2-吡喃酮衍生物
ABT-378 ABT-538
Ac-Asp-Glu-Val-Asp-H
Ac-DEVD-CH0
Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-H
Ac-Leu-Leu-Arg-H
Ac-Leu-Leu-Met-H
Ac-Leu-Leu-Nle-H
Ac-PRLNvs
Ac-Pro-Arg-Leu-AsnVS Ac-Trp-Glu-Hi s-Asp-H Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-H Ac-WEHD-CH0 Ac-YVAD-CHO 脑啡肽酶抑制剂(前体)
N-乙酰基-天冬氨酰基-谷氨酰基-异戊氨酰-天冬氨酸甲醛 N-乙酰基-L-亮氨酸-L-亮氨酸-D, L-a精氨酸甲醛 N-乙酰基-色氨酰基-谷氨酰基-组氨酸基-天冬氨酸甲醛 放线酰胺素
Ada-Ahx3-L3VS
AdaAhx(3)L(3)VS
AEBSF
AG-1343
AG7088
安瑞那韦AGM-1470
阿利克仑
ALLM ALLN
allophenylnorstatine-包含抑制齐!j 抑氨肽酶肽 -3-氨基-2-羟基-5-甲基己酰基]-Val-Val-Asp 2-(5-氨基-6-氧-2-苯基-嘧啶-l-基)-N-[1-羟基-3-甲基-l-(5-叔 丁基_1， 3， 4-噁二唑-2-基)丁烷-2-基]乙酰胺
2-氨基-N-[5-(6-二甲基氨基嘌呤-9-基)-4-羟基-2-(羟甲基)草脲 胺-3-基]-3- (4-甲氧苯基)丙酰胺
安普那韦 抗蛋白酶 apstatin
替拉那韦 阿加曲班 奥代美宁A 奧代美宁B
阿扎那韦 azido苯丁抑制素
杆菌肽A
巴马司他
BB-2516
BB-94
苯甲脒
(1S-苯甲基-4R- [1- (1S-氨基甲酰_2-苯乙基氨基甲酰)-1S-3-丁基氨基甲酰]_21^-羟基-5-苯戊基}氨基甲酸叔丁基酯
甲基苯甲氧羰基羰苯基丙氨酰精氨酰重氮甲烷
苯甲磺酰氟
苯丁抑制素
苯丁抑制素类似物SL-387
苯丁抑制素，含硫类似物
BILN2061
丽S-232632
BMS186716
Boc-lie-Glu-Thr-Asp-H
硼替佐米
贝卡那韦
butabindide
N-[2-[5-(叔丁基)-1，3， 4-噁二唑-2-基]-(IRS)-l-(甲乙基)-2-氧
乙基]-2- (5-氨基-6-氧-2-苯基-6H-嘧啶-1-基)乙酰胺
(2S)-N-[(2S，3R)-4-[(3S, 4aS, 8aS)-3-( 叔 丁 基氨基甲
酰)-3, 4， 4a, 5, 6, 7， 8， 8a-八氢-1H-异喹啉基-2-基]-3-羟基-卜苯基
-丁垸-2-基]-2-(喹啉基-2-羰氨基)丁二酰氨
Bz-Leu-Leu-Leu-COCHO
BzLLLC0CH0
CA074
钙蛋白酶抑制剂I
钙蛋白酶抑制剂n 钙蛋白酶抑制剂m
坎沙曲拉 卡托普利
N- [ (S) -1-羧基-3-苯丙基]-L-Ala-L-Pro组织蛋白酶L抑制剂
CGP-60536
对-氯汞基苯甲酸盐
糜蛋白酶抑制剂
西司他汀
CKD-731
clasto-乳胞素beta-lactone
CLIK148
CRA-013783
Crixivan
(1S， 4R， 6S， 7Z， 14S， 18R)-14-环苯氧羰氨基-18-[2-(2-异丙氨 基-噻唑-4-基)-7-甲氧喹啉基-4-氧基]-2， 15-二氧-3， 16-二氮杂三 环[14.3.0.04.6 ]十九烷-7-烯-4-羧酸
D-2-甲基-3-巯基丙酸基-L-Pro
D-Phe-Pro-Arg-CH(2)C1
DANLME
DAPT
地瑞拉韦
DCI
DFP
1， 3-二- (N-苄氧羰基-L-亮氨酸-L-亮氨酸)氨基丙酮 重氮乙酰基-D， L-己氨酸甲酯 3，4-二氯异香豆素(DCI)
N-[N-(3， 5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰]-S-苯甘M酸叔丁酯
二异丙基氟磷酸酯(DFP)
二异丙基氟膦酸
(2S) —N— [ (2S， 4S， 5S) -5- [ [2- (2, 6—二甲基苯氧基)乙酰基]氨基]-'1-羟基-1， 6- di苯基-己烷-2-基]-3-甲基-2-(2-氧-l， 3-二嗪磷-l-基)
丁酰胺
N-[2-[4-(2， 2-二甲基丙酸基)苯磺醯胺基]甘氨酸
4， 6-二氧二环[3. 3. 0]八-8-基[4- [ (4-氨苯基)磺酰基-(2-甲丙基)
氨基]-3-羟基-1-苯基-丁烷-2-基]氨基甲酸
DPC423
DX-9065a
E-64
E64
E64c
E64d
EDTA
Elaspol
弹性(蛋白)酶抑制剂
依那普利
依那普利拉
Ep475
EPNP
1， 2-环氧基-3 (p-硝苯氧基)丙烷 EST
N-(2-乙氧基-5-氧-草脲胺-3-基)-5-异喹啉基-1-基羰氨基-2，6-二
氧-1， 7-二氮杂二环[5. 4. 0]十一垸-8-羰酰胺
1- [2- (l-乙氧羰基-3-苯基-丙基)氨基丙酰基]吡咯烷-2-羧酸
乙基(+) - (2S， 3S) -3-[ (S) -3-甲基-1- (3-甲基丁基氨基甲酰)丁氨蟇
甲酰]-2-环氧乙烷羧酸酯
N-顺丁烯二酰亚胺
l-乙基吡咯-2， 5-二酮3- (5-氟-3-吲哚)-2-巯基-(Z) -2-丙烯酸
4- [2-[(4-氟苯基)甲基]-6-甲基-5-(5-甲基噁唑-3-基)羰氨基-4-氧-庚酰] 氨基-5- (2-氧吡咯烷-3-基)-五-2-enoate
N-甲酰-allo-Ile-Thr-Leu-Val-Pip-Leu-Pip N-甲酰-Val-Thr-Leu-Val-Pip-Leu-Pip
2- [2-(甲酰-{同分异构}-异亮氨酸-苏氨酰-亮氨酸-异戊氨酰)-(六 氢哒嗪-3-羰基)-亮氨酸]-六氢哒嗪-3-羧酸
沙奎那韦
福斯安普那韦(前体) FPRCH2C1 fumagalone 烟曲霉素
Y-分泌酶抑制剂II
GW0385 GW433908 GW433908 (前体)
聽A 聽SA
1R-[1S， 4R， 5S]-1-(1_羟基-2-甲丙基)-4-丙基-6-噁-2-氮杂二环 [3.2. 1.]正庚烷-3， 7-二酮
