专利名称：人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物化学物质在制药工程中的新用途。更具体说就是人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞的药物中的应用。本发明还涉及含人尿激肽原酶的药物组合物。
背景技术：
当脑部动脉的某分支因血管病变(如动脉硬化、动脉炎)，或血栓形成，或栓塞，使动脉管腔狭窄，甚或闭塞，导致急性脑供血不足，引起局部脑组织缺血、缺氧而发生坏死，出现一系列的临床症状，谓之脑梗塞。迄今为止，国际医学界尚没有能够阻止脑组织在缺血时发生坏死的方法，现代医学有的是增加脑部血流量以减轻局部脑组织缺血、缺氧，或以某种化学物质影响脑细胞，以减缓、减轻其坏死的进程。
历史上曾有人(如1926年Frey)注意到人尿激肽原酶具有扩张血管的作用。但由于原料尿的收集、酶的提取、精制困难，人尿激肽原酶一直未能得到工业化利用。再者，酶制剂经口服后，常常在消化道被破坏，也限制了它的医药用途。有报道(诊疗与新药Vol.30[10]199-212；1993)说，日本三和化学株式会社正在探讨激肽原酶类静脉注射制剂的制备方法。
目前，用人尿激肽原酶配制治疗或预防脑梗塞的药物制剂未见报道。
发明内容激肽原酶是天然存在于人尿中的一种糖蛋白，分子量约为54,000道尔顿(凝胶过滤法)，它是由238个氨基酸残基组成的一条单链，N--末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，分子中含有5对S-S键，分别为Cys7-Cys150，Cys26-Cys42，Cys29-Cys196，Cys161-Cys175以及Cys186-Cys211，等电点约为4.0。分子中含有14.4％的糖，结合位点分别位于Asn78，Asn84及Asn141，其糖的组成为甘露糖3％，半乳糖1.7％，岩藻糖0.8％，N-乙酰葡糖胺5.0％。一级结构(氨基酸组成序列)见下式 本发明提供一种人尿激肽原酶的医药新用途以人尿激肽原酶为活性成分，配以制药可接受的载体，制作成注射给药的制剂，用以治疗和预防脑梗塞。
人尿激肽原酶提取与纯化的工艺步骤为，将尿液(男性新鲜尿液为佳)用超滤膜对水超滤至电导不高于0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，0.1M NaCl，pH7.4的缓冲液；DEAE-Sepharose柱经0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，0.1M NaCl，pH7.4的缓冲液平衡。将浓缩尿液上DEAE-Sepharose柱，用平衡缓冲液冲洗，用0.05MNa2HPO4-NaH2PO4，0.3M NaCl，pH7.4的缓冲液洗脱，收集洗脱峰；Aprotinin-Sepharose柱经0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH8.0的平衡缓冲液平衡，将DEAE-Sepharose柱洗脱峰调pH8.0后上Aprotinin-Sepharose柱，用平衡缓冲液冲洗，用0.1M HAc-NaAc，pH4.0的缓冲液洗脱，收集洗脱峰；Aprotinin-Sepharose柱洗脱峰对0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，0.1M NaCl，pH7.0的缓冲液透析8小时，恒温水浴60℃加热10小时，超滤浓缩；Sephadex G-100柱经生理盐水平衡，将加热过的溶液上Sephadex G-100柱，生理盐水洗脱，收集洗脱峰；洗脱峰经0.22um膜过滤除菌，超滤浓缩，可得人尿激肽原酶精制品。
