内源性凝血激活化合物——在探查内源性凝血中的用途的制作方法

专利名称：内源性凝血激活化合物——在探查内源性凝血中的用途的制作方法
本申请涉及用于内源性凝血的激活化合物和它们在其探查中的用途。
由“内源性途径”引发的凝血在体外由使血液与带负电荷表面接触所导致。在体内提供纤维蛋白凝块生长的次级增强。
由“内源性途径”引发的凝血(以下称之为“内源性凝血”)的探查在试验中用于体外检测凝血异常或者监测用具有抗凝血活性的物质治疗的患者。
内源性凝血途径体外是由与负电荷接触的XII因子(f.XII)的活化作用引发的。在其他酶因子的存在下，例如XI因子(f.XI)、前激肽释放酶(PK)、高分子激肽原(HMWK)、IX因子(f.IX)——已知也称抗血友病因子B——和辅因子——抗血友病因子A(f.VIIIc)，在血小板磷脂(PF3)和钙(Ca++)的同时存在下激发酶型活化级联。
在一系列活化作用的最后，被活化的IX因子(f.IX)继而激发第二系列酶的活化级联，包括X因子(f.X)和II因子(f.II)——已知也称凝血酶原；在血小板因子(PF3)、钙(Ca++)和辅因子——V因子(f.V)的存在下完成该活化作用。
第二活化级联终止于凝血酶(f.IIa)的生成，它转化纤维蛋白原为纤维蛋白，后者是血液或血浆凝块的主要成分。
简化的内源性(体外)凝血途径流程可以如下所述 一般而言，进行凝血探查的目的是为了寻找可能患有出血综合征的患者的生物学异常或者监测疾病在凝血水平下的后果，或者监测可以直接或间接改变凝血的医疗措施。
为此，有人已经提出了不同的试验，根据参与内源性凝血途径的因子的定性或定量观察，研究影响由凝血酶转化纤维蛋白原所致纤维蛋白生成的不同异常。
不同的试验在商业上可用于探查内源性凝血(已知也称内在凝血)，特别可以提到活化的部分促凝血酶原激酶时间试验APTT，它能够在参与内源性途径的因子水平下检测血浆样本中的异常或缺乏，这些异常体现在超出正常限度以外的凝血时间。
进行APTT试验的目的是为了了解最常见的体质性出血疾病，即维勒布兰德氏病和血友病A与B。该试验也经常用于监测肝素疗法。
概言之，APTT试验的原理在于向供试血浆样本加入带负电的XII因子激活物(接触激活物)和血小板膜磷脂的代用品以及钙离子。
所测量的凝血时间相当于在加入接触激活物、血小板代用品、钙与凝血块出现之间的时间。它是转化血浆中凝血酶原的1％为凝血酶所需的时间。然后在短时间内发生纤维蛋白的生成。钙是系统的激发要素。
适合于进行APTT试验的激活物是相当多的。它们例如包括固体激活物，例如二氧化硅、玻璃或高岭土，或液体激活物，例如鞣花酸(逆没食子酸)及其衍生物或硫苷酯类。
尽管基于固体激活物的试剂得到广泛使用，不过它们不是没有某些缺点的。它们所含有的高岭土或二氧化硅颗粒趋向于在凝血试验期间沉降出来。因此，必须加以连续搅拌，产生有关试剂不稳定性和难以在自动仪器中进行试验的问题。进而，诸如高岭土等激活物不能用于进行光学凝血测量。
液体激活物是固体激活物的替代选择。不过，诸如鞣花酸等激活物已知容易诱发试验结果改变。进而，它们的敏感性与前述试剂相比减低了。有人已经提出了各种联合使用，以改进这类试剂的性能。作为实例，国际专利申请WO-A-91/16453推荐基于鞣花酸、苯酚和金属离子的试剂，优选地与硫酸葡聚糖联用。
有文献已经描述过其他接触激活物溶液，特别是欧洲专利EP-A-0525035，其中接触激活物是羟基取代的芳族化合物，选自没食子酸盐和鞣酸；国际专利申请WO-A-98/44352，其中接触激活物是鞣花酸；和美国专利US-A-5550028，其中接触激活物是四羟基-1，4-醌。
有人还提出硫苷酯类作为经由内在途径凝血的激活化合物。不过，它们的活性水平一直不被认为是足够的，这类化合物的进一步缺点在于比其他可利用的激活物相对昂贵。
因此，需要新颖的凝血试剂或者改进现有的试剂，在保留从经济观点来看的优点的同时，具有足够的稳定性和敏感性，诱导较短的活化时间，能够用于自动分析仪器，以大量进行试验。
本发明涉及这类替代的接触激活物，它们能够参与内源性凝血和产生系统与试验，它们能够探查这种内源性凝血，检测异常。
本发明进一步涉及这些激活物在APTT型测定法中的用途，该测定法用于探查内源性凝血。
按照特定的实施方式，内源性凝血的激活物与这样的化合物有关，它们可以关于在某些病理学中所面临的一些凝血时间异常来调节用于APTT的试剂的响应敏感性。
在能够激活内源性凝血的物质的研究上下文中，本发明人已经研究了与目前在APTT试验中用作凝血激活物的化合物相比具有有利的溶解性质的化合物，特别是从没食子酸开始，它们已经研究了能够激活内源性凝血的衍生物。
在不涉及本发明领域的领域中，专利申请DE2750560A1描述了用乙二醇或各种聚乙二醇酯化没食子酸所得到的酯。这些酯用作玻璃纤维的保护材料，包括在含有混凝土的复合材料中。