(3S, 4aS， 8aS) -2- [ (2R， 3R) -2-羟基-3- [ (3-羟基-2-甲基-苯甲酰)氨 基]-4-苯磺酰-丁基]-N-叔丁基-3， 4， 4a， 5， 6， 7， 8， 8a-八氢-1H-异喹 啉基_3-羰酰胺
(4R) -3- [ (2S, 3S) -2-羟基-3- [ [ (2R) -2-[ (2_异喹啉基-5_基氧乙酰基)氨基]-3-甲磺酰-丙酰基]氨基]-4-苯基-丁酰基]-N-叔丁基-噻 唑垸_4-羰酰胺氨基]-1-苯基-丁垸-2-基]氨基甲酰]-2, 2-二 甲基-丙基]氨基甲酸
3_羟基-4- [2- [3-羟基-6-甲基-4- [3-甲基-2- [3-甲基_2_ (3-甲基丁 酰基氮基)丁酰基]氨基-丁酰基]氨基-庚酰]氨基丙酰基氨基]-6-甲 基-庚酸
(2S) -1- [ (2S， 4R) -2-羟基-4- [ [ (1S， 2R) -2-羟基-2， 3_ 二氢-1H-茚 -l-基]氨基甲酰]-5-苯基-pentyl] -4-(吡啶-3-基甲基)-N-叔丁基-哌嗪-2-羰酰胺
N-[3-[(lR)-l-[(6R)-2-羟基-4-氧-6-苯乙基-6-丙基-5H-吡喃-3-基]丙基]苯基]-5- (三氟甲基)吡啶_2-磺酰胺
p-羟基汞苯磺酸酯
P-羟基汞安息香酸酯
IDN-6556
茚地那韦
invirase
碘代乙酰胺
碘代醋酸酯
2-碘代醋酸酯
碘代泰诺司他汀
异戊酰-L-酪氨酰-L-异戊氨酰-DL-酪氨酸 N-异戊酰-酪氨酰-亮氨酸-酪氨酸
認1-272
凯诺司他汀-272L-006235 L-709049 L-735， 524 L685458
乳胞素 LAF237
亮抑酶肽 洛匹那韦 洛伐他汀 LY—570310
马立马司他
MD805
MDL28170硼酸MUGB
MUTMAC 丽167
N-[(S)-2-苯甲基-3[(S) (2-氨基-4-甲基硫)丁基二硫]-l-氧丁
基]-L-苯丙氨酸苯甲酯
奈非那韦
腿
Nip-Leu-Leu—LeuVS-Me
硝苯丁抑制素 NLVS Norvir NPGB
NPI-0052
鮮-LAF237
奥马屈拉 omuralide 0N0-5046 0N0-6818 OP
卵假散囊素
6-氧-5- (3-苯基-2-硫烷基-丙酰基)氨基-2-硫-7-氮杂二环[5. 4. 0 |
十一垸-8-羧酸
6-氧-6-去氧烟霉醇
草脲胺-3-基[4-[(4-氨苯基)磺酰基-(2-甲丙基)氨基]-3-羟基-卜 苯基-丁烷-2-基]氨基甲酸P-硝苯基-P'-胍基安息香酸酯
PCMB
PD150606
PD151746
Pefabloc
抑肽素
抑肽素A
1, 10-邻二氮杂菲
o-邻二氮杂菲
苯甲磺酰基氯化物
2-(磷酰甲基)戊二酸
磷酰二肽
派普拉司他汀
派普拉司他汀A
PMPA
PMSF
PNU-140690
普思特司他汀
PPACK
pralnacasan
N-(L-3-顺-丙基氨基甲酰环氧乙烷-2-羰基)-L-异亮氨酸-L-脯氨酸
蛋白酶体抑制剂3
蛋白酶体抑制剂III
PS-519
PS341
假-碘代泰诺司他汀
假-泰诺司他汀
PSI-3PSI-III 嘌呤霉素
RB 101 (S)
后-塞奥芬[[[(R)-l-(巯甲基)-2-苯乙基]氨基]-3-氧丙酸] [HSCH2CH(CH2C6H5)NHC0CH2C00H]
利托那韦
RK-805
Ro 31-8959
芦平曲韦
ruprintrivir
S-PI S17092
salinosporamide A
沙奎那韦
SCH 503034
SCH446211
SCH6
sivelestat
SPP100
SQ14225
SSR69071
他汀类药物
TBL(4)K
1, 3_噻唑-5-基甲基[[3-羟基-5-[ [3-甲基-2-[[甲基[(2-丙垸-2-基 -1， 3-噻唑-4-基)甲基]氨基甲酰]氨基]-丁酰基]氨基]-l， 6-二苯基-己垸-2-基]氨基]甲酸酯
塞奥芬
塞奥芬[N-[(S)-2-(巯甲基)-l-氧-3-苯丙基]甘氨酸]
tipranavir
TLCK
TMC-95
TMC-95A
TMC-95B
TMC-95C
TMC-95D
TMC114
TNP-470
Tos-基CH(2)Cl (TLCK) Tos-PheCH(2)Cl (TPCK) TPCK
L-顺-乙氧基琥珀酰-亮氨酸酰氨基(3甲基)丁烷
L-顺-乙氧基琥珀酰-亮氨酸酰氨基(4-胍基)丁烷
硫肽酶素A
硫肽酶素B
泰诺司他汀
泰诺司他汀
Ubenimex UIC-94017 UK-69， 578 UK-73， 967 UK—79, 300Velcade 维格列汀
Virac印t (奈非那韦甲磺酸酯)
VX-740
VX478
VX950
Z-Leu-Leu-leucinal
Z-Leu-LeiH^euVS
(Z-LL)(2)酮
Z-Phe-Arg-重氮甲烷
Z-Val-Phe-H
ZD-8321 (中性粒细胞弹性蛋白酶)
ZL(3)VS
ZL3VS
通过多种方法可以评价其它有意义肽酶潜在的抑制剂。下面提供了 一些示例性的科学试验计划。
羧肽酶Al和A2
羧肽酶A (CPA)是一种水解和多肽链C-末端相连的肽键的胰脏金属 肽酶。羧肽酶Al (CPA1)和羧肽酶A2 (CPA2)的区別在于针对具体 的肽基质前者(可认定为传统的A型)对脂肪族和芳香族残基貧 更好的优势，而后者对芳香族残基更苛刻。具有芳香族或支侧链的 C-末端L-氨基酸优选从肽链上分裂。
反应速度取决于Folk和Schirmer (1963)方法。参考Folk, J.和 Schirmer， E. J. Biol. Chem. (1963) 238:3884-94。通过测定在 254 nm处吸收的增加来确定马尿酰-L-苯丙氨酸(Sigma服875)的水解率。在具体的条件、25 ° C和pH 7. 5下，1单元每分钟水解1微 摩尔的马尿酰-L-苯丙氨酸。
基质
1 mM的马尿酰-L-苯丙氨酸和0. 5M氯化钠一起溶于pH为7. 5、 25 mM 的甲垸盐酸盐中。
酶
可以从Sigma (C5358)购买CPA1。相应的，根据Laethem等人的y4化力 a'oc/ 棚5j'叩/u^ (1996) 332(1) :8-18公开的步骤提纯hCPAl。根 据Reverter等人的/ ^'o丄C力e瓜(1998) 273 (6) : 3535-41公开 的步骤提纯hCPA2。