提纯后的人尿激肽原酶可与制药可接受的载体混合，制成多种剂型的药物。
所说的制药载体包括药用稀释剂、稳定剂、赋形剂，如甘氨酸、甘露醇、pH7.0磷酸盐缓冲溶液、白蛋白、右旋糖酐、葡萄糖、乳糖、氯化钠、山梨醇、柠檬酸、明胶、注射用水、生理盐水等，可同时使用其中的一种或多种。优选的组合为甘氨酸、甘露醇、pH7.0磷酸盐缓冲溶液。
本发明药物可制作成适合于静脉注射用、肌肉注射用、皮下注射用剂型，包括粉针、水针、输液等剂型。
优选的给药方式为静脉滴注和/或静脉推注。药物有效用量范围为0.0001～0.05PNA/kg，优选的用量为0.002～0.011PNA/kg。粉针或水针或输液制剂的剂量规格为每支(瓶)0.1～0.2PNA单位，优选的规格为0.15PNA单位/支(瓶)。
PNA的定义为在37℃，pH8.0的条件下，1分钟水解底物Val-Leu-Arg-PNA释放1μmol游离PNA，即为1PNA单位。
对本发明所进行的药效学研究表明，以人尿激肽原酶作预防处理对于AA(花生四烯酸)引起的脑梗塞，具有缩小梗塞面积、抑制MDA(丙二醛)生成、减少细胞LDH(乳酸脱氢酶)漏出等效应；脑缺血/再灌注损伤恢复期，连续应用人尿激肽原酶治疗可以减轻脑水肿，增加组织ATP(三磷酸腺苷)贮备，对脑细胞具有一定保护作用。
(四)本发明的有益效果针对本发明所进行的药效学研究表明，本发明对治疗和预防脑缺血、脑梗塞可以取得意想不到的有益效果，记载动物实验结果如下。
实验1 人尿激肽原酶对家兔急性脑缺血/再灌注损伤恢复期的治疗作用实验方法取1.8～2.2kg雄性大耳白兔，术前禁食过夜，自由饮水。背部固定，制备急性脑缺血/再灌注损伤模型。静注戊巴比妥钠(30mg/kg)并配合局麻(1％普鲁卡因3～5ml)，手术。静脉注射肝素(1000u/kg)抗凝血。右股动脉插管进入腹主动脉，插管通过三通针头分别连接换能器，接生理多导仪以监测血压和贮血器(高度40mmHg，即54.4cmH2O柱)。分离双侧颈总动脉，穿线备用。术后稳定30分钟。开启三通针头向贮血器快速放血约1～2分钟，达40mmHg，同时用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，持续10分钟后，迅速松解双侧动脉夹，同时加压约350mmHg将贮血器内血液推注回体内(约2分钟)，同时吸氧，观察30分钟。然后耳缘静脉滴注下述不同药物，容量约为2.5ml/kg，维持滴注30分钟，去除动脉插管，并缝合切口，单独饲喂，以后按下述分组每天一次静脉滴注不同剂量人尿激肽原酶或对照品，连续三天。
实验分组(每组n＝6)1.缺血对照组(I/R)生理盐水2.人尿激肽原酶I组2×10-3PNA/kg3.人尿激肽原酶I/II组5×10-3PNA/kg4.人尿激肽原酶II组10×10-3PNA/kg5.PGE1组PGE1300ug/kg另取4只动物，不作任何特殊处理，作为正常对照组。
观察指标1.持续用药3天，停药24小时后，第4日从颈内静脉取血2ml(抗凝)，在生化自动分析仪上测定LDH和CPK活性。然后心内注射10％KCl快速处死动物。
2.摘取全脑，取左半球前半部称湿重，90℃烘干，彻底烘干后测干重，计算水含量。脑水含量＝(湿重-干重)/湿重×100％。然后用干标本，酸消化后测Na+、Ca2+含量(原子吸收分光光度仪测定)。左半球后半部迅速放入-196℃液氮冰冻测MDA(硫代巴比妥酸法)、cAMP(环磷腺苷)和cGMP(环磷鸟苷)。取右半球前半部液氮冰冻测ATP(HPLC法)。后半部立即放入10％福尔马林液固定，切片，H-E染色，光镜检查。试验结果以均数±标准差(X±SD)表示，方差分析组间q检验作统计学处理。
