专利名称：人尿激肽原酶在制备肺动脉高压症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域。具体而言，本发明涉及人尿激肽原酶的新医药用途，即人尿激肽原酶在制备治疗和/或预防肺动脉高压症药物中的应用。
背景技术：
肺动脉高压症(Pulmonary Artery Hypertension，PAH)是指肺动脉平均压在静息时高于2.67kPa(20mmHg)或在运动时高于4.00kPa(30mmHg)。但出生后2周的新生儿，正常肺动脉压力可比上述数值高些。广义来讲，肺动脉高压不仅仅指肺动脉压力的升高，无论肺动脉压超过正常，还是动静脉压差升高，或是肺血管阻力超出正常范围均可提示肺动脉高压。肺动脉高压包括特发性肺高压、继发性肺高压、肺静脉闭塞性疾病三种情况。①特发性肺高压可能由于以下几种原因所致先天性肺小动脉发育不全、多因素肺血管挛缩、反复发作的肺小动脉血栓栓塞、自身免疫、多发性肺栓塞、家族性肺高压等。②继发性肺高压可由于以下几种原因所致心脏疾病，梗阻性气道疾病、肺实质疾病、肺血管疾病、神经肌肉疾病等呼吸疾病。③肺静脉闭塞性疾病可由以下几种原因所致占位性病变、结核、类肉瘤病、纤维化纵隔炎等。
低氧性肺动脉高压是婴幼儿肺炎、慢性肺源性心脏病、呼吸窘迫综合征等多种疾病发生、发展的重要病理生理环节。各种原因所致肺泡缺氧均会引起肺血管的收缩反应，增加肺循环阻力，从而导致严重的肺动脉高压。慢性缺氧时，肺小动脉长期处于收缩状态，可引起肺血管中膜平滑肌肥大，血管硬化，形成稳定的肺动脉高压。缺氧所致红细胞增多，血液粘度增高以及肺循环内微血栓的形成，也可增加肺循环阻力。肺动脉高压可增加右心室射血的阻力，导致右心室肥大，甚至心力衰竭。
人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)，是从健康男性人尿中提取精制的糖蛋白，分子量约54000道尔顿，具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血液粘稠的作用。本申请人的在先专利申请“02116783.4人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用”公开了它的一种医药用途。还有关于人尿激肽原酶用于改善下肢循环的临床研究报道。本发明人经过认真研究和动物试验证明，人尿激肽原酶对肺动脉高压有明显的治疗和/或预防作用。
发明内容
本发明的目的是提供人尿激肽原酶用于治疗和/或预防肺动脉高压症的用途，即用于制备治疗和/或预防肺动脉高压的药物的用途。本发明的另一目的是提供一种用于治疗和/或预防肺动脉高压的含有人尿激肽原酶的药物组合物。
本发明的人尿激肽原酶对肺动脉高压有明显的治疗作用，也有明显的预防作用，一般以药物组合物的形式使用。这种组合物含有治疗有效量的作为活性成分的人尿激肽原酶和可药用辅料，主要剂型包括冻干粉针剂和注射液剂，通常以静脉注射途径给药。
经静脉注射给药的人尿激肽原酶组合物，一般是固体的灭菌组合物形式。这些组合物还可以含有添加剂，特别是甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸等。在使用时溶解于灭菌注射用水或其它注射用灭菌介质中。
经静脉注射给药的人尿激肽原酶组合物也可以是水溶液形式。组合物还可以含有添加剂，特别是甘露醇、氯化钠、葡萄糖等。
人尿激肽原酶组合物治疗和/或预防肺动脉高压症的剂量根据病情的严重程度、治疗时间而定，一般静脉注射给药每次0.1-0.2PNA单位，每天1-2次。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1制备人尿激肽原酶干粉针取过滤灭菌的人尿激肽原酶150PNA单位，加7.5克甘露醇、2克右旋糖酐40、5克柠檬酸钠溶解，调节PH至中性，加注射用水至500毫升，无菌过滤，分装1000个安瓿中，无菌条件下冷冻干燥，即得。
实施例2制备人尿激肽原酶注射液取过滤灭菌的人尿激肽原酶水溶150PNA单位，调节PH至中性，加注射用水至500毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装1000个安瓿中，即得。
实施例3人尿激肽原酶对犬急性缺氧性肺动脉高压的作用实验方法选择体重10～16kg普通杂种犬，麻醉用3％戊巴比妥钠首次于腹腔内注射(30mg/kg)，试验中再间断小剂量静脉注射予以维持。犬麻醉后行气管插管，接呼吸机，并从右颈外静脉置入热稀释法漂浮导管(Gould，5F)，待达肺动脉后与压力监护仪及记录仪相接；再分别于右股动静脉留置导管并连接压力监护仪或静脉持续输注生理盐水(100ml/h)。采用热稀释法每次注射生理盐水5ml测定心输出量(CO，L/min)。