在另一领域中，也就是用于对抗食品中的脂肪与油变质的抗氧化化合物领域，Weetall H.H.(Applied Biochemistry andBiotechnology(应用生物化学与生物工程)，vol11，1985)提出从没食子酸合成酯，特别是利用醇和二醇。该出版物指出，如果酯和二醇酯的确是利用鞣酸酶从黑曲霉(Aspergillus niger)合成的，那么产物的具体性质仍然有待测定。
有关试剂是内源性凝血途径的接触激活物，在PF3和钙的存在下，在37℃下培育血浆样本后，能够具有促凝血活性，也就是激活XII因子为活化的XIIa因子的活性。
优选地，这些化合物是可溶的，或者如果必要的话可以在修饰后被赋予可溶性。
因此，本发明提供下式化合物 其中·A选自下式 或 Mq+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1与170之间的整数；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外来氨基酸，r是1与10之间的整数。
上文定义的化合物中，本发明在特定的实施方式涉及这样的化合物，它们具有能够被溶解的优点，特别是在含水溶液中。优选地，它们是完全可溶的。
由上文已给出含义的R构成的侧链是这样的，n值优选在1或以上与170或以下之间。确切地说，n在1至50的范围内，例如1至30，1至20是有利的。
特别优选地，n等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
按照本发明，第一类优选的化合物定义如下 其中R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1与170之间的整数；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外来氨基酸，r是1与10之间的整数。
本发明的第一种优选实施方式中，在式(I)或(II)之一中，R代表 m和n具有上文给出的含义。
有利地，在本发明上下文中，式(II)化合物是这样的R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OH其中n是1与170之间的整数，优选在1与10之间。
这种优选形式的本发明化合物(II)相当于聚乙二醇没食子酸酯的氧化形式。
这种氧化形式是由式(II)中芳族环的-OH基团之一在碱性介质中的氧化作用所得的醌形式。
本发明化合物在进一步的方面还可以由具有下式的一类构成，它们相当于离子化形式的式(III)，与在本发明文件中所定义的一价或二价阳离子缔合 其中R代表 m等于2、3、4或5；n是1与170之间的整数；Mq+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2。
除了4-位醌以外，这种第二类具有式(III)的本发明化合物在离子化形式(醇化钠)中包含两个-OH官能团(3-位和5-位)，当介质的pH大于pKa时生成离子化形式。
确切地说，本发明涉及氧化的乙二醇或聚乙二醇的没食子酸酯的碱形式，所述化合物在碱性介质中与阳离子缔合。
优选地，它是乙二醇没食子酸酯的碱形式，其中R具有上文给出的含义，m＝2，n＝1。
这种碱形式的氧化的乙二醇没食子酸酯是水溶性的。
为了能够使用，所得组合物的pH必须减少至生理学上可接受的值。加入阳离子可以加速和稳定化平衡在生理pH下向醌的钠形式(根据式III)移动，这赋予其立即凝血的性质。
上文确定的式(I)化合物中，本发明有利地提供如下定义的化合物 其中·A是 或， ·R是-CH2-CH2-OH；
Mq+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2。
这些化合物分别是氧化的乙二醇没食子酸酯的酸形式和氧化的乙二醇没食子酸酯的碱或盐形式。
碱性醌盐形式是以在355nm波长下可检测的黄色为特征的，由于其在含水介质中的溶解性而是特别有利的。
为了制备上文和下文定义的本发明化合物，阳离子Mq+有利地是金属阳离子，特别是Mn2+或Cu2+或Co2+。
作为替代选择，它可以由非金属阳离子构成，例如反荷离子，它在本发明化合物的制备期间通过在碱性介质中加热得到供应。下文定义了这样一种制备方法，Mq+有利地是Na+、K+或NH4+。
阳离子的浓度可以被定义为对正常参照样本所观察到的凝血时间的函数。对金属离子有利的是，该浓度在5微摩尔(μM)至15μM范围内，优选约10μM。
本发明在进一步特定的实施方式提供一类式(I)化合物 其中·A选自下式 其中Mq+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R代表-[-NH-CH2-CH2-]n-NH2，其中n是1与170之间的整数。
确切地说，在R的定义的上下文中，n在1至50的范围内，例如1至30，1与20之间是有利的。