实验结果1.脑组织水和钠含量的改变缺血对照组与正常对照组比较，脑组织水含量、钠含量明显增加，中剂量和大剂量人尿激肽原酶组脑组织水含量降低(与缺血对照组比较分别为p＜0.05和p＜0.01)。小剂量人尿激肽原酶组和PGE1组脑组织水含量与缺血对照组无明显差异。治疗各组脑组织钠含量虽略低于缺血对照组，但无统计学意义(P＞0.05)。
2.脑组织ATP和环核苷酸含量的改变脑缺血后，脑组织ATP含量较正常动物降低32％(p＜0.01)。人尿激肽原酶不同剂量组ATP含量较对照组分别增加11.9％(p＞0.05)、23.6％(p＜0.05)和18.8％(p＜0.05)；cAmp含量分别降低11.2％(p＞0.05)、26.5％(p＜0.01)和32％(p＜0.01)；然而cGmp含量分别增加2倍、3倍和4倍。PGE1组ATP含量增加17.3％(p＜0.05)；cAmp含量降低9.3％，cGmp含量增加22.5％，但均无统计学意义(p＞0.05)。
3.脑静脉血酶活性改变；脑缺血对照组脑静脉血LDH、CPK活性增加76.7％和226％.大剂量人尿激肽原酶治疗后，LDH活性降低21％(p＜0.05)。其他各治疗组LDH活性与缺血对照组比较无统计学差异。人尿激肽原酶各剂量组CPK活性较缺血对照组降低1.4％、7.9％和10.6％，但无统计学意义(p＞0.05)。PGE1组CPK活性较缺血对照组降低17％(p＜0.01)。
4.脑组织钙与脂质过氧化物含量改变脑组织缺血后，脑组织脂质过氧化终产物MDA和组织钙含量分别增加62％和147％。各治疗组脑组织MDA和钙含量与缺血对照组比较虽有降低，但无统计学意义。
5.形态学改变Nissl染色鼠脑切片，细胞排列可分六层，I层(分子层)少量神经细胞排列，各组之间没有差异。II层(外粒层)缺血/再灌注组无法分清II层，PGE1组II层与III层分界不清，人尿激肽原I组和人尿激肽原酶II组II层较明显，约占皮质1/10厚。III层(外锥体层)缺血/再灌注组该层不明显，PGE1组较薄，有锥体细胞。人尿激肽原I组和人尿激肽原酶II组较厚，有锥体细胞。IV层(内粒层)各组之间无明显差异。V层(内锥层)厚约占皮质1/5，有大锥体细胞，各组之间无差异。VI层(多型层)各组之间无差异。
讨论本实验通过兔双侧颈总动脉夹闭合并失血性低血压，低压、低灌流，成功地复制了急性脑缺血动物模型，观察手术后第3天的损伤表现，发现脑组织水、钠含量增加，ATP贮备量减少，环核苷酸含量增加，脑静脉血LDH及CPK活性显著升高，脑组织脂质过氧化物和钙含量增加。形态学检查发现大脑皮层第II层和第III层不明显，无法分清。
脑组织水含量增加是反映脑水肿的重要指征。脑组织损伤后脑细胞Na+水潴留。因此，一般认为水肿后脑组织Na+增加，K+减少。脑组织缺血缺氧引起细胞膜脂质过氧化，细胞膜通透性增加，使胞内酶漏出。因此，脑细胞LDH和CPK入血增多，脑静脉血LDH和CPK活性增加。
本实验观察到，人尿激肽原酶对脑缺血再灌注损伤恢复过程有一定疗效。上述观察指标有不同程度的改善，尤其是高剂量组减轻脑组织水肿，增加了脑组织ATP含量，降低静脉血中LDH活性。人尿激肽原酶对脑组织脂质过氧化虽有改善，但无统计学意义。PGE1具有扩张血管的作用，增加了脑组织能量ATP贮备，降低脑静脉血CPK活性，其他指标无明显改善。因而推测激肽释放酶人尿激肽原酶不仅通过其扩张血管的作用发挥疗效，而且可能通过于肾素-血管紧张素系统相互作用发挥其抗兔脑缺血/再灌注损伤恢复过程的损伤作用。