将原料CPA溶液溶于10%的氯化锂中，得到的最终浓度为1-3单位 /mL。 CPA的浓度可以通过测定278 nm (mg/mL 二 A， x 0. 515)处的 吸收率来计算。基质为试验缓冲液(25 mM甲烷盐酸盐，0. 5 M氯 化钠，pH7. 5)中的马尿酰-L-苯丙氨酸(lmM)。用移液器吸取2. 0mL 的基质移送到小玻璃管中，于25° C在分光光度计中培育3-4分钟， 达到温度平衡，并建立空白速率(如有)。加入O. lmL稀释的酶，在 3-5分钟内记录A^中的增加。从曲线起始的直线部分测定AAw /分 钟。测试化合物的抑制活性通过测试浓度范围为1 0. 1 nM的反 应速率来分析。
计算
靴 _ AA254/分钟
丄Wg = 0.36* xmg酶/ml反应混合物 * 0.36=反应期间形成的马尿酸的消光系数
采用Worthington Biochem中的试验。更多参考请参照
li.U !): : ::www.邻(..).j:丄.h丄.ng.t...o丄)二hi.o(:.h(..:.n.),d丄「..'丄(丄j..丄.1羧肽酶B
羧肽酶B (CPB)催化碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸从多肽的 C-端水解。用Folk和Schirmer (1963)的分光光度方法测定活性， 其中的反应速率通过由马尿酰-L-精氨酸水解导致在254nm出吸收率 的增加来测定。在具体的条件、25° C和pH 7.65的情况下， 一单 位导致每分钟1微摩尔的马尿酰-L-精氨酸水解。
基质
1 mM的马尿酰-L-精氨酸在含有0. 1 M氯化钠的25 raM甲烷盐酸盐、 pH 7. 65中。
酶
可以通过Sigma (C9584)购买CPB。将原料溶液用反应级的水系数， 浓度达到1-5单位/mL。
用移液器吸取2.9mL的基质移送到小玻璃管中，于25° C在分光光度 计中培育3-4分钟，达到温度平衡，并建立空白速率(如有)。加入 0. lmL稀释的酶，在3-4分钟内记录A^中的增加。从曲线起始的直线 部分测定AA^ /分钟。测试化合物的抑制活性通过测试浓度范围为 1 iiM-O. 1 nM的反应速率来分析。
计算
始产, AA254/分钟
早1丄/一/mg
0.349* x mg酶/ml反应混合物 *反应期间形成的马尿酸的消光系数
采用Worthington Biochem中白勺i式验。更多梦力昭-梦兕
hp: , Vww, wor.ij...i i 1(￡[丄.0丄二丄>.丄^).1.(^ ('i[h—()《 Sigma-Aldrich中的另一替代机理如下http://Ww. sigmaaldri ch. com/img/assets/] 8160/carhoxypc、卩ti(J ase B. pdf#search=%22 carboxypeptidase %2(Mi20assay%22
羧肽酶D
羧肽酶D (CPD)是180-kDa的单链醣蛋白，其具有三个一样的羧肽 酶活性位域和羧基端疏水穿膜标记。其从蛋白质和肽的羧基端分裂 单氨基酸，该蛋白质和肽显示了对羧基端精氨酸或赖氨酸严格特异 性。
基质
CPD基质丹酰-L-丙氨酰-L-精氨酸通过丹酰氯和前述的二肽、丙氨酸 -精氨酸反应进行合成。参考/^oc. tad Sc丄(1982)
79:3886 - 3890; Zi/e 5c丄 (1982) 31:1841 - 1844; #6^/ wfe A/7^t历o丄(1995) 248:663 - 675。
酶
在MCF-7细胞溶菌液中测定CPD活性。MCF-7细胞[(IO - 20) X IO"]在 0. 1M的乙酸钠缓冲液(pH5.6)中用21-规的针均质化。制备总的细 胞溶菌液或亚细胞组分，每个组分中加入Triton X-IOO，得到最终 的浓度O. 1% (v/v)。直至进一步的分析，样品在-20 ° C保存。
步骤
冰冷的酶样品(在总体积50pL中的60 - 80 ng蛋白质/uL)在 37° C、 150 iiL的0. 1M的乙酸钠缓冲液(pH 5. 6)预培养5分钟。通 过加入预平衡的(37。 C)丹酰-L-丙氨酰-L-精氨酸基质(在50 "L 的0. 1 M乙酸钠缓冲液中，pH 5. 6)启动试验。37° C培育(CPD-N经 过6分钟，CPD经过10分钟)后，加入150uL的1 M柠檬酸终止反应， 样品放在冰中。用氯仿萃取，从亲水性基质丹酰-L-丙氨酰-L-精氨 酸中分离出丹酰-L-丙氨酸产品。在340nm的激发波长和495nm放射 处，相对于氯仿空白测试了氯仿层中的荧光。使用不同浓度的丹酰-L-丙氨酸 (Tokyo Chemical Industry America, Portland, OR,
U.S.A.),构建每个试验的标准曲线，以校对萃取效率中的波动。使
用的抑制剂为MGTA (DL-2-巯甲基-3-胍乙基硫代丙酸(Calbiochem,
La Jolla， CA， U.S.A.)和0P (I，IO-邻二氮杂菲；Sigma) 。 CP的活
性通过存在或不存在10 UMMGTA的活性差异进行测定。SA的具体活
性计算为l (umol/分钟二单位)每mg蛋白质(即SA二单位/mg蛋白
质)。Km为63uM， Vmax = 27 umol/分钟。所测试化合物的抑制活性
在浓度范围0. luM-0. lnM内分析。
参照/ (2005) 390 (Pt 3) :665-73
http:〃ww. pubmedcentral. nih. g()v/artic〕 erender, i'cgi( t()o'i，,
Libmed&pubmedid=15918796
羧肽酶E
羧肽酶E (CPE)是一种处理酶，该酶从内蛋白水解分裂的肽荷尔蒙 的c-端分裂碱性残基。该酶不在神经细胞和内分泌细胞中的高尔基 体和分泌颗粒中出现。
基质
Dns-Phe-Ala-Arg可以通过Fricker的7fe〃潛c丄(1995) 23:237-250中的方法制备。
酶
羧肽酶E可以用上述建立的歩骤进行提纯和分离。参考
"e瓜(19%) 271 (8) :30619-30624.