优选的聚乙二胺没食子酸酯是由氧化芳族环上-OH基团之一所得到的醌形式。它相当于下式 其中n是1与170之间的整数；优选在1至50的范围内，例如1至30，1至20是有利的。
上式中，n特别优选地等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
有利地，它是乙二胺没食子酸酯(n＝1)。
本发明化合物还可以是与一价或二价阳离子、特别是金属阳离子缔合的形式。这些化合物具有下式 ·其中n是1与170之间的整数；·Mq+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2。
确切地说，n在1至50的范围内，例如1至30，1至20是有利的。
特别优选地，n等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本发明在第三种实施方式提供一种化合物，其特征在于它具有式(I) 其中·A选自下式 或，
其中Mq+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R是氨基酸残基或肽。
优选地，如本发明的前两种实施方式所示，本发明化合物是由芳族环上-OH基团之一的氧化作用所得到的醌形式 或者是与一价或二价阳离子缔合的形式 其中M、q和p具有上文给出的定义。
优选用于制备上述化合物的氨基酸是丝氨酸，其中 在这种情况下，本发明化合物有利地具有下式 或 M、q和p具有上文给出的含义。
本发明还提供一种组合物，其特征在于它包含多种化合物的混合物，特别是至少两种选自上述那些的化合物的混合物，无论化合物来自上述那些相同的类或相同的组，或者相反，化合物属于上述那些不同的类或组。
确切地说，组合物的特征在于它包含至少两种不同的下式化合物 这些化合物关于基团A是相同或不同的，关于基团R是相同或不同的，A和R具有上文给出的含义。
本发明优选涉及一种组合物，其特征在于它包含化合物(IV)与(V)的混合物，分别构成氧化的乙二醇没食子酸酯(EGGox)的酸与碱形式，具有下式 和 M、q和p具有上述定义。
因此，该组合物包含氧化的乙二醇没食子酸酯的酸与碱形式的混合物，相当于在碱性介质中加热时或者在金属阳离子的存在下从乙二醇没食子酸酯所得酮-烯醇平衡的产物。
通过调节反应条件，特别是改变反应介质中的pH或阳离子浓度，氧化的乙二醇没食子酸酯的酸与碱形式之间的平衡可以向这些形式之一移动。
有利地，所定义的组合物的特征在于它是一种溶液，优选为含水溶液。
在前述定义的上下文中，本发明在特定的方面涉及一种组合物，其中氧化的乙二醇没食子酸酯的式(V)碱形式是主要的。
关于构成用于内源性凝血的激活组合物，特别是用于进行探查内源性凝血的体外试验，这种水溶性碱形式具有完全有利的性质。
在本发明的特定实施方式中，上述定义之一的组合物具有生理学上可接受的碱性pH。该pH是在氧化EGG后调节的，例如在缓冲分子的存在下MOPS((N-吗啉代基)丙磺酸)或TRICINE(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)。选择MOPS分子是有利的。
在本发明的进一步实施方式中，组合物的特征在于它包含没食子酸酯的不同形式的混合物，由酮-烯醇平衡生成，具有下式 M、q和p具有上文给出的定义之一。
没食子酸酯烯醇化物的一种或另一种形式的存在取决于反应条件，酮-烯醇平衡因此移动得到更多或更少量的所生成的没食子酸酯形式之一。
在本发明的上下文中，倾向于存在式(V)的氧化的没食子酸酯的式(V)碱形式。
优选的本发明化合物和组合物还可以被定义为进行一种方法的结果，该方法包含下列步骤·用乙二醇酯化没食子酸，回收由乙二醇没食子酸酯(EGG)构成的反应产物之一，具有下式 ·使EGG与碱性介质接触，并加热至70℃至90℃的温度，移动酮-烯醇平衡。
酮-烯醇平衡形成反应有利地在80℃下进行24小时。
利用上述方法制备得到3种没食子酸酯形式的混合物，所述混合物有可能向氧化形式移动。
优选地，所得组合物的特征在于该方法进一步包含下列步骤·通过调节pH，稳定化所得酮-烯醇平衡；·在碱性pH下回收溶液中的式(IV)与(V)化合物。
EGG的氧化形式是在氢氧化钠的存在下生成的，特别是过量的氢氧化钠，使酮-烯醇平衡向氧化的乙二醇没食子酸酯的碱形式移动。热处理是在70℃至90℃的温度下进行的，优选为80℃，时间为24小时。
溶液的pH是碱性pH，加入缓冲剂可以终止氢氧化钠的作用，缓冲剂有助于稳定化所得酮-烯醇平衡。特别优选地，本发明组合物的pH在7.6至7.8范围内。
所加入的缓冲剂例如可以是MOPS或TRIS缓冲剂。
组合物含有本发明化合物的浓度在100μM至1000μM范围内。
在本发明上下文中所定义的组合物和化合物与血浆样本接触后能够激活内源性凝血；换句话说，在约37℃的温度下，在PF3和钙的存在下，在与血浆样本接触和培育之后，它们能够激活XII因子为XIIa因子。
本发明还涉及用于体外检查血液样本内源性凝血的试剂系统，该系统在其试剂中包括如上定义的化合物或组合物。