结论脑缺血/再灌注损伤恢复期，连续应用人尿激肽原酶治疗可以减轻脑水肿，增加组织ATP贮备，对脑细胞具有一定保护作用。
实验2 人尿激肽原酶对家兔脑缺血再灌注损伤的影响实验方法取1.8--2.2kg雌性大耳白兔，术前禁食过夜，自由饮水。背部固定，3％氯烷加97％氮再加3％氧麻醉，灯光保温(室温25℃)。气管插管人工呼吸机控制呼吸，1000u/kg肝素静脉注射抗凝血。右股动脉插管进入腹主动脉，插管通过三通针头分别连换能器，接生理多导仪以监测血压，连接贮血器(高度40mmHg，即54.4cm H2O柱)，右股静脉插管以输药物。分离双侧颈总动脉穿线备用。术后稳定30分钟，开启三通针头向贮血器快速放血(约1～2分钟，达40mmHg BP)，同时用动脉夹夹闭双颈总动脉。持续10分钟后，迅速松解双侧动脉夹，同时加压(约300mmHg)将贮血器内血液推注回体内(约2分钟)，同时吸氧，再观察30分钟结束实验。
实验分组(每组n＝10)实验动物分为以下四组，分别于脑缺血前10分钟开始滴注不同剂量人尿激肽原酶或对照品(容量2.5ml/kg PBS)，维持灌注30分钟，于滴注完毕后10分钟结束实验。
1.缺血对照组用单纯PBS2.人尿激肽原酶I组2.0×10-3PNA/kg3.人尿激肽原酶II组10.0×10-3PNA/kg4.Nicardipine组10ug/kg另取4只动物，仅作麻醉和不缺血的假手术处理，称为“5.sham组”。
观察指标1.动物死亡数；2.脑缺血前和再灌注30分钟时血压；3.结束实验时动脉插管放血，取血样，离心分离血浆，测定血糖、乳酸盐、LDH活性、MDA含量。
4.摘取全脑，取左半球迅速置液氮冷冻，前一半用液氮研磨，6％三氯乙酸下制备匀浆，测定组织ATP含量。右半球前半部称湿重，90℃烘干，彻底干燥后测干重，计算组织/干重比值，反映脑水肿程度。大脑右半球后一半组织用PBS制备匀浆(1∶10W/V)，用硫代巴比妥酸测定组织MDA含量。
实验结果脑缺血10分钟/再灌注30分钟期间内，各组动物死亡率为缺血对照组4/10、人尿激肽原酶I组4/10、人尿激肽原酶II组3/10、Nicardipine组3/10、假手术组0/4。脑I/R损伤，动物出现血糖增加，血浆MDA含量和LDH活性都增加。缺血对照组与假手术组比较，上述指标分别增加46.46％、211.45％、60.79％和397.13％(P值都小于0.01)。治疗各组的上述指标都呈不同程度改善，但与缺血对照组比较，血糖仅Nicardipine组降低，有统计学意义(P＜0.001)。血浆乳酸盐降低在各组表现为，人尿激肽原酶II组和Nicardipine组与缺血对照组间差异均有显著性(P＜0.01)，人尿激肽原酶II组较人尿激肽原酶I组明显(P＜0.01)。血浆MDA含量和LDH活性各治疗组比缺血对照虽略低，但无统计学意义(P＞0.05)。
脑缺血/再灌注损伤(缺血对照组与假手术组比较)，脑组织ATP含量减少(-74.71％，P＜0.01)，脑组织水肿(湿重/干重比值增加36.71％，P＜0.01)和脑MDA生成增加(+52.83％，P＜0.01)。各治疗组呈不同程度改善(各组均显著)，减轻脑ATP含量的降低(P＜0.01)，人尿激肽原酶II组优于人尿激肽原酶I组(P＜0.01)，湿重/干重比值各组较缺血对照组都略有降低，但无统计学意义(P＞0.05)。