对于羧肽酶测定，25叱的酶和50 mM NaAc、 pH 5. 5和200 ,丹酰 -Phe-Ala-Arg基质合并，最终体积为250叱。此外，试管中含有1 mM CoCl2或l幽胍乙基巯基琥珀酸(GEMSA)。样品和抑制剂在4 。 C下 预培养15分钟，然后加入基质，试管在37° C下预培养l小时。接着培养60分钟，加入100叱的0. 5 M HC1和2 mL的氯仿，在试管中 混合，然后在500 X《离心2分钟。通过氯仿层中测试的荧光(激 发350咖，发射500nm)测定产品的量。金属羧肽酶活性定义为Co" (CPE的活化剂)存在时的活性和GEMSA (CPE的抑制剂)存在时的活 性之间的差值。对于这些试验，羧肽酶的活性定义为含有酶的试管 和仅有缓冲液和基质的试管之间的荧光的差值，表示为含有酶、缓 冲液和基质的对照试管的％，但是不含有二价离子或抑制剂。测试 化合物的抑制活性在浓度范围为luM - 0. 1 nM.之间分析。 参考/Jj.o丄O e瓜(1996) 271(8) :30619-24 http:〃www. jbc. org,/cgi/content/ful 1/271/48/30619' i jkcy-911 4ecbb2b0629a51b4b2c5782deeec9ed63a93t
羧肽酶G
羧肽酶G为溶酶体、硫醇依赖性蛋白质酶，其逐渐分裂g-谷氨酰基 蝶酰基聚-g-谷氨酸酯，得到蝶酰基-a-谷氮酸酯(叶酸)和游离的 谷氨酸。羧肽酶G被认为对g-谷氨酰基键高度特异性，但是对分离 基团的C-端氨基酸不是(参考/ C力e瓜(1967) 242:2933)。
基质
可以从Sigma-Aldrich (A7019)购买(+)氨甲喋呤。 酶
羧肽酶G可以从Sigma-Aldrich (C9658)购买。在pH 7.3、 30 。 C 的条件下，一个单位每分钟从(+)氨甲喋呤水解1. 0微摩尔的谷氨酸。
在pH 7.3、 30 ° C的条件下，将2. 8 mL、 50 mM的Tris HC1缓冲 液和0.1 mM的氯化锌加入到O. 1 mL 1.8 mM的(+)氨甲喋呤中。倒 转混合，平衡到30 ° C。检测A320nm， 直至稳定，用合适的恒温 器分光光度计。然后加入含有0. 3 - 0. 6单位/mL水的0. lmL酶。立即倒转混合，用测试和空白的最大线速度记录A320nm/分钟的减 少。测试化合物的抑制活性在浓度范围为1 P M - 0. 1 nM.之间分析。
计算
单份,m,: (AA咖m/分钟测试-AA,m/分钟空印(3)(df)
(8.3)(0,1)
3 =测试体积(毫升) df 二稀释因子
8.3 = 320 nm处基质和产品之间在毫摩尔消光系数中的差值 10.1 =使用的酶体积(毫升) 参考Sigma-Aldrich酶测定
http://www, sigmaaldrich. coin/sigma,/enzyme(免20assay/c965'8()ny,.
羧肽酶M
羧肽酶M (CPM)是一种细胞外糖基磷脂酰肌醇标记的膜糖蛋fl。该 蛋白质属于锌金属羧肽酶的CPN/E子类。它具体从含有次末端丙氨 酸的肽上除去C-端碱性残基，如赖氨酸和精氨酸。确信的是，该羧 肽酶对控制细胞表面上的肽荷尔蒙和生长因子活性起着重要作HJ ， 以及在细胞外蛋白质(Braz J Med Biol Res 2006 39:211-217)的 膜定位降解中起着重要作用。
基质
通过丹酰化二肽Ala-Arg合成丹酰-Ala-Arg(Methods in Neuroscj ences: Peptide Technology" (P. M. Conn, ed. )，Vo]. 6， p. 373. Academic Press, Orlando, Florida, 1991)。
酶
羧肽酶M根据Tan等人说明的发进行分离、提纯(Methods Enzymol 1995 248:663-675)。步骤
加入125uL的缓冲液(O. 2 M HEPES [4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙二酸]， pH 7.0，含有0.2% (v/v) Triton X-100) 、 5-50/uL的酶样品、0 或25 u L的100uM的MGTA和0-70 u L的水，最终的体积为200 u L。 对于每套反应，准备一个酶空白(没有基质)和一个基质空白(没 有酶)。为了确保反应的特异性，样品可以用与不用2-巯甲基-3-胍 乙基硫代丙酸(MGTA)抑制剂进行预培养。样品在冰上预培养5-10 分钟，然后加入50uL的1.0 mM丹酰-Ala-Arg (4.64 mg/10 mL水 或稀释10mM原料溶液l:10)开始反应。根据活性，在37° C培养样 品15分钟到3个小时，燃用加入150uL的停止溶液(用氢氧化钠调 整为pH为3. 1的1. 0 M柠檬酸)终止反应。每个试管中加入氯仿(1. 0 mL)，激烈混合15秒，萃取丹酰-Ala产品，然后在约800 g时离心 10分钟，分离相。氯仿层的荧光(底层)相对于氯仿空白在340 nm 的激发波长和495nm的发射波长进行测试。测试化合物的抑制活性 在浓度范围为1 ii M - 0. 1 nM.之间分析。
计算
羧肽酶活性定义为未抑制样品和用10 mM MGTA抑制的样品之间在荧
光中的差值。荧光单位(FU)通过构建FU对丹酰-Ala (Sigma D0125)
浓度的标准曲线转换为毫微摩尔基质。
参考^7zy/ffW (1995) 248:663-675。
羧肽酶N
羧肽酶N (CPN)为血浆锌金属蛋白酶，其由两个酶活性的小亚组 (CPN1)和防止蛋白质分解的两个大亚组(CPN2)组成。CPN从血液中发 现的含有次末端丙氨酸的肽上分裂羧基端的精氨酸和赖氨酸，如补 充的过敏毒素、激肽和肌酸激酶MM(CK-MM)。通过除去仅有的一个氨 基酸，CPN有能力改变肽活性和受体结合(船2 T/z2M/朋y (2004) 40:785-93)。基质
呋喃丙烯酰基(FA)-Ala-yls从Sigma (F5882)商业购得。 酶
根据Skidgel的ife^ oA ^>7^ o〗(1995) 248:653-63中的方法提 纯羧肽酶N。
加入0. 5 mL含有0. 5M的NaCl缓冲液的0. 1 M HEPES (pH 7. 75)、 0. lmL的5 mM FA-Ala-yls (18. 23 mg/10 mL水)和足够的水，最终 得到的体积为l.OmL (包括样品)。在水浴中将混合物温热到37。 C， 简单混合时加入酶样品，然后将溶液快速输送到记录分光光度计的 恒温器(37° C)中的预热小槽中。336nm处的吸收变化连续记录约2-3 分钟。测试化合物的抑制活性在浓度范围为1 li M - 0.1 nM.之间分
参考^7zj7z o〗(1995) 248:653-63。 羧肽酶T