优选的本发明试剂包含下式没食子酸盐的活化形式 M、q和p具有上文给出的定义；R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1与170之间的整数；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外来氨基酸，r是1与10之间的整数。
确切地说，在R的定义上下文中，n在1至50的范围内，例如1至30，1至20是有利的。
在上式中特别优选地，n等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在测定本发明化合物的浓度时考虑这样的事实，在APTT系统中，健康受试者血浆的预期凝血时间一般在28至40秒的范围内。在这种上下文下，本发明化合物和其他用于凝血试验的成分的浓度可以从健康血浆样本的所需凝血时间加以限定。确切地说，本发明化合物的浓度可以在100μM与1000μM之间。
优化试剂主要成分浓度的目的在于使凝血时间对至少30名健康受试者血浆样本来说都在这种间隔内。
进而，优化关于APTT试剂活性成分的生化参数可以使时间延长，由此可以调节对某些被APTT试验揭示的疾病的检测敏感性。因此，例如，在狼疮抗凝物综合征的病例中见到过时间比健康参照受试者延长至少20％。关于用未分级的肝素抗凝剂治疗的受试者血浆，见到时间比参照时间延长1.5至3.0倍。关于A与B型血友病，需要最大可能的敏感性，时间大为延长。
优选地，如此构成的试剂包含活化的乙二醇没食子酸酯。活性来自所得酮-烯醇平衡及其在生理学上可接受的pH下的稳定化作用。
在特定的发明实施方式中，没食子酸酯、特别是乙二醇没食子酸酯在所述组合物或试剂系统中的浓度有利地在100至1000μM范围内，优选为100μM。
本发明还涉及上述定义中的任意化合物或任意组合物用于制备试剂用途，该试剂用于探查内源性凝血，尤其用于进行APTT试验，其中所述化合物或组合物是与一种成分缔合的，该成分具有调节本发明化合物或组合物的响应敏感性的活性。
敏感性的调节可以在于减少对血浆样本所观察到的凝血时间的延长，这些血浆样本来自患有狼疮抗凝固类型病变的患者或者用抗凝物质治疗的患者，例如基于非分馏的肝素抗凝剂。
作为替代选择，这种敏感性的调节可以在于减少对非病理血浆样本所测量到的凝血时间。
这样一种适合于调节用本发明化合物或组合物制备的试剂的敏感性的成分是一种聚氨基酸，特别是取代的聚氨基酸，尤其是部分取代，取代涉及被琥珀酰基(-CO-CH2-CH2-COOH)或戊二酰基(-OC(CH2)3CO)取代的氨基。
取代必须不会影响原始成分的空间构型和/或稳定性，在这样的情况下被取代的聚氨基酸将不再能够实现其对敏感性的调节作用。
出于这些原因，完全取代的聚氨基酸将是不适宜的。
按照优选的发明实施方式，调节成分是取代的聚赖氨酸(D-或L-聚赖氨酸或其混合物)，尤其是琥珀酰化的，例如它是取代的L-聚赖氨酸，琥珀酰化的L-聚赖氨酸是有利的。本发明人尤其使用琥珀酰化的L-聚赖氨酸，在SIGNMA目录(2001-2002)中可以查到。还可以使用戊二酰化的聚赖氨酸。
有利地可以使用琥珀酰化的L-聚赖氨酸，其分子量在20000至300000Da的范围内，优选50000至300000Da。
调节成分在为了进行APTT试验而制备的试剂中的浓度、特别是琥珀酰化L-聚赖氨酸(SIGMA)的浓度在10至100μg/ml的范围内，优选50至100μg/ml。
可以在制备用于探查内源性凝血的试验、例如APTT的试剂期间的任意时间加入取代的聚氨基酸，特别是琥珀酰化的聚赖氨酸。
除了用于内源性凝血的接触激活物以外，本发明的试剂系统还包含血小板膜磷脂的代用品。这种代用品可以是脑磷脂从哺乳动物大脑提取的磷脂悬液。
本发明还涉及一种试剂系统，它还包含独立于其他试剂的Ca2+离子，用于激发参与内源性途径的因子的活化作用。
本发明试剂和为了进行APTT试验而酌情使用的其他成分可以被安排在试剂盒内。
用于探查凝血、特别是内源性凝血的本发明化合物、组合物或试剂可以用于测量血液样本、特别是血浆样本的活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。在这一点上，我们有利地使用排除了血小板的血浆。
在这种测量的上下文中，用于进行该试验的正常条件特别要符合样本制备。
血浆样本最初可以用柠檬酸盐处理，例如使样本中所含有的Ca2+离子形成配合物，以便样本不再能够凝固。然后用作为凝血激活物的本发明化合物或组合物和磷脂代用品培育样本。然后加入Ca2+离子，加入量等于已经形成配合物的量，以激发凝血。
本发明化合物或组合物的活性要求它们的pH是生理学上可接受的数值。
本发明的化合物、组合物或试剂还可以用于测定全血的凝血时间或血浆的凝血时间。
因此，本发明还可涉及根据上述说明的化合物或组合物在试剂系统制备中的用途，该试剂系统用于检查参与内源性凝血途径的凝血因子。有关因子主要是XII、XI、IX和VIII因子。
