专利名称：用于治疗眼紊乱和疾病的超氧化物岐化酶模拟物的制作方法
技术领域：
本申请要求于2002年12月6日提交的U.S.S.N.60/431,401的优先权。
本发明涉及用于治疗渗出性和非渗出性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病和视网膜水肿的超氧化物歧化酶模拟物。
背景技术：
在西方国家中，年龄相关性黄斑变性(AMD)是引起老龄人群视力损伤的最普遍的原因。渗出性或“湿性”AMD以脉络膜新生血管形成过量为特征，导致视网膜脱离和视力丧失。非渗出性或“干性”AMD以称为玻璃疣(drusen)的细胞碎片在视网膜色素上皮(RPE)下布鲁赫膜中的聚集为特征。渗出性AMD可通过激光凝固法或光动力疗法以有限的成功进行治疗，渗出性AMD发生于少数AMD患者中，但是它是一种发展更快的疾病形式。光动力疗法包括对受累区域给予化合物，当用适宜波长的光进行照射时，该化合物产生破坏周围血管的活性中间体。目前还没有可接受的疗法来用于治疗非渗出性AMD。
在光感受器细胞中，视觉循环由11-顺式视黄醛的与视蛋白结合的席夫碱吸收光子开始，异构化为相应的全反式视黄醛衍生物。从视蛋白释放出全反式视黄醛，然后与磷脂酰乙醇胺缩合形成新的席夫碱NRPE(为N-视黄基磷脂酰乙醇胺的缩写)。该如此形成的NRPE被转运穿过光感受器细胞外膜，在此被水解为全反式视黄醛。酶将其还原为全反式视黄醇，之后转运至RPE细胞中，在此全反式视黄醇经酶异构化为11-顺式视黄醇，并氧化为11-顺式视黄醛。11-顺式视黄醛被转运回光感受器细胞中，在此该化合物形成与视蛋白结合的席夫碱，以完成该循环。
除了有助于通过再循环视黄醛来完成视觉循环外，RPE细胞的一个重要功能是通过吞噬它们废弃的外节并在RPE细胞溶酶体中将其消化以维持视网膜光感受器的持续重塑。随着年龄的增长，在溶酶体中出现称为脂褐素的不被消化的色素的聚集(认为玻璃疣的出现相当于脂褐素的聚集)。脂褐素吸收光谱中蓝色部分的光，发出光谱中黄色部分的荧光。该荧光将能量转移至邻近的氧原子，氧原子开始转变成活性氧簇(ROS)如超氧离子。这些ROS使溶酶体膜的磷脂氧化，从而破坏膜的完整性。随着膜的完整性被破坏，溶酶体的毒性成分滤入细胞溶胶中，导致RPE细胞死亡。没有它们维持RPE细胞，视网膜光感受器则不能参与视觉转导系统，因而导致失明(综述参见Winkler等人，Mol.Vision，Vol.532，1999，在线期刊；http://www.molvis.org/molvis/v5/p32；CA 132235390)。
Nakanishi及其同事已经阐明了脂褐素的主要荧光成分的结构，并化学合成了该成分，称为A2E(Nakanishi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.9514609-14613，1998，以及其中引入的文献)。该化合物被认为如下经生物合成产生亲电子NRPE异构化为亲核烯胺1，接着与另一分子的全反式视黄醛聚合形成氮杂三烯2，经电环化闭合得到二氢吡啶3，自动氧化成N-(2-羟乙基)吡啶鎓分子A2PE，通过磷脂酶D将磷酸酯进行酶水解，得到A2E。具有两个大的疏水性“尾端”和一个带电荷的极性“头端”的分子——A2E的化学结构提示其具有破坏细胞膜的类似去污剂的倾向。该分子的这种性质与其光氧化能力一起形成化合物对RPE细胞的毒性作用的重要组成(综述参见Nakanishi等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，Vol.111533-1540，2001)。
通过下述发现已经强调了将全反式视黄醛有缺陷地转运出光感受器细胞在AMD疾病过程中的关键作用当遗传突变杂合表达时，其与非渗出性AMD相关，其中所述的遗传突变当杂合存在时可导致罕见的快速黄斑变性，称为斯塔加特疾病(Dean等人，Science，Vol.2771805-1807，1997)。该基因称为ABCR(为视网膜ATP粘合盒转运蛋白的缩写)基因，其蛋白质产物(也称rim蛋白质)利用ATP水解所释放的能量将分子转运穿过细胞膜。人们认为转运物的底物是上述提及的席夫碱NRPE。由于缺少足够的功能性转运蛋白，底物NRPE在光感受器细胞中聚集，而不是被转运出以还原为视黄醇。与视蛋白中释放的全反式视黄醛分子缩合，并如上进一步反应，生成A2E。A2E和光感受器细胞外节的剩余部分一起被RPE细胞摄取，在溶酶体中聚集。支持该假说的是由Travis等人所公开的如下内容在其ABCR基因中杂合有突变的小鼠中，A2E在RPE细胞中的聚集比正常对照组快得多(Travis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.977154-7159，2000)。