发现羧肽酶T (CPT)由普通高温放线菌分泌。CPT对肽基质的特异 性合并了羧肽酶A和B的特点，g卩，该酶分裂C-端中性基团，优选 为疏水的氨基酸，如羧肽酶A，以及分裂它们侧链屮产生正离子基团 的精氨酸和赖氨酸残基。
酶
根据Stepanov的M t力ot/s (1995) 248:675-83中的方法提
纯羧肽酶T。
基质
通过前述的步骤完成Dnp-Ala-Ala-Arg-0H的合成。参考foVA力iffl/.ra(1973) 38:790。 步骤
在0. 1 M Tris-HCl缓冲液、pH 7.5、 10-100 yL的酶溶液中加 入1 mL的0. 5 mM基质溶液。混合物在37° C培养10-60分钟，然 后加入0. 2 mL的50% CH:;COOH中止反应。混合物定量的转移到含有2 mL的SPS印hadex C-25的微型柱(塞有棉花的Eppendoff自动移液器 的塑料圆锥)中，用1 M的CH3COOH预平衡。柱子用1 M的CH:,C00H清 洗(两次，lmL)。合并洗液，测定溶液的A360 。为了计算 D叩-Ala-Ala-OH浓度，使用的摩尔消光值(e360)为15,000。 一个活 性单位等于在具体的条件下于1分钟内水解1 、0l基质的酶的量。 测试化合物的抑制活性在浓度范围为luM - 0. 1 nM.之间分析。 参考#ez^oofe ^7^Tz o2 (1995) 248:675-683。
羧肽酶Y
羧肽酶Y (CPDY)酿酒酵母中分离的64 kDa丝氨酸羧肽酶，己经发 现该酶能催化多种离去基团的水解反应，如氨基酸、对硝基苯胺和 多种醇。试验测定了在酶水解苄氧羰基-L-苯基丙氨酰-L-亮氨酸过 程中亮氨酸的离去速度。
基质
苄氧羰基-L-苯基丙氨酰-L-亮氨酸可以从Sigma (C1141)处购买。 注和缓冲液混合前，0.5 mL的DMSO (二甲亚砜)可以用于溶解苄 氧羰基-L-苯基丙氨酰-L-亮氨酸。
羧肽酶Y从Sigma (C3888)购买。用反应级的水制备1 mg/mL的酶 溶液。在50 mM的磷酸钠、0. 15M氯化钠和pH为6. 5的基质溶液中加入1. 0 mL的1 mM苄氧羰基-L-苯基丙氨酰-L-亮氨酸。在25 ° C中预培养 10分钟。加入50uL的酶开始酶反应。反应在25 ° C中反应10分钟。 加入1. OmL的茚三酮试剂(通过混合50mL在甲基纤维素中的4%的 茚三酮和0.2M的柠檬酸钠(pH 5.0) -7. ImM的氯化亚锡)。将10 个测试试管中的每一个搅拌15分钟。将所有的试管放在开水中水浴 15分钟。从水浴中移走试管，冷却到低于30 ° C。在每个测试试管 中加入5. OmL、 50%的丙醇溶液，并充分混合。在570nm处读取所有 试管的光密度。使用不同浓度的亮氨酸，构建每个试验的标准曲线。 测试化合物的抑制活性在浓度范围为luM - 0. 1 nM.之间分析。
计算
单位/mh; 光密度-空白
标准曲线的斜率x10分钟x0.05 单位/ml
单位/mg:
mg/ml样品
参考Worthington Biochem。请参考
htl:p://www, wor1 hingt(m-bioch(-)m.(、(肌'C()Y,21 (《au^i Ji1Jni' 羧肽酶Z
羧肽酶Z (CPZ)属于金属羧肽酶的羧肽酶E子类。尽管这些Zn依赖酶 通常不是公知的CPZ具体的基质、包含在蛋白质的细胞内处理和细胞 外外处理中，但是其已显示出分裂C-端精氨酸，以及包含在Wnt信号 通道中。参考"，一細t (2003) 130(21) :5103-11。
基质
丹酰-Phe-Ala-Arg可以通过Fricker的方法进行制备 yVew孺ci. (1995) 23:237—250。
酶
如同以前报道的一样，通过亲合色谱法提纯，羧肽酶ZcDNA能够转染成AT-20细胞和蛋白质。参考A'oc力effl Aiop/ j^ Om孤(1999) 256:256-8。
CPZ活性在最终体积为250uL、 100 mM、 pH 7.4、 Tris-HCl缓冲液中 用0. 2mM丹酰-Phe-Ala-Arg测定。在37° C中3小时后，反应用100 yL、 0.5 M的HC1终止，然后加入2mL的氯仿。混合后，以300 x g 离心2分钟，通过测定氯仿相中的荧光测定产品的量。为了检测抑 制剂的效果，在缓冲液、基质和抑制剂的混合物中加入提纯的CPZ， 得到最终浓度为50 mM Tris-Cl， pH 7. 4， 100 uM丹酰-Phe-Ala-Arg 和所示浓度的抑制剂。反应在37° C中培养1小时。培养后，加入 100叱的0. 5 M HC1和2 mL的氯仿，试管混合，然后以500 X g 离心2分钟。通过测定氯仿层中的荧光(激发350nm、发射500nm) 测定产品的量。进行没有酶的对照反应。进行大量CPE的反应，以测 定对应于基质完全转化为产品的荧光。Km值用丹酰-Phe-Ala-Arg和 丹酰-Pro-Ala-Arg测定，使用的浓度范围为0. 025-1. 6 mM。 参考万j'oc力evz j'ca7 awt/ Aj'op力j^s"ica7 7fesesrc力 Co/ 朋"/7icat7(9从s' (1999) 256:564 - 568。
丝氨酸羧肽酶A
丝氨酸羧肽酶A也称之为哺乳动物组织蛋白酶A，溶悔体羧肽ff A 和溶酶体保护性蛋白定义为能在酸性pH '卜水解Z-Glu-Tyr的,。该 酶也显示了在中性pH中的酯酶和脱酰胺酶的活性。由于组织蛋白酶 A能在体外水解大量合成的生物活性的肽激素，如Z-Phe-Leu、血管 紧縮素II、物质P和内皮素，已经建议组织蛋白酶A可以包含在肽 激素的体内代谢中，尽管对组织蛋白酶A的胜利基质还不清楚。HPLC 分离后，组织蛋白酶A的活性的测定机理基于从基质中酶脱离的 N-DNS-Phe的荧光测定、N-DNS-Phe-Leu。以100， 000 x g离心80分钟的蔗糖中0. 25M的鼠肾匀浆用于酶源。 基质
根据Wiedmeier的,C/Lromgto^r. (1982) 231:410公开的方法合 成N-DNS-Phe-Leu。
反应混合物包括50 mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.6)、 40 u M的 N-DNS-Phe-Leu和酶、水，总的反应体积为250uL。培养在37° C中 进行，通过在95° C的开水中加热5分钟终止反应。离心后，在清 澈的上清液中加入N-DNS-NLeu作为内部标准，得到的等份混合物根 据Chikuma等人的/ C力ro/z Wj'湖e^/ 5"'朋d (1999) 728(1) :59-65进行HPLC分析。测定N-DNS-Phe的峰高，并从 N-DNS-NLeu内部标准的峰高转化为微微摩尔。 一单位的酶活性定义 为在37° C、l分钟内将lpmo1的基质转化为相应产品所需的酶的量。 测试化合物的抑制活性在浓度范围为luM - 0. 1 nM.之间分析。. 参考/ ".'Sio/sec/. 5"c丄a/ t/^ ;^. (1999) 728 (1) : 59-65。