在这里的上下文中，本发明例如涉及与维勒布兰德氏病、血友病A与B有关的异常的检测或者抗凝剂的检测。这些异常导致APTT时间超出正常值以外，后者通常在20与40秒之间。
因此，本发明还涉及用于测量活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的方法，包含下列步骤·在允许内源性凝血途径活化的条件下，在血小板膜磷脂代用品的存在下，使排除了血小板的血浆样本与根据本发明的化合物或组合物接触；
·加入Ca2+离子，加入量等于这些离子在血浆样本中已经形成配合物的量；·测量转化纤维蛋白原为纤维蛋白所需的时间。
确切地说，在进行上述方法的上下文中，血浆样本由排除了血小板的血浆构成，在37℃下用血浆培育凝血激活物达约2至5分钟。磷脂膜代用品是在反应开始时加入的，或者是与激活物混合的，或者是在反应期间单独加入的。
然后加入钙离子，例如氯化钙的形式，浓度在20mM至25mM的范围内。然后测量纤维蛋白生成所需的时间。
当它超出相当于正常凝血情形的时间间隔(也就是在20与40秒之间)时，所测量的时间表明内源性凝血途径的参数之一处于异常状态，包括缺失，或者表明在供试血浆中存在抗凝化合物。
当供试血浆包含异常量的内源性凝血途径因子时，本发明可以利用这样一种系统定量分析有关因子，该系统排除了该因子，其中所有其他参数都是被过量引入的。在这种系统中，在加入所要研究的血浆之后，只有所要测定的因子是限量的。
本发明还涉及用于制备下式化合物的方法 其中·A代表选自下式的一种或多种化合物 Mq+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R代表 或， m等于2、3、4或5，n是1与170之间的整数；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外来氨基酸，r是1与10之间的整数；所述方法包含下列步骤·在含有至少一个醇官能团的化合物的存在下酯化没食子酸，或者在含有至少一个胺官能团的化合物的存在下酰胺化没食子酸；·使所得没食子酸衍生物与OH-离子接触，生成下式化合物 ·在能够生成下式配合物的条件下加入金属阳离子Mq+(其中q等于1或2) ·通过加入缓冲剂，例如MOPS或TRICINE，在生理学上可接受的pH下稳定化合物(II)与(III)之间所得平衡；·回收所得溶液。
这种方法优选地是这样的，在乙二醇的存在下进行酯化作用，生成乙二醇没食子酸酯，由此当反应完全时，可以回收酮-烯醇平衡的产物，确切地包含氧化的乙二醇没食子酸酯的酸与碱形式，如果必要的话，还有残余量的乙二醇没食子酸酯。
该方法的定义涵盖优选类或组的本发明化合物或组合物的定义。
在特定的发明实施方式中，可能需要回收大部分氧化的乙二醇没食子酸酯的式(V)碱形式，为此向这种碱形式移动平衡可以是有利的。
本发明人已经开发了进一步的方法，用于制备具有内源性凝血活化性质的本发明式A化合物。该方法包含下列步骤·酯化没食子酸；·在缓冲溶液中，在碱性pH下，加热所得没食子酸酯至70℃至90℃的温度，优选为80℃，达16小时至24小时，优选为24小时；·回收存在于溶液中的不同形式的没食子酸酯。
本发明的其他性质和优点将因下列实施例而变得显而易见，它们构成发明主题的优选实施方式和再现方式。
实施例1本例中，用利用各种阳离子制备的本发明APTT试剂测量凝血时间。测试了不同类型的血浆，包括正常的和被APTT试验揭示有疾病的·CK-Prest＝参照APTT试剂，其中接触激活物是高岭土；·pool N＝来自健康受试者的等量血浆的混合物；·CCN＝凝血对照正常对照血浆，正常水平；·CCP＝凝血对照病理对照血浆，疾病水平；·肝素＝接受抗凝剂治疗的患者血浆，抗凝剂是基于未分级的肝素的钠或钙盐形式；·狼疮＝表现狼疮抗凝物综合征的患者血浆；·def.f.VIIIc＝表现f.VIIIc缺乏(血友病A)的患者血浆。
测量是利用一种止血仪器(STA-Diagnostica Stago)进行的。
实施例2下例中，利用从没食子酸的酰胺或酯所得APTT试剂测定不同血浆的凝血时间。
·正常血浆＝等量正常受试者血浆的混合物；·CCN＝凝血对照正常对照血浆，正常水平；·CCP＝凝血对照病理对照血浆，疾病水平；·肝素＝接受抗凝剂治疗的患者血浆，抗凝剂是基于未分级的肝素的钠或钙盐形式；·狼疮＝表现狼疮抗凝物综合征的患者血浆；·def.f.VIIIc＝表现f.VIIIc缺乏(血友病A)的患者血浆。
从该表可以看出，利用乙二醇没食子酸酯得到最接近于参照试剂CK-Prest的结果。
实施例3在80℃下加热24小时后，500μM乙二醇没食子酸酯的pH7.00溶液在APTT凝血试验中变为活性。下表显示分子的活化动力学。
比较乙二醇没食子酸酯溶液与参照试剂CK-PREST的促凝血活性，后者是其中激活物为高岭土的APTT试剂。用于测量凝血时间的仪器是自动STA Diagnostica Stago止血仪(系列n°307)。