一些研究已经推断在模拟视网膜中条件的情形下，将脂褐素暴露于光和氧可导致细胞膜过氧化和细胞死亡。Wihlmark等人公开与没有脂褐素存在的情形下经照射所得的对照组相比，用蓝光照射含有负荷脂褐素的溶酶体的RPE细胞使细胞膜过氧化增加和细胞存活力降低(Wihlmark等人，Free Radical Biol.Med，Vol.221229-1234，1997)。Boulton和Shamsi已经公开对所培养的RPE细胞给予脂褐素并将它们暴露于光中，在24小时后，细胞存活力的降低超过40％，并且溶酶体(包括超氧化物歧化酶(SOD))的酶活性和抗氧化活性降低(Boulton和Shamsi，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，Vol.423041-3046，2001)。
从这些以及其它证据可以看出，在处理氧化代谢的毒性副产物的身体天然防御机制中存在的某些缺陷在AMD的发展中起重要作用。该防御体系的一个重要组成是SOD酶家族。这些酶含有低价金属(MnII或CuI/ZnI双核连接)，其催化高活性的超氧自由基阴离子歧化为毒性较低的物质O2和H2O2。如果未被淬灭，超氧阴离子可(以其质子化形式)从脂肪酸的烯丙基位点提取氢，导致膜被破坏。此外，超氧阴离子可与NO反应生成过亚硝酸盐，超氧阴离子是确信在NO生成过量的不利生物效应中扮演重要角色的有效氧化剂。
Boulton等人所公开的内容提示了SOD在增强RPE细胞存活力中的潜在重要性，他们已经报道在脂褐素的存在下通过照射脂膜、蛋白质和酶而引起的损害效应可通过加入SOD而显著降低(Boulton等人，J Biol.Chem.，Vol.27423828-23832，1999)。即使就渗出性AMD而言，对日本受试者的最新研究揭示了这种疾病形式与SOD基因中突变的显著相关性，这与SOD酶的靶向序列中缬氨酸/丙氨酸的取代相一致(Isashiki等人，Am.J.Ophthalmol.，Vol.130769-773，2000)。因此，增强SOD功能可成为预防渗出性和非渗出性AMD发展的可行目标。
氧化应激还促进糖尿病诱导的血管及神经功能障碍。所有形式的糖尿病导致视网膜、肾小球和外周神经出现糖尿病性特异性微血管病变(M.Brownlee，“糖尿病并发症的生物化学和分子细胞生物学”(Biochemistryand Molecular Cell Biology of Diabetic Complications)，Nature，Vol.414813-820，2001)。与糖尿病相关的氧化损伤的主要来源是超氧化物的水平升高。在从糖尿病患者中分离的人血管中检测到超氧化物的释放(Guzik等人，“人糖尿病中血管超氧化物生成增加的机理”(Mechanisms of IncreasedVascular Superoxide Production in Human Diabetes Mellitus)Circulation，Vol.1051656-62，2002)。超氧化物的来源包括血管组织和多形核白细胞(Shurtz-Swirski等人，“外周多形核白细胞在2型糖尿病患者的氧化应激和炎症中的参与”(Involvement of Perpheral Polymorphonuclear Leukocytesin Oxidative Stress and Inflammation in Type 2 Diabetic Patients)，Diabetes Care，Vol.24104-110，2001)。已经证明超氧化物歧化酶模拟物可延迟克隆细胞中糖尿病的发生(AEOL10113-Piganelli等人，“基于金属卟啉的超氧化物歧化酶模拟物抑制自身免疫性糖尿病通过致糖尿病性T-细胞克隆进行的过继转移”(A Metalloporphyrin-Based Superoxide DismutaseMimic Inhibits Adoptive Transfer of Autoimmune Diabetes by aDiabetogenic T-cell Clone)，Diabetes，Vol.51347-55，2002)，并在糖尿病大鼠中预防血管及神经功能障碍(M40403-Coppey等人，“在糖尿病大鼠中用M40403进行治疗对神经内膜血流、运动神经传导速度和坐骨神经外小动脉血管功能的影响”(Effect of M40403 Treatment of Diabetic Rats onEndoneurial Blood Flow，Motor Nerve Conduction Velocity and VascularFunction of Epineural Arterioles of the Siatic Nerve)，British Journal ofPharmacology，Vol.13421-9，2001)。