在含有溶入甲醇(xx mL)的D(a)L (1 eq)的圆底烧瓶屮加入 [Re(C0嵐0):,]Br (1 eq)。反应加热到80 "C，并搅拌4小时。除去 冷却的容积后，样品用HPLC提纯。样品用'H醒R和质谱分析。
Re (CO) 3D (C4) L (5):产量=23% (0. 4 g) 。 'H匿(CDC1:,， ppm): 8.77 (m， 2H)， 7.91 (m 2H) ， 7.61 (m， 2H) ， 7.35 (m， 2H) ， 7.13 (m, 5H)， 5.00 (m， 4H) ， 4.12-2.60 (mm， IIH)， 2.26-1.41 (mm' 16H)。 MS(ESI): / A 944 (M+H"， ffl/z 942 (M-H)+。
Re (CO) :,D (C。 L (6):产量=34% (0. 61 g)。'關MR (CDCl.,, ppm): 8.77 (m， 2H)， 7.91 (m2H)， 7.61 (m， 2H) ， 7.35 (m， 2H) ， 7.13 (m， 5H)， 3.92 (d， 4H) ， 3.69—2.65 (mm， 1111), 2.27—1.46 (mm， 18H)。 MS(ESI): /b/z 688 (M+H) +,历/z 686 (M-H)+。Re (CO) J) (C8) L (7):产量=55% (0. 40 g) 。 ^ NMR (CDCU ppm): 8.50 (d， 2H)， 7.63 (m2H)， 7.50 (m， 2H) ， 7.13 (m， 8H) ， 3.85 (d, 4H)， 3.69-2.53 (mm， IIH)， 2.23-1.22 (腿，24H) 。 MS (ESI): 历/z 730 (M+ +H) +. /z /z 728 (M—H)+。
卿7b r^人"《"Z游一麽,多f
用公开的文献[6]通过Isolink试剂盒制备[99mTc (CO) 3 (H20) 3]+。为了测 试金属络合物的鼠血浆稳定性，分离的9"Tc(C0)J)(Cx)L在37"C、 lmL 的鼠血浆中培养5分钟、60分钟和24小时。在所需的时间点，除去 等份的培养混合物(400化)。乙腈(SOO L)的加入产生了沉淀，该 沉淀在15，000 rpm离心5分钟。除去上清液，在氮气流中浓縮。剩 下的残基溶于10%乙醇/盐水，并用HPLC分析，以测定化合物的稳定 性(图4)。
沐// /苦丝试##。根据生产者的说明，测试化合物抑制ACE活性 的能力用Fujirebio, Inc.的ACEcolor试剂盒测定。提纯的鼠肺ACE ()在37 °C和测试化合物一起培养20分钟，测试化合物在基质溶 液中的浓度为1 M- 0. 1 nM。加入显影剂溶液，在分光光度计、505nm 读数前，样品在37 。C再培养5分钟。
嵐资织分布。""'Tc (CO) :iD (Ch) L (MIP-1037)的组织分布研究在单独的 雄性大白鼠(11=5/时间点)组中进行。MIP-1037以50 PCi/kg从尾部 静脉团注(约IO MCi/rat)，体积恒定为O. lml 。在注射10分钟、 30分钟、1小时和2小吋后，用二氧化碳对这些动物进行安乐死。 将组织(血液、心肺、肝脏、朋!、肾、大肠和小肠(含有内容物)、 睾丸、骨骼肌和脂肪)分离、切割、称湿重，转移到塑料试管中， 用自动的Y-计数器(LKB Model 1282， Wallac Oy， Finland)计数。 表达为。/。ID/g、 99l"Tc(C0)J)(C8)L (MIP-1037)的组织吋间-放射性水平 通过每分钟校正计数的衰减转化为百分比剂量和除以组织或器官样品的重量来测定。也测定等份的注射剂量，将每个组织样品中的每 分钟计数转化为每个器官中注射剂量的百分比。
成像。用戊巴比妥钠(50 mg/kg,i.p)对6个大白鼠进行麻醉， 随意分配到，c (CO) 3D (C8) L (MIP-1037)或赖诺普利/"'"Tc (CO) 3D (C ) L (MIP-1037)治疗组(77 = 3/组)。所有的6个动物放在Y -照相机上， 基线平面腹部成像由5个组成，对于单个动物， 一分钟连续成像用 低能量DSX-LI双头Y-照相机、通用瞄准器(SMV America)和迷你 Y-照相机、MGC500 (TeraRecon Inc.)获得。在使用"'"Tc (CO) 3D (C8) L (MIP-1037)前，对动物(n = 3)使用5分钟的赖诺普利(0.5 mg/kg， i.v.)。 5分钟后，对所有的动物(n = 6)静脉注射5 mCi/kg 99mTc(C0)3D(C8)L (MIP-1037) ， 5个1分钟平面腹部成像在注射10、 30和60分钟后获得。
99mTc(C0)3D(C8)L (MIP-1037)吸收的解剖定位，利用小动物SPECT/CT 也使用了带有小孔瞄准器的X-SPECT小动物扫描器(Gamma Medica， Inc., Northridge， CA)。单独用""'Tc (CO) :iD (C8) L (MIP-1037)注射 鼠或用赖诺普利(5分钟前r"Tc(C0):J)(C》L (MIP-1037))注射治疗 组"=2/组)。用异荧垸/氧气混合物麻醉鼠。麻醉的动物固定在具 体的设备上，以保证后面影像融合所需的完全不动。麻醉的程度通 过用呼吸带测定呼吸频率进行监测。体温用直肠探测器控制，并用 热电偶和加热的空气流保持在37。 C。用生产者软件获得和重新构建 SPECT数据。SPECT和CT数据的融合用标准方法处理。 如表I所示，每个铼络合物的抑制活性对照提纯的鼠肺ACE在休外进 行评价，并随着链长(亚甲基间隔单元)直接变化；Re (CO):iD (C ) L (MIP—1037) ; IC50 二 3 nM) ， Re(CO):,D(CjL (MIP—1003) ; IC-' 二 144 nM)，以及Re(CO):,D(d)L (MIP-1039) ; IC50 = 1， 146 nM),和赖诺普 利对比；IG。 = 4 nM。有7个碳亚甲基间隔单元的类似物，MIP-103 显示的活性等于母分子，赖诺普利。
表I: ，7b&^,/^""/邀錄游嵐厕^幼妙//劍活丝化合物_0_IC5() (nM)
MIP-1039 3 1146
MIP-1003 4 144
MIP-1037 7 3
赖诺普利 - 4
表II显示了"7c(C0)3D(C8)L (MIP-1037)的鼠组织分布。在检查的所 有组织中检测到不同水平的放射指示剂，并随着时间稳步减少。在 肺部的吸收最大，具有高ACE表达的组织，注射10分钟后达到15. 2% ID/g，保持3.93 。MD/g2小时。通过肠内增加的放射性同位素示踪 证实，间隔主要是通过肝胆路径。同时注射0.6mg/kg的非放射性 标记的赖诺普利后，MIP-1037的吸收在肺部和其它组织中急剧减少， 证明是特异性结合。鼠血浆的HPLC分析显示络合物在24小时内是稳 定的，没有明显的分解。