出现凝血活性的同时，显现黄色，可在355nm下测量。
供试血浆是定性对照血浆CCN＝凝血对照正常；CCP＝凝血对照病理，批次n°980901。
所制备的APTT试剂＝乙二醇没食子酸酯，500μM，在80℃下氧化+Tricine，50mM，pH7.00+脑磷脂(血小板磷脂代用品)。
实施例4在合理的加热时间(＜4天)内，从常用于生物系统的那些选择的各种缓冲分子可以产生显著的促凝血活性，接近于参照试剂CK-PREST。它们是下列分子·TRICINEN-三(羟甲基)甲基甘氨酸；·HEPESN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸；·MOPS(N-吗啉代基)丙磺酸；·TRIS[三(羟甲基)氨基甲烷]。
TRICINE和MOPS缓冲剂是优选使用的，至于TRIS，在乙二醇没食子酸酯的活化期间出现沉淀，至于HEPES缓冲剂，加热不得不进行更长的时间。下表显示关于2份对照血浆(正常和病理)、1份健康供体血浆混合物和4份表现在APTT型凝血系统中可检测的疾病的血浆所得情况·pool N＝大量正常血浆的混合物；·CCN＝凝血对照正常对照血浆，正常水平；·CCP＝凝血对照病理对照血浆，病理水平；·LA＝患有狼疮抗凝物综合征的患者血浆；·Hep＝接受抗凝剂治疗的患者血浆，抗凝剂是基于未分级的肝素的钙盐形式。测试了2种肝素血水平的两份血浆0.09和0.034国际单位每ml；·def.f.VIIIc＝血友病A的血浆，VIIIc因子的活性为40％。
所得凝血时间以秒表示。
计算患者血浆所得凝血时间除以正常混合物所得凝血时间之比或者病理凝血对照(CCP)除以正常对照(CCN)之比，得到用4种缓冲剂所制备的每种试剂的响应敏感性。
R＝患者凝血时间/Pool N凝血时间
实施例5APTT试剂的使用具有两个目的·利用正常-异常响应进行内源性血液凝固途径的一般性探查；·分析与定量探查参与内源性凝血途径的凝血因子f.XII-XI-IX-VIIIc；·有可能利用这样一种系统在患者血浆中测定内源性途径中的任意凝血因子，该系统被特别排除了该因子。所有其他参数是被过量引入的；只有所要测定的因子是限量的。在相同条件下生成校准曲线，在与之比较后活性成为可量化的。根据缺乏的多少，凝血时间在或多或少的程度上延长了(参见VIIIc因子的例子)。

如此构成的APTT试剂的最佳活性取决于乙二醇没食子酸酯和脑磷脂的浓度。
下表显示不同病症和一些对照的代表性血浆所得结果。
浓度可以在100μM至1000μM的范围内选择。我们的优选浓度是100μM。
最佳脑磷脂浓度的测定
实施例7选择氯化锰的浓度本例中，利用按照本发明制备的APTT试剂测量凝血时间，其中氯化锰的浓度是不同的。
供试血浆是定性对照血浆。使用两种水平正常水平和病理水平。
同时测试商品CK Prest试剂，构成参照。
优选地，浓度采用10μM。
实施例8可以有利的是能够调节APTT试剂对于在各种病理情形中观察到的某些凝血时间异常的响应敏感性。这种调节作用的目的在于获得具有与响应敏感性有关的特定性质的试剂，这些性质从一个生产批次到另一个批次是可再现的。
本发明人已经观察到，在含有乙二醇没食子酸酯的APTT试剂中加入琥珀酰化L-聚赖氨酸(SIGMA)时，从表现狼疮抗凝物综合征的患者或者从用基于未分级的肝素的抗凝剂治疗的患者所得血浆有可能减少凝血时间。而且还观察到，琥珀酰化L-聚赖氨酸的使用可以减少对正常人群所得血浆所测量的凝血时间。
通过使用或多或少在氨基水平上被琥珀酰基或戊二酰基取代的聚氨基酸可以得到这些观察结果，目的是定义试剂的敏感性水平。
一种优选的发明实施方式在于使用部分取代的L-聚赖氨酸。下表总结实施例所用各种对照血浆所得到的结果。
CCN凝血对照正常CCP凝血对照病理Pool N大量正常血浆的混合物LA表现狼疮抗凝物综合征的患者血浆肝素接受基于未分级的肝素的抗凝剂治疗的患者血浆Def VIII C血友病A血浆，VIII因子活性为40％
关于琥珀酰化L-聚氨酸在本发明框架内的使用，琥珀酰化L-聚氨酸的分子量优选在50000至300000Da的范围内，对于该范围分子量的浓度优选为50μg/ml。
权利要求
1.下式化合物 其中·A选自下式 Mq+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R代表 ，或 m等于2、3、4或5，n是1与1 70之间的整数；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外来氨基酸，r是1与10之间的整数，其条件是若m是2、3或4，则该化合物不是
2.根据权利要求1的化合物，具有下式 其中R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OHn是1与170之间的整数。
