专利名称：胰激肽释放酶的一种制取方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及ー种胰激肽释放酶的制备方法，具体地说涉及采用磁性亲和分离技术制备高纯度胰激肽释放酶。
背景技术：
1909年Abelous等首次报道静脉注射人尿液可引起狗的血压短暂下降，发现尿中存在降压物质。后来发现它也存在于唾液、血浆及胰腺中，尤其后者含量为最高，1930年被命名为激肽释放酶(Kallikrein)。胰激肽释放酶可以从哺乳动物胰腺、胰酶粉及胰激肽释放酶粗品中提取纯化而得。经过多年发展，胰激肽释放酶提取纯化方法很多，常见的有硫酸铵沉淀法、离子交换层析法、有机溶剂分级、亲和层析法等，但硫酸铵沉淀法溶剂用量大、产品纯度低；离子交换树脂吸附过程复杂、收率低；有机溶剂分级由于要耗用大量有机溶剤，成本高，效益低。
目前，国际上基于胰激肽释放酶的纯化研究大多采用阴离子交換(通常为DEAE配基)结合阳离子交換(通常为CM配基)，最后加一歩凝胶过滤层析，并且离子交换过程中胰激肽释放酶洗脱都采用改变pH的方式。由于缓冲液的缓冲作用，使柱内pH改变缓慢，周期延长，耗费大量缓冲液。国内众多科技人员也对胰激肽释放酶进行了研究，在传统エ艺上做了很多改迸，包括DEAE-纤维素吸附エ艺、盐析与疏水色谱相结合エ艺、胰激肽原酶、弾性酶和糜胰蛋白酶的联产エ艺等，在胰激肽释放酶的产品质量和提取率上有很大提高，但总体エ艺仍较落后。因此，研究开发出一条エ艺简单、成本低、效率高的从胰脏中提取胰激肽释放酶的エ艺不仅充分利用胰脏资源，且胰激肽释放酶具有多种生理功能，能创造巨大的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种胰激肽释放酶的制备方法，以畜禽胰腺为原料，采用磁性亲和分离技术，エ艺简单，产品酶活可达1100U/mg以上。磁性亲和分离技术是将亲和色谱的高选择性、高回收率的特点与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新的分离技术，可以直接处理浑浊液，现已在蛋白质的分离纯化、固定化酶、免疫測定、靶向药物等方面得到了广泛的应用。琼脂糖被认为几乎拥有理想基质的所有特点，是应用最广泛的亲和分离介质之一；胍基与胰激肽释放酶具有较强的亲和力；环氧氯丙烷(ECH)活化则既可在水溶液中，又可在有机溶剂中进行，操作方便；I-こ基-3-(3-ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)及其偶联后的产物都溶于水，不仅操作简单，而且酶的活性回收率和纯化倍数均较高。因此，根据磁性亲和分离技术原理及产品的特性，本发明选用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，含胍基こ酸配体的磁性亲和吸附齐U，ECH为活化剂，EDC HCl为偶联试剂，己ニ胺(DAH)为间隔臂。本发明制取胰激肽释放酶的步骤如下
I.粗胰激肽释放酶的制备称取一定量的畜禽胰腺，高速组织捣碎机处理，在pH5. 5条件下，添加2-5倍原料量的预冷的25%こ醇和3-6%原料量的CaCl2，搅拌制取粗胰激肽释放酶，搅拌速度为60 90r/min，20°C下提取2_3h，之后过滤。2.磁性亲和分离采用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基こ酸为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)为偶联试剂，己ニ胺(DAH)为间隔臂。纯化时在一定量胰激肽释放酶粗品中加入0. 02-0. 05mol/L PBS，0. 1-0. 3mol/L NaCl, 0.01-0. 03g/L Tween-80 (pH7. 2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌l_2h，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗涤3次，然后用0. lmol/L NaOAc, 0. 4mol/L NaCl，0. 01g/L Tween-80 (pH4. 0)溶液洗脱。3.超滤浓缩采用截留分子量为IOOOODa的超滤膜浓缩洗脱液。4.冷冻干燥将浓缩后的洗脱液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得优质胰激肽释放酶。
附图I是以畜禽胰腺为原料，经高速组织捣碎机处理、粗提、磁性亲和分离、超滤浓缩、冷冻干燥等エ艺步骤，得到胰激肽释放酶的エ艺流程图。
具体实施例方式提出以下实例用于说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。实施例I称取一定量的畜禽胰腺，高速组织捣碎机处理，在pH5. 5条件下，添加2倍原料量的预冷的25%こ醇和4%原料量的CaCl2，搅拌，速度为65r/min，20°C下提取2h，之后过滤。采用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基こ酸为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)为偶联试齐U，己ニ胺(DAH)为间隔臂。纯化时在一定量胰激肽释放酶粗品中加入0.02mol/L PBS,0. lmol/L NaCl,0.01g/L Tween-80 (pH7. 2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌lh，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗涤 3 次，然后用 0. lmol/L NaOAc, 0. 4mol/L NaCl，0. 01g/L Tween-80 (pH4. 0)溶液洗脱。洗脱液采用截留分子量为IOOOODa的超滤膜浓缩，浓缩液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得胰激肽释放酶的酶活为1230U/mg。实施例2称取一定量的畜禽胰腺，高速组织捣碎机处理，在pH5. 5条件下，添加2倍原料量的预冷的25%こ醇和5%原料量的CaCl2，搅拌，速度为70r/min，20°C下提取2h，之后过滤。采用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基こ酸为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)为偶联试齐U，己ニ胺(DAH)为间隔臂。纯化时在一定量胰激肽释放酶粗品中加入0.03mol/L PBS,0. lmol/L NaCl,0.01g/L Tween-80 (pH7. 2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌lh，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗涤 3 次，然后用 0. lmol/L NaOAc, 0. 4mol/L NaCl,0. 01g/L Tween-80 (pH4. 0)溶液洗脱。洗脱液采用截留分子量为IOOOODa的超滤膜浓缩，浓缩液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得胰激肽释放酶的酶活为1295U/mg。实施例3称取一定量的畜禽胰腺，高速组织捣碎机处理，在pH5. 5条件下，添加3倍原料量的预冷的25%こ醇和4%原料量的CaCl2，搅拌，速度为70r/min，20°C下提取2. 5h，之后过 滤。采用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基こ酸为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)为偶联试齐U，己ニ胺(DAH)为间隔臂。纯化时在一定量胰激肽释放酶粗品中加入0.03mol/L PBS,0. 3mol/L NaCl,0. 02g/L Tween-80 (pH7. 2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌lh，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗涤 3 