飾Tc ^ 义力《JZ 游嵐资织分布
10分钟 30分钟 1小时 2小时
T均SDT均±SD下均±SD血液0. 150. 010.08土0.020.(M0.020.0'11 0. 01
0. 140. 040.020.010.01±0.01()■02± 0. 01
心朋-0. 39±0. 060.210.(M0.150.030.09丄0- 02
0.070, 030.03士0.030.00±0.()l0.(J3± (). ()l
w'15. 20土7. 367.05±1.975.911.553.93土 1. 17
0. 17土■ 0.060.03±0.010.040.060.02上0. 01
月T脏0. 82±0. 130.590.180.34±().060.17-1— ()■ ()3
2. 46土1. 150.29土0.070.15土0.14()■08± 0. 01
脾0. 890. 120.65±0.180.01±0.060.19土 0. 03
0. 06±0. 010.01±0.010.000.[U0.03± (). 01
1. 21土0. 271.330.461.300.38()■化L ()■ 11
0. 540, 080.160. 20.130.020.08± ().("
人肠0. 18士0. 050.170.160.08±0.020.10土 0.3
0. 04±0. 020.02±0.000.030.030.17± 0. 32
小肠1. 860. 773.411.186.02±0.556.13丄i.:化5.19 ± 2.16 6.99 ± 2.39 6.67 ± 1.94 11.36 ±1.51
骨骼肌 0. 41 ± 0. 07 0. 44 ± 0. 16 0. 36 土 0. 04 0. 28 ± 0. 02
0. 08 ± 0. 05 0. 02 ± 0. 01 0. 02 ± 0. 01 0. (M ± 0. 01
脂肪 0. 24 ± 0. 09 0. 29 ± 0. 09 0. 29 ± 0. 14 0. 32 ± 0. 06
0. 07 ± 0. 02 0. 01 ± 0. 01 0. 01 ± 0. 02 0. 06 ± 0. 03
全体成像用于确定MIP-1037是否能用于非侵入性监测体内ACE 活性。如上所述，用和不用赖诺普利预治疗的鼠用于体内成像规则。 在每个动物的成像时间点，划出肺、肝脏、小肠和背部(软组织) 的有用区域(ROIs)。每个ROI计数表达，ROIs在相同的时间点正常 化为背景。图9显示了注射MIP-1037后10分钟获得的体内腹部全 体平面图像。注射10分钟后的起始对照图像显示了肺、肝、小肠和 膀胱中放射指示剂的吸收，该吸收能通过赖诺普利预治疗阻断。
此外，小动物SPECT/CT (Gamma Medica， Inc., Northridge， CA) 的成像研究定义了放射指示剂的解剖定位。和整体平面成像规则类 似，鼠接受MIP-1037，有和没有上述的赖诺普利预治疗。如图10所 示，赖诺普利预治疗阻断了突出的肺活性，其表明MIP-1037和组织 (肺)ACE在体内的特异性结合。当对比对照组和预治疗组的图像时， MIP-1037在肺里的吸收在经过观察期60分钟(所有的时间点)大大 降低了，如同ROIs计数的一样。肺内放射指示剂的吸收几乎在注射 后60分钟消失。此外，MIP-1037吸收的大幅降低也在膀胱的10、 30和60分钟时发现，以及在小肠的30和60分钟时发现。肝吸收是 短暂的，从该器官清洗非常快，注射后的60分钟吋几乎所有的放射 活性消失在肠内。
带有多个亚甲基基团的D(Cx)L配位体用于形成M(CO):,'络合物。 最有功效的化合物M(C0):,D(C8)L在体内用99m-Tc测试。组织分布研究 表明在含有ACE表达的器官中有高吸收，如肺。用赖诺普利预治疗的 研究表明该化合物事实上是ACE特异性的。平面照相机成像和 PSPECT/CT成像证实了体内的结果。与此对比，高亲和性Tc-99i4射己 的ACE抑制剂设计有和赖诺普利类似的功效。生物分布、药理学阻断 研究和图像分析证实体内ACE的具体作用。该试剂能用于监测相关疾病状态的ACE调节。
上面对本发明进行了说明，并通过说明书和优选实施例进行了 详细说明。对于本领域普通技术人员来说，不限于优选实施例的其 它实施例也包含在本发明的范围内。相反，本发明的范围和下属权 利要求书所表述的范围一致。
权利要求
1、一种包含偶联到放射性药物部分或光学成像部分的肽酶结合部分的化合物。
2、 权利要求1所述的化合物，其中所述的放射性药物部分为放射成像部分、放射治疗部分，或二者。
3、 权利要求l所述的化合物，其中所述的肽酶结合部分选自外 肽酶或内肽酶抑制剂。
4、 权利要求1所述的化合物，其中所述的肽酶结合部分包含羧 肽酶结合部分，其中依次选自羧肽酶Al、羧肽酶A2、羧肽酶B、 柱状细胞羧肽酶A、羧肽酶D、羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N或 羧肽酶Z的抑制剂。
5、 权利要求4所述的化合物，其中所述的肽酶结合部分包含ACE 结合部分。
6、 权利要求5所述的化合物，其中所述的ACE结合部分选自 阿拉普利、苯那普利、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、 依那普利、依那普利拉、福辛普利、米卡普利、赖诺普利、莫西普 利、莫维普利、平托普利、培哚普利、奎那普利、雷米普利、伦唑 普利、螺普利、盐酸替莫普利、群多普利或左芬普利。
7、 权利要求l所述的化合物，其中所述的放射成像部分包含放 射性核种螯合物。
8、 权利要求7所述的化合物，其中所述的放射性核种选自锝或铼。
9、 权利要求8所述的化合物，其中所述的放射性核种选自锝 -99m、铼-186或铼-188。
10、 权利要求1所述的化合物，其中所述的放射成像部分包含(锝 -99m) Tc (CO):或(铼_186/188) Re (C0) :1螯合物。
11、 权利要求5所述的化合物，其中所述的ACE结合部分，和 血清ACE相比，更大程度上抑制组织ACE。
12、 权利要求5所述的化合物，其中ACE的IC,^抑制小于20nM。
13、 权利要求1所述的化合物，其中所述的肽酶结合部分和光 学成像部分通过氨基化合物、酯、胺或醚键偶联。
14、 一种成像哺乳动物的一个或多个器官或组织或二者的方法， 该方法包括给哺乳动物施用有效量的一种化合物，该化合物包含 偶联到放射成像部分或光学成像部分的肽酶结合部分；以及获得哺 乳动物的一个或多个器官或组织或二者的图像。
15、 权利要求14所述的方法，其中所述的化合物静脉注射施用。