3.根据权利要求1的化合物，具有下式 其中·R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OH，其中n是1与170之间的整数；·M+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2。
4.根据权利要求2或权利要求3的化合物，具有式(II)或(III)，其中R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OHn是1与10之间的整数。
5.根据权利要求4的化合物，其中n等于1。
6.根据权利要求1至5任意一项的化合物，具有下式 其中·A是 或， M+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R是-CH2-CH2-OH。
7.根据权利要求1的化合物，具有下式 其中·A是 或， M+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R是天然或外来氨基酸残基或肽，优选为丝氨酸。
8.组合物，其特征在于它包含至少两种不同的下式化合物的混合物 这两种化合物关于基团A是相同或不同的，关于基团R是相同或不同的，所述基团A和R是这样的·A选自下式 M+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R代表 或， m等于2、3、4或5，n是1与170之间的整数，优选在1与50、1与30或1与20之间；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外来氨基酸，r是1与10之间的整数。
9.根据权利要求8的组合物，其特征在于它包含化合物(IV)与(V)的混合物，分别构成氧化的乙二醇没食子酸酯的酸与碱形式，具有下式 和 其中M+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2。
10.根据权利要求8或权利要求9的组合物，其特征在于它包含不同形式的乙二醇没食子酸酯，由酮-烯醇平衡生成，具有下式 其中·A选自下式 或， M+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R是-CH2-CH2-OH。
11.能够通过进行这样一种方法获得的组合物，该方法包含下列步骤·用乙二醇酯化没食子酸，回收由乙二醇没食子酸酯(EGG)构成的反应产物之一，具有下式 ·使EGG与碱性介质接触，并加热至70℃至90℃的温度达24小时，移动酮-烯醇平衡。
12.根据权利要求11的化合物，其特征在于该方法进一步包含下列步骤·通过调节pH，稳定化所得酮-烯醇平衡；·在碱性pH下回收溶液中的式(IV)与(V)化合物。
13.可以通过进行下列步骤获得的化合物·酯化没食子酸；·在缓冲溶液中，在碱性pH下，加热所得没食子酸酯至70℃至90℃的温度达16小时至24小时；·回收存在于溶液中的不同形式的没食子酸酯。
14.根据权利要求1至7、11至13任意一项的化合物，其特征在于它是含水溶液的形式。
15.组合物，其特征在于它包含可以利用根据权利要求11至13任意一项的方法获得的化合物的混合物。
16.根据权利要求8至10任意一项的组合物，其特征在于它主要包含下式的碱性EGGox M+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2。
17.根据权利要求8至10或16任意一项的组合物，其特征在于它在稳定化的平衡中含有式(IV)和(V)化合物，并且具有生理学上可接受的pH。
18.根据权利要求8至10或16或17任意一项的组合物，其特征在于它含有式(IV)与(V)化合物的混合物，并且它的pH在7.6至7.8的范围内。
19.根据权利要求8至10或16至18任意一项的组合物，它能够在与血浆样本接触后激活内源性凝血，进一步包含选自MOPS和TRICINE的缓冲剂。
20.根据权利要求8至10或16至19任意一项的组合物，其特征在于它所含有的化合物的浓度足以在与血浆样本接触后激活内源性凝血。
21.根据权利要求1至7任意一项的化合物，其特征在于该阳离子是金属阳离子。
22.根据权利要求21的化合物，其特征在于该金属阳离子选自Mn2+、Cu2+和Co2+。
23.根据权利要求8至10或15至20任意一项的组合物，其特征在于该阳离子是金属阳离子。
24.根据权利要求23的组合物，其特征在于该金属阳离子选自Mn2+、Cu2+和Co2+。
25.用于体外检查内源性凝血的试剂系统，包含根据权利要求1至7或11至14或21或22任意一项的化合物或下式化合物 其中m等于2、3或4，或根据权利要求8至10或15至20或23或24任意一项的组合物，其条件是它构成内源性凝血激活物，所述系统进一步包含血小板膜磷脂的代用品。