完成上述动物准备后，先记录以空气通气时的动脉血气及各项血流动力学指标作为基础对照，然后将吸入氧浓度调为10％，通气10min，在第10min时重复上述测定作为缺氧对照，并从股动脉及肺动脉分别取血4ml(内加EDTA-Na24mg)备测。此后停止缺氧，将吸入氧浓度调至21％，待各项血流动力学和血气指标恢复到基础状态后，从右心房注入药物，在注射后即刻、20min时再分别进行缺氧试验10min，每次缺氧试验均与首次相同并取血备测。血样中血管活性物质如血管紧张素II(AT II)血栓素TXA2及前列环素PGI2(测定其稳定代谢产物TXB2和6-Keto-PGF1a)的测定采用放射免疫药盒。用自动γ计数仪和自动液闪仪检测。
各指标进行组间和自身前后比较，用t检验判断其差异显著性。
实验分组普通杂种犬20只，雌雄兼用，随机分为5组，每组4只。
1.模型对照组2.L-精氨酸组，3.5g/kg3.人尿激肽原酶I组，人尿激肽原酶1.5×10-3PNAu4.人尿激肽原酶II组，人尿激肽原酶3×10-3PNAu5.人尿激肽原酶III组，人尿激肽原酶6×10-3PNAu实验结果模型对照组动物在缺氧10min后，肺动脉平均压(mPAP)、股动脉平均压(mBP)肺血管阻力(PVR)、全身血管阻力(SVR)等均较缺氧前明显升高(P＜0.01)。L-精氨酸可显著降低犬急性缺氧时的mPAP和mBP。用药后10和30min，其mPAP分别下降0.61±0.19或0.65±0.24kPa；而mBP于用药后30min下降1.85±0.51，两项指标与用药前及对照组比较均有显著差异(P＜0.05)。PVR及SVR虽较用药前有所降低，但无统计学意义。L-精氨酸对犬急性缺氧时的心输出量(CO)无明显影响。
人尿激肽原酶I、II、III组均能明显降低缺氧动物mPAP和mBP水平，与缺氧前及对照组比较，用药后10和30min均有显著差异(P＜0.05)，且效应呈剂量依赖性。人尿激肽原酶II、III组用药后10和30min还能降低PVR和SVR，与缺血前比较也有统计学意义(P＜0.05)，心输出量(CO)稍有降低，但无统计学意义(P＞0.05)。
模型对照组缺氧前动脉血AT II含量(ng/L)为72.5±6.9，缺氧10min后升高为183.6±31.5；缺氧后TXB2含量也显著上升，而前列环素稳定代谢产物6-Keto-PGF1a含量却降低，与缺氧前比较均有显著差异(P＜0.05)。L-精氨酸治疗组AT II含量和TXB2含量与模型对照组比较均有降低，但无统计学意义(P＞0.05)；6-Keto-PGF1a含量与模型对照组比较则有显著差异(P＜0.05)。
人尿激肽原酶I、II、III组用药后10和30min均能降低缺氧动物AT II含量和TXB2含量，但仅人尿激肽原酶III组与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05)。人尿激肽原酶的三个剂量用药后10和30min均能有效升高6-Keto-PGF1a含量，与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05)。结果表明，人尿激肽原酶能降低缺氧后TXA2/PGI2比值，舒张收缩的肺动脉血管。
结论本实验结果表明，L-精氨酸和人尿激肽原酶可显著降低麻醉犬急性缺氧时的肺动脉平均压，提示NO参与调节整体动物的急性缺氧加压反应，NO的产生增多可抑制HPV。人尿激肽原酶能促进肺部NO的生成，因此能降低肺血管张力，降低肺动脉压。人尿激肽原酶对急性缺氧性肺动脉高压具有良好的治疗作用。
实施例4人尿激肽原酶对大鼠慢性间断低氧性肺动脉高压的作用实验方法应用低氧舱建立缺氧环境。向舱内充氮气，并调节氮气流量和伴流空气流量，使舱内氧浓度保持在10±0.5％，舱内气压与大气压相等。将除正常对照组外的其它各组大鼠置于常压低氧舱内，每天持续缺氧8h，每周6天，共5周。各用药组大鼠每天进舱前尾静脉注射相应药物。正常对照组置于同一室的空气中。
5周后行各项指标的测定，称量动物后，用10％乌拉坦(10ml/kg)麻醉大鼠，分离大鼠颈外静脉，行肺动脉导管插入，经颈静脉、上腔静脉、右心房、右心室至肺动脉，通过波形确定导管前端所在位置，记录右室压肺动脉压。测压后，从肺动脉插管到达位置取血，用毛细管离心法测血红细胞压积(HCT)。然后开胸，摘取心脏和右肺下叶。肺叶用福尔马林固定，留作组织学检查。分离右心室、左心室和室间隔，自然干燥半小时后，称量右心室重、左心室+室间隔重。以右心室重/(左心室+室间隔重)(％)，右心室重/体重(mg/100g)来反映右心室重量的变化。