16、 权利要求14所述的方法，其中所述的化合物选自冷的铼标 记或锝-99m标记的D(C4)L (1)、 D(C5)L (2)、 D(C6)L (3)或D(C8)L (4)。
17、 权利要求14所述的方法，其中所述的一个或多个器官或组 织或二者包括肺组织。
18、 权利要求14所述的方法，其中所述的 织或二者包括肾组织。
19、 权利要求14所述的方法，其中所述的 织或二者包括心脏组织。
20、 权利要求14所述的方法，其中所述的 织或二者包括肿瘤组织。
21、 权利要求14所述的方法，其中所述的 织或二者包括易受伤的斑块的情况。
22、 权利要求14所述的方法，其中所述的 织或二者包括动脉粥样化的情况。
23、 权利要求14所述的方法，其中所述的织或二者包括炎症的情况。
24、 一种试剂盒，该试剂盒包括(i)包含偶联到金属螯合物部 分的肽酶结合部分的化合物；以及(ii)放射性核种。
25、 权利要求24所述的试剂盒，其中所述的放射性核种选自锝 -99m、铼-186或铼-188，或其组合。
26、 一种分级和哺乳动物一个或多个器官或组织或二者相关的 病理学症状的方法，该方法包括(i)给哺乳动物施用有效量的一个或多个器官或组 个或多个器官或组 个或多个器官或组 个或多个器官或组 个或多个器官或组 个或多个器官或组种化合物，该化合物包含偶联到放射成像部分的肽酶结合部分，(ii) 获得所述哺乳动物一个或多个器官或组织或二者的图像，(iii)由所述图像确定存在于所述哺乳动物一个或多个器官或组织或二者的肽酶，以及(iv)利用确定的量和对照的量达到病理学症状的阶段。
27、 权利要求26所述的方法，其中所述的病理学症状选自心力 衰竭、心肌症、肺病、肾功能不全、肾衰竭、炎症、动脉硬化、易 损动脉斑块或肿瘤。
28、 一种监测哺乳动物响应治疗和一个或多个器官或组织或二 者相关的病理学症状的方法，该方法包括(i)给哺乳动物施用有 效量的一种化合物，该化合物包含偶联到放射成像部分的肽酶结合 部分，(ii)获得哺乳动物一个或多个器官或组织或二者的图像，(iii) 由所述图像确定存在于所述哺乳动物一个或多个器官或组织或二 者，以及(iv)利用确定的量和对照的量以精确计量哺乳动物对治疗 的响应，如果有。
29、 权利要求26所述的方法
30、 权利要求26所述的方法 物的一个或多个器官的基线量。
31、 权利要求28所述的方法量。
32、 权利要求28所述的方法 物的一个或多个器官的基线量。
33、 一种在哺乳动物一个或多个器官或组织或二者屮定呈肽, 表达的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的一种化合物， 该化合物包含偶联到放射成像部分的肽酶结合部分；以及获得哺乳 动物的一个或多个器官或组织或二者的图像；由所述图像和一系列 标准图像在哺乳动物一个或多个器官或组织或二者中定量肽酶表 达。
34、 一种对所需哺乳动物进行放射疗法的方法，该方法包括给 哺乳动物施用有效量的一种化合物，该化合物包含偶联到放射治疗，其中所述的对照量是组里的平均 ，其中所述的对照量是所述哺乳动 ，其屮所述的对照贵是组単.的f-均 ，其屮所述的对照量是所述哺乳动部分的肽酶结合部分。
35、 权利要求34所述的方法，其中所述的化合物是静脉注射施用。
36、 权利要求34所述的方法，其中所述的哺乳动物患有肿瘤症 状。
37、 一种具有下式的化合物(PBM) n-(LIN)-(CHE), 其中，PBM含有肽酶结合部分， n为1、 2或3，LIN为共价键，-CH厂、-NH-，或碳原子为2-20的线性或支链， 并且可选择的结合到或包含在链中的是包括氨基、氧、硫、羰基、 尿素的1-6个杂原子，或为氨基化合物、芳香环、环形脂肪环、杂 芳环，或杂环脂肪环，以及共价连接到螯合部分，该螯合部分可以 是能够结合放射性核种的单配位基、二配位基或多配位基配位体， 以及m为1、 2或3。
38、 权利要求37所述的化合物，其中所述的肽酶结合部分为羧 肽酶Al、羧肽酶A2、羧肽酶B、柱状细胞羧肽酶A、羧肽酶D、 羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶N或羧肽酶Z的抑制剂。
39、 权利要求38所述的化合物，其中所述的肽酶结合部分为阿 拉普利、苯那普利、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、 依那普利、依那普利拉、福辛普利、米卡普利、赖诺普利、莫西普 利、莫维普利、平托普利、培哚普利、奎那普利、雷米普利、伦唑 普利、螺普利、盐酸替莫普利、群多普利或左芬普利。
40、 权利要求37所述的化合物，其中所述的连接剂为2-15个 原子的链，其中1-6个原子的链为氨基、氧、硫、羰基、尿素或氨 基化合物，并且链中剩下的原子为碳。
41、 权利要求40所述的化合物，其中所述的连接剂包含赖氨酸 或赖氨酸类似物，如图6或图7所示的赖氨酸类似物。
42、 权利要求37所述的化合物，其中所述的放射性核种为锝或铼。
43、 权利要求37所述的化合物，其中所述的CHE部分为吡啶甲 撑基胺、喹啉亚甲基胺、异喹啉胺、吡啶-2-基甲氨基乙酸、异喹啉 基-3-基甲氨基乙酸、噻唑-2-基甲基胺和噻唑-2-基甲氨基乙酸或下 述结构的螯合物，其中显示和锝连接Rh逸自0、 H、 0H烷氧基或0-垸基，R9为药学上可接受的杂环，如含有1-2个氮、氧或硫原子的5 或6元环，Rs选自0、 H、 0H烷氧基或0-垸基，R9为药学上可接受的杂环，如含有1-2个氮、氧或硫原子的5 或6元环，Ru)和Ru分别单独为氢、烷基或取代的烷基； Ru选自烷基、芳基或杂环；Rl:,、 R14、 R1S、 R1S、 Rn、 R18、 R19、 R加单独为氢或甲基' <formula>formula see original document page 7</formula><image>image see original document page 8</image>
全文摘要
本发明公开的偶联物、方法和试剂盒用于成像表达一种或多种肽酶的组织和器官。在本发明的优选实施例中，一系列二-(2-吡啶甲基)胺(D)配位体，其和M(CO)₃⁺[M＝Tc或Re]结合，并和赖诺普利(L)偶合。利用不同亚甲基基团(3、4、5和7；D(C₄)L、D(C₅)L、D(C₆)L和D(C₈)L，分别的)数目的脂肪链，随着亚甲基数目的增加，体外抑制活性也增加。观察到D(C₈)L偶联物比D(C₄)L的功效显著。在组织分布和射线成像研究中研究了ACE的体内特异性，证实有高ACE含量在组织中定位。定位通过赖诺普利的预治疗阻断。
文档编号A61K51/00GK101594886SQ200780040385
公开日2009年12月2日 申请日期2007年8月29日 优先权日2006年8月29日
发明者C·芮曼, F·J·费米尔, J·W·巴比奇, W·C·埃克尔曼 申请人:分子制药洞察公司