26.根据权利要求25的试剂系统，其特征在于该内源性凝血激活物包含下式活化形式的EGG 其中M+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1与170之间的整数；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外来氨基酸，r是1与10之间的整数。
27.根据权利要求8至10或15至20或23或24任意一项的组合物或根据权利要求25或26的试剂，其特征在于它的EGG浓度在100μM至1000μM的范围内。
28.与能够调节其敏感性的成分联合的根据权利要求1至7任意一项的化合物或符合下式的化合物 其中m是2、3或4，或根据权利要求8至24或27任意一项的组合物，或根据权利要求25或26的试剂，所述成分是取代的聚氨基酸。
29.根据权利要求28的化合物、组合物或试剂，与琥珀酰化聚赖氨酸联合。
30.根据权利要求29的化合物、组合物或试剂，与分子量在20000至300000Da范围内的琥珀酰化聚赖氨酸联合。
31.根据权利要求28的化合物、组合物或试剂，与戊二酰化聚赖氨酸联合。
32.根据权利要求1至7任意一项的化合物或下式化合物 其中m是2、3或4，或根据权利要求8至10或15至20或23或24任意一项的组合物或根据权利要求25至27任意一项的试剂或根据权利要求28至30任意一项的组合物用于准备试验的用途，该试验用于体外检查内源性凝血。
33.根据权利要求1至7任意一项的化合物或下式化合物 其中m是2、3或4，或根据权利要求8至10或15至20或23或24任意一项的组合物或根据权利要求25或26的试剂或根据权利要求28至30任意一项的组合物的用途，用于探查内源性途径凝血。
34.根据权利要求33的用途，其中测定活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。
35.根据权利要求32的用途，其中测定活化全血的凝血时间。
36.根据权利要求32的用途，其中测定活化血浆的凝血时间。
37.根据权利要求1至7任意一项的化合物或下式化合物 其中m是2、3或4，或根据权利要求8至10或15至20或23或24任意一项的组合物或根据权利要求25或26的试剂或根据权利要求28至30任意一项的组合物的用途，用于检查参与内源性凝血途径的凝血因子。
38.用于制备下式化合物的方法 其中·A选自下式 M+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OHn是1与170之间的整数；所述方法包含下列步骤·在含有醇官能团的化合物的存在下使没食子酸反应；·使所得没食子酸酯与碱性介质接触，生成下式化合物 ·在能够生成下式配合物的条件下加入金属阳离子Mq+(其中q等于1或2) ·加入缓冲剂，在生理学上可接受的pH下稳定化合物(II)与(III)之间所得平衡；·回收所得溶液。
39.根据权利要求38的方法，其特征在于在乙二醇的存在下进行酯化作用，生成乙二醇没食子酸酯(EGG)，并且回收参与酮-烯醇平衡的EGG形式混合物。
40.根据权利要求38的方法，其特征在于回收下式EGG的可溶形式 M+是阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2。
41.用于制备下式化合物的方法 其中·A选自下式 或， M+代表阳离子，q等于1或2，p满足p×q＝2；·R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OH，其中n是1与170之间的整数；该方法包含下列步骤·酯化没食子酸；·在缓冲溶液中，在碱性pH下，加热所得没食子酸酯至70℃至90℃的温度达16小时至24小时；·回收存在于溶液中的不同形式的没食子酸酯。
42.用于测量活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的方法，包含下列步骤·在允许内源性凝血途径活化的条件下，在血小板膜磷脂代用品的存在下，使排除了血小板的血浆样本与根据权利要求1至7或11至14或21或22任意一项的化合物或下式化合物 其中m等于2、3或4，或根据权利要求8至10或15至20或23或24任意一项的组合物或根据权利要求25或26的试剂系统或根据权利要求28至30任意一项的组合物接触；·加入Ca2+离子，加入量在20mM至25mM的范围内；·测量转化纤维蛋白原为纤维蛋白所需的时间。
全文摘要
本发明涉及内源性凝血途径的接触激活物和它们在探查凝血异常中的用途。本发明的激活物是没食子酸的衍生物，优选为聚乙二醇没食子酸酯。
文档编号C07C69/84GK1460098SQ0280079
公开日2003年12月3日 申请日期2002年3月22日 优先权日2001年3月23日
发明者J-P·罗辛, S·斯特尤斯, G·奎恩廷 申请人:斯塔戈诊断公司