在糖尿病性视网膜病患者中，脂质过氧化物的血清水平高于健康正常人或未患有糖尿病性视网膜病的糖尿病患者。虽然在糖尿病患者和正常人中其SOD水平保持相同，但是在所有糖尿病患者中关键的抗氧化剂——抗坏血酸的水平均较低(Gurler等人，“氧化应激在糖尿病性视网膜病中的作用”(The Role of Oxidative Stress inDiabetic Retinopathy)，Eye，Vol.1473035，2000)。这些研究成果表明在糖尿病性视网膜病患者中，内源性抗氧化机制被破坏。
由于生物利用度和致免疫性的问题，经静脉内给予Mn SOD本身来治疗或预防人体中与氧化应激有关的组织损伤、例如由于大脑或心肌缺血再灌注损伤而引起的组织损失是不成功的。这些问题被认为是由于Mn SOD是高分子量分子的事实。可以以与内源性Mn SOD相当的效率催化超氧化物岐化反应的低分子量化合物将是使前述副反应最少的良好候选者。Salvemini等人已经公开了一类作为低分子量SOD模拟物的Mn(II)-五氮杂大环络合物。例如，在肠缺血再灌注大鼠模型中，与未经处理的动物的0％存活率相比，给予1mg/kg化合物4的动物在4小时后存活90％[Salvemini等人，Science，Vol.286304，1999；WO 98/58636；Salvemini等人，DrugsFuture，Vol.25(10)1027，2000]，同样已经公开将这些化合物用于增强所植入的生物高分子假肢装置的稳定性(包括眼植入物；Ornberg等人，WO00/72893 A2)和治疗疼痛(Salvemini等人，美国专利US 6,180,620B1和6,214,817B1)。
同样已经公开某些具有治疗活性的Mn-salen络合物如SOD和过氧化氢酶模拟物的用途。例如，化合物5已经在大鼠卒中模型中被证明具有神经保护作用(Baker等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，Vol.284215-221，1998；Doctrow等人，J.Med.Chem.，Vol.454549-4558，2002)，而化合物6被发现可增加超氧化物歧化酶2的内源性表达不足的小鼠的寿命(Melov等人，J.Neurosci.，Vol.218348-8353，2001)。
其它研究者已经报道使用抗氧化性化合物来治疗眼疾病。Crapo等人已经公开含有卟啉的SOD模拟物在治疗青光眼和黄斑变性中的用途(Crapo等人，美国专利US 5,994,339和6,127,356)。Campbell等人已经公开某些salen或二吡啶基Mn(II或III)酚盐络合物在治疗眼色素层炎和白内障中的用途(Campbell等人，美国专利US 6,046,188和6,177,419 B1)。Levin已经公开卡维地洛及其衍生物和代谢物作为ROS清除剂来减少视网膜神经节细胞死亡的用途(WO 00/07584 A2)。Brownlee已经公开四(苯甲酸)卟啉锰在减少ROS于高糖条件下的聚集以治疗糖尿病性视网膜病中的用途(Brownlee，WO 00/19993 A2)。已经报道稳定的自由基4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基——一种不含金属的SOD模拟物——可抑制白化大鼠中光诱导的视网膜损伤(Wang等人，Res.Commun.Mol.Pathol.Pharmacol.，Vol.89291-305，1995)。然而，这些报道中没有一个是被公开或提示用于治疗AMD的本发明的化合物。
发明概述本申请涉及超氧化物歧化酶的模拟物在治疗患有渗出性和非渗出性AMD、包括糖尿病增殖性视网膜病变在内的糖尿病性视网膜病(统称为DR)和视网膜水肿的患者中的用途。
发明详述后段新生血管形成是危及视力的病理状况，其引起发达国家中后天性失明的两种最常见的病因渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病增殖性视网膜病变(PDR)。目前，许可用于在渗出性AMD中出现的后段NV的疗法仅有激光凝固法或用Visudyne进行的光动力疗法；两种疗法均涉及受损血管的阻塞，从而导致视网膜有局部的激光引起的损伤。外科手术玻璃体切割术和膜剥除术是糖尿病增殖性视网膜病变患者目前仅有的选择。没有严格意义上的药理学疗法被批准用于对抗后段NV，尽管多种不同化合物正在进行临床评估，这些化合物例如包括用于AMD的醋酸阿奈可他(Alcon，Inc.)、EYE 001(Eyetech)和rhuFabV2(Genentech)以及用于糖尿病性黄斑水肿的LY333531(Lilly)和氟轻松(Bausch & Lomb)。