抑制脑MDA的生成，人尿激肽原酶II组较缺血对照组、人尿激肽原酶I组和Nicardipine组作用更强(P＜0.05)。抑制脑组织MDA生成，仅人尿激肽原酶II组与缺血对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，人尿激肽原酶II组与人尿激肽原酶I组和Nicardipine组间差异也有显著性(P＜0.05)。
结论人尿激肽原没对减轻家兔脑缺血/再灌注损伤有一定疗效，表现为减轻血浆乳酸盐水平的增加，保持脑组织ATP贮备，减轻脑组织脂质过氧化程度。
实验3 人尿激肽原酶对家兔脑梗塞的影响实验方法动物选择和术前处理、麻醉方法、呼吸控制均与实验2同。分离左颈总动脉，从颈外动脉插管抵近颈内动脉分叉，动脉夹夹闭颈总动脉，从插管快速推注花生四烯酸(AA)0.5mg/kg(容量0.05ml/kg)，从颈内动脉入脑循环，然后去除动脉夹，上述操作5秒内完成(给药摘夹)。注入AA后15分钟，开胸，左心房插管10mmHg压力下灌注温生理盐水(37℃)20ml，随之印度ink5.0ml(灌注时于近腹主动脉下动脉夹)。断头，取脑，固定于10％甲醛内横切成5片，切面照像，经计算机图像处理，计算梗塞区面积(白色区/[黑色区十白色区])。AA注射前和注射后15分钟(开胸前)，分别从动脉插管收集血样，测定MDA含量和LDH活力。实验分为6组，分别于制作脑梗塞模型前30分钟耳缘静脉滴注下述不同剂量药物(容量为2.5ml/kgPBS)。滴注完毕后，立即制作模型。
实验分组(每组n＝10)
1.梗塞组单纯PBS2.人尿激肽原酶I组2.0×10-3PNA/kg3.人尿激肽原酶I/II组5.0×10-3PNA/kg4.人尿激肽原酶II组10.0×10-3PNA/kg5.PGE1(前列腺素)组300ug/kg6.口服组术前2小时口服剂灌胃一次56u/kg实验结果梗塞面积本实验经颈内动脉注射花生四烯酸后引起脑内广泛梗塞，梗塞组脑梗塞区占全脑面积的三分之一。治疗各组防治性给药，都能使模型缩小梗塞面积(与梗塞组比较，均为p＜0.01)。效果强弱顺序为人尿激肽原酶II组、人尿激肽原酶I/II组、PGE1组、口服组和人尿激肽原酶I组。人尿激肽原酶II组脑梗塞面积仅为梗塞组梗塞面积的39.72％，其减少梗塞面积的效果明显强于其他各治疗组。
血浆MDA含量AA引起梗塞的机理包括刺激血管痉挛、损伤血管内皮、促进血小板活化聚集等多种机制。其中AA促进脂质过氧化，测定终产物MDA含量，梗塞组较假手术组增加约2.4倍(p＜0.01)。治疗各组，除口服组无明显作用外(p＞0.05)，人尿激肽原酶I组、人尿激肽原酶II组、人尿激肽原酶I/II组和PGE1组都明显抑制MDA生成，血浆MDA含量较梗塞组分别低-21.97％，-40.81％，-38.12％和-30.94％(p均＜0.01)。人尿激肽原酶I/II组、人尿激肽原酶II组和PGE1组较口服组差异亦显著。
血浆LDH活性梗塞组织细胞缺血损伤，胞浆内酶LDH漏出释放进入血循环。梗塞组血浆LDH活性较假手术组增加约3倍(p＜0.01)。口服组血浆LDH活性虽略低于梗塞组，但差异无统计学意义(p＞0.05)；人尿激肽原酶I组、人尿激肽原酶II组、人尿激肽原酶I/II组和PGE1组较梗塞组血浆LDH活性分别低-14.745％(p＜0.05)、-15.77％(p＜0.05)、-24.23％(p＜0.01)和-23.65％(p＜0.01)。人尿激肽原酶II组与口服组间差异也显著(p＜0.05)。
结论人尿激肽原酶预防处理对于AA引起的脑梗塞，具有缩小梗塞面积、抑制MDA生成、减少细胞LDH漏出等效应，PGE1亦有相似效应。本实验未观察到口服剂的作用。