将经福尔马林固定的肺叶脱水固定包埋切片(4μm厚度)，并以Gomori弹力纤维加Mayer-esin复染，制片后进行组织学观察。随机观察25条具备下述3个条件的肺小动脉a.直径30-100μm(平均58μm)；b.弹力纤维膜完整；c.位置靠近肺腺泡。并记录其中含有肌层的肺小动脉数量。
各指标进行组间和自身前后比较，计量资料用t检验，计数资料用X2检验，进行统计学分析。
实验分组每组8只大鼠，体重150-200g，雌雄兼用。
1.正常对照组2.低氧对照组3.尼群地平组，8mg/kg4.人尿激肽原酶I组，人尿激肽原酶3.85×10-3PNAu5.人尿激肽原酶II组，人尿激肽原酶8.75×10-3PNAu6.人尿激肽原酶III组，人尿激肽原酶17.5×10-3PNAu实验结果低氧环境的各组大鼠在5周中共死亡13只，而在室内空气中饲养的正常对照组无一死亡，且其体重增加(116.9±26.8g)明显高于低氧对照组(87.2±31.3g)、尼群地平组(86.9±25.4g)及人尿激肽原酶I II III组(P＜0.05)，而低氧的各组大鼠间体重增加无显著差异(P＞0.05)。
慢性缺氧后，右心室压和肺动脉压与正常对照组比较显著升高(P＜0.05)。尼群地平治疗组的右心室压和肺动脉压均较低氧对照组显著降低(P＜0.05)。人尿激肽原酶I II III组能明显降低缺氧动物右心室压和肺动脉压，与低氧组比较，均有显著差异(P＜0.05)，且效应呈剂量依赖性。
慢性缺氧后，右心室重/体重右心室重/(左心室+室间隔重)(％)显著升高，与正常对照组大鼠比较，有统计学意义(P＜0.05)。各用药组均能减轻缺氧引起的右室肥大(P＜0.05)，其中以人尿激肽原酶III组抑制缺氧性右室肥大的作用最显著，与低氧组比较有显著差异(P＜0.01)。
各低氧组的血红细胞压积(HCT)均较正常组显著升高(P＜0.01)。但用药组与低氧对照组比较无显著差异(P＞0.05)。
慢性间断低氧后，低氧对照组肺叶中含肌肺小动脉数量与正常组比较显著增多(P＜0.01)。与低氧组比较，各用药组均能显著抑制肺小动脉的肌化(P＜0.05)。
讨论大量实验证实，大鼠猪和人在慢性间断缺氧的情况下，均可发生肺动脉高压和右心室肥大。有研究发现，慢性缺氧大鼠的肺动脉平滑肌细胞中Ca2+浓度升高，增加灌流液中的Ca2+浓度也能增加缺氧大鼠的肺血管收缩反应(HPV)，因此认为钙离子拮抗剂对抗HPV有良好作用。
Rodman等发现美蓝能增强缺氧引起的具有完整内皮的大鼠肺动脉段的收缩，而美蓝是通过阻断内皮依赖性血管舒张因子(NO)而发挥药理作用的，这就间接提示EDRF可能参与肺血管张力调节。人尿激肽原酶能促进缓激肽的生成，进而促进肺血管内皮细胞释放NO，引起一系列生物学效应，其中包括扩张血管和降低细胞内Ca2+浓度。
低氧引起肺血管收缩是肺内维持最适通气/血流比值的一个重要调节代偿机制。Nagasaka用胸膜下血管微穿刺术，证明缺氧性肺血管收缩的主要部位在30-40μm的肺小动脉。缺氧可刺激生长因子产生从而促进内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，使正常时的部分非肌性动脉发生肌化，变成肌性动脉，使得肌性动脉的数量明显增多。所以慢性缺氧数天后，即发现肺泡区非肌性血管的肌化增加。肺泡内动脉中膜的增厚和血管的肌化、血管腔变窄是肺动脉高压形成的重要形态基础。本实验以计算符合三个条件的含肌肺小动脉数量来反映肺小动脉肌化情况，发现尼群地平和人尿激肽原酶均能抑制低氧时肺小动脉的肌化。
结论人尿激肽原酶能有效预防慢性间断低氧引起的肺动脉高压。
权利要求
1.人尿激肽原酶在制备治疗和/或预防肺动脉高压症药物中的用途。
2.权利要求1所述的肺动脉高压症为急性缺氧引起的肺动脉高压症。
3.权利要求1所述的肺动脉高压症为慢性间断低氧引起的肺动脉高压症。
4.一种用于治疗和/或预防肺动脉高压症的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的人尿激肽原酶和可药用辅料。
5.权利要求4所述的药物组合物是冻干粉针剂。
6.权利要求4所述的药物组合物是水溶液注射剂。
全文摘要
本发明涉及人尿激肽原酶用于制备治疗肺动脉高压症的药物用途及按该方法制备的药物组合物。本发明的人尿激肽原酶对肺动脉高压症有明显的治疗作用，通常以药物组合物配制成冻干粉针剂或注射液剂的形式使用。
文档编号A61K38/49GK1706493SQ200410088439
公开日2005年12月14日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者傅和亮, 孙铁, 苗丕渠, 王晓岩 申请人:广东天普生化医药股份有限公司