除了在糖尿病患者中由高血糖诱导的、导致黄斑水肿的视网膜微脉管系统的改变之外，新生血管膜增殖同样伴随有血管渗出和视网膜水肿。当黄斑水肿时，视力下降。在糖尿病性视网膜病中，黄斑水肿是导致视力下降的主要原因。与血管生成疾病相似，激光凝固法用于稳定或消退水肿状况。虽然激光凝固法可减轻水肿进一步发展，但是令人遗憾的是，该方法是一种可改变受累眼睛视野的细胞破坏性操作。
对眼NV和水肿的有效药理学疗法在多种疾病中对患者基本上有效，由此可避免侵入性手术或者损伤性的激光操作。对NV和水肿进行有效治疗可改善患者的生活质量和社会生产力。同样，与给盲人提供帮助和卫生保健相关的社会费用也会显著降低。
目前已经发现，某些SOD模拟物可用于治疗AMD、DR和视网膜水肿。这些化合物具有式1和2结构
化合物1和2可按照美国专利US 6,127,356中所公开的方法进行合成，该专利的内容在此引入作为参考。
已经在多种体内生物学鉴定法中研究了化合物1和2。例如，Bowler等人已经报道在大鼠卒中模型中，在诱导大脑缺血后施用化合物1使促炎蛋白如IL-6和MIP-2增加的表达减弱[Bowler等人，Free Radical Biology& Medicine，33(8)1141-1152，2002]。同样，Mackensen等人已经公开在大鼠卒中模型中，在诱导大脑缺血之前或之后，给予化物2可使梗塞体积减少[Mackensen等人，Journal of Neuroscience，21(13)4582-4592，2001]。
本发明还涉及提供适于治疗视网膜和视神经乳头组织的组合物。本发明的眼用组合物包括一种或多种SOD模拟物和可药用的赋形剂。可使用各种类型的赋形剂。所述赋形剂本质上通常是含水的。根据制剂的舒适性以及患者通过将1至2滴该溶液滴至受累眼中而容易地使用该组合物的能力，通常优选含水溶液。然而，本发明的SOD模拟物还可容易地掺入其它类型的组合物中，例如悬浮液、粘稠或半粘稠凝胶或其它类型的固体或半固体组合物。对于相对不溶于水的SOD模拟物而言，悬浮液是优选的。本发明的眼用组合物还可包括各种其它的成分，例如缓冲剂、防腐剂、助溶剂和粘度构建剂(viscosity building agents)。
可加入适宜的缓冲体系(例如磷酸钠、乙酸钠或硼酸钠)以防止pH在储藏条件下漂移。
眼用产品通常被包装成多剂量形式。因此需要添加防腐剂以防止使用过程中的微生物污染。适宜的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、氯代丁醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、聚季铵盐-1或本领域技术人员已知的其它防腐剂。所述防腐剂通常以0.001至1.0％重量/体积(“％ w/v”)的浓度使用。
给药途径(例如局部、眼部注射、肠胃道外或口服)和剂量方案可由经验主治医师根据各种因素如所治疗病症的确切性质、病症的严重程度以及患者的年龄和身体的总体健康状况来确定。
通常，用于上述目的的剂量可以有所改变，但是应当是预防或治疗AMD、DR和视网膜水肿的有效量。如本文所用的术语“药物有效量”指可有效治疗人类患者中AMD、DR和/或视网膜水肿的一种或多种SOD模拟物的量。用于上述任一目的的剂量通常为每千克体重约0.01至约100毫克(mg/kg)，每日施用1至4次。当组合物为局部施用时，剂量通常为0.001至约5％w/v的浓度，每日1-4次，每次1-2滴。
如本文所用的术语“可药用载体”指安全的任何制剂，对于预期的给药途径，其可适宜地传送有效量的至少一种本发明的化合物。
下述实施例1和2为用于眼球内、眼周或眼球后注射或灌注的制剂。
实施例1
实施例2
实施例3下述片剂可依照美国专利US 5,049,586制备，该专利在此引入作为参考。
已经参考某些优选的实施方案描述了本发明；然而应当理解，在不背离其宗旨和基本性质的情形下，可以以其它具体形式或变通方式实施本发明。因此，上述实施方案被认为是从各个方面对本发明进行解释而非限制本发明，本发明的范围由所附的权利要求而非前述说明书来确定。
权利要求
1.治疗患者中AMD、DR和/或视网膜水肿的方法，该方法包括对需要该治疗的患者施用药物有效量的选自下述的化合物 和
全文摘要
本发明公开了SOD模拟物、特别是锰(III)卟啉络合物在治疗AMD、DR和视网膜水肿中的用途。
文档编号A61K31/555GK1717234SQ200380104119
公开日2006年1月4日 申请日期2003年12月5日 优先权日2002年12月6日
发明者P·G·科林寇, R·J·科利尔, M·R·赫勒贝格 申请人:爱尔康公司