实验4 人尿激肽原酶对大鼠局灶性脑缺血的影响(实验研究)实验方法取雄性大鼠，腹腔注射水合三氯乙醛350mg/kg麻醉，右侧位固定。手术暴露颧弓，用咬骨钳咬去颧弓，剪断筋膜，暴露聂前窝，用小牵张器将磷状骨和下颔骨间距撑开，于颅骨底开一2cm×2cm颅窗，撕开硬脑膜，暴露大脑中动脉，用高频电刀烧断，以阻断血流，造成局部脑缺血，逐层缝合切口。30分钟后进行舌下静脉给药，回笼饲养。室温严格控制在24～25℃。24小时后对动物进行神经症状评分，断头取脑，测定脑含水量。
另取雄性大鼠，分组及给药同前，在阻断一侧大脑中动脉后24小时，断头取脑，参照文献方法测定脑梗塞面积。
试验分组(每组n＝10)1.假手术组舌下静脉注射生理盐水2.中脑动脉阻断组静脉注射生理盐水3～5.中脑动脉阻断+静脉注射人尿激肽原酶17.5PNA×10-3/kg静脉注射组8.75PNA×10-3/kg静脉注射组3.5PNA×10-3/kg静脉注射组6.中脑动脉阻断+静脉注射尼莫地平0.5mg/kg组观察指标脑梗塞面积测定将剥离完整的大脑放入4℃冰箱内盛有生理盐水的小杯中，10分钟后去嗅球、小脑及低位脑干，沿冠状面切为五片，立即放入红四氮唑(TTC)染色液中，避光在37℃水浴中温孵30分钟。取出脑片放入10％福尔马林中固定。正常组织为玫瑰红色；缺血组织呈白色。用重量求积法测量缺血面积，计算缺血区域占全脑面积的百分比。
神经症状评分判断方法和标准(1)提起鼠尾，正常鼠两前肢向前伸直并且对称。手术鼠，缺血脑半球对侧的前肢肩内旋和内收，观察其程度不同评为0～4分。
(2)牵拉两肢，正常大鼠肌力对称，手术后脑缺血半球的对侧前肢肌无力，观察其程度不同评为0～3分。
(3)推两肩，正常大鼠双侧肩阻力对称，手术后脑缺血半球的对侧肩阻力下降；观察其程度不同评为0～3分。
按以上标准，满分为10分。分数越高，说明脑功能障碍越严重。
脑水份含量的测定于中脑动脉阻断后24小时处死鼠，取出全脑。将剥离完整的大脑去小脑及低位脑干后称重(湿重)，后置箱中120℃约18小时烤至恒重，再称重(干重)。脑水份含量＝(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100％；t检验法。
实验结果给药组在中脑动脉阻断后30分钟静脉注射人尿激肽原酶，可减轻因大鼠中脑动脉阻断引起的脑缺血、脑水肿及神经行为症状，并有剂量效应关系；阳性对照组(尼莫地平)也有很好的治疗作用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1提取并纯化人尿激肽原酶将新鲜男性尿液用1万Da的超滤膜对水超滤至电导不高于0.05MNa2HPO4-NaH2PO4，0.1M NaCl，pH7.4的缓冲液。
DEAE-Sepharose柱经0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，0.1M NaCl，pH7.4的缓冲液平衡。将浓缩尿液上DEAE-Sepharose柱，用平衡缓冲液冲洗，用0.05MNa2HPO4-NaH2PO4，0.3M NaCl，pH7.4的缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
Aprotinin-Sepharose柱经0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH8.0的平衡缓冲液平衡，将DEAE-Sepharose柱洗脱峰调pH8.0后上Aprotinin-Sepharose柱，用平衡缓冲液冲洗，用0.1M HAc-NaAc，pH4.0的缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
Aprotinin-Sepharose柱洗脱峰对0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，0.1M NaCl，pH7.0的缓冲液透析8小时，恒温水浴60℃加热10小时，超滤浓缩。
Sephadex G-100柱经生理盐水平衡，将60℃10小时加热过的人尿激肽原酶溶液上Sephadex G-100柱，生理盐水洗脱，收集洗脱峰。
洗脱峰经0.22um膜过滤除菌，超滤浓缩成为人尿激肽原酶精制品。
实施例2 制备供静脉注射用的人尿激肽原酶冻干粉针取人尿激肽原酶150PNA、甘氨酸(药用)5克、甘露醇(药用)7.5克，加0.02M磷酸盐缓冲溶液pH7.0至1升，搅匀后分装1000支安瓶中。经冻干熔封、除菌过滤，制得人尿激肽原酶冻干粉针。
实施例3 制备人尿激肽原酶水针取150PNA的人尿激肽原酶精制品，加注射用水到1000ml，调pH到6.8，搅匀并除菌过滤，分装1000支安瓶中，熔封，制得人尿激肽原酶水针。
实施例4 制备人尿激肽原酶输液制剂取150PNA的人尿激肽原酶精制品，加生理盐水到250000ml，调pH到6.8，搅匀并除菌过滤，分装1000支输液瓶中，加盖，制得人尿激肽原酶输液。
说明书中涉及若干英文缩写，注解如下I/R急性脑缺血/再灌注损伤 PBS磷酸盐缓冲溶液 MDA丙二醛LDH乳酸脱氢酶 ATP三磷酸腺苷 CPK肌苷激酶PGE1前列腺素 cAMP环磷腺苷 cGMP环磷鸟苷AA花生四烯酸 HPLC高效液相色谱
权利要求
1.一种药剂，用于治疗和预防脑梗塞，该药剂包含人尿激肽原酶作为活性成分，激肽原酶是天然存在于人尿中的一种糖蛋白，分子量约为54,000道尔顿(凝胶过滤法)，由238个氨基酸残基组成一条单链，N-末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，分子中含有5对S-S键，分别为Cys7-Cys150，Cys26-Cys42，Cys29-Cys196，Cys161-Cys175以及Cys186-Cys211，等电点约为4.0，分子中含有14.4％的糖，结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asn141，其糖的组成为甘露糖3％，半乳糖1.7％，岩藻糖0.8％，N-乙酰葡糖胺5.0％，一级结构(氨基酸组成序列)如下式
2.根据权利要求1所述的应用人尿激肽原酶制备治疗和预防脑梗塞药物的方法，其特征在于，配以一种或多种制药可接受的载体。
3.权利要求2所述的制药可接受的载体为甘氨酸、甘露醇、pH7.0磷酸盐缓冲溶液组合。
4.权利要求2和3所定义的药物组合物的制剂形式为粉针。
5.权利要求2和3所定义的药物组合物的制剂形式为水针。
6.权利要求2和3所定义的药物组合物的制剂形式为输液。
7.权利要求4、5、6所述的药物制剂，将PNA定义为“在37℃、pH8.0条件下，1分钟水解底物Val-Leu-Arg-PNA释放1umol游离PNA为1PNA单位”，粉针或水针或输液制剂的规格为0.1～0.2PNA单位/支(瓶)。
全文摘要
本发明公开了人尿激肽原酶在制药工程中的一种新用途。其实施方法为，以人尿激肽原酶作为活性成分制备可作注射用的药剂，用于预防和治疗和预防脑梗塞。
文档编号A61P9/00GK1403156SQ0211678
公开日2003年3月19日 申请日期2002年5月13日 优先权日2002年5月13日
发明者傅和亮, 巫锦娣, 王晓岩, 谢永立 申请人:广东天普生化医药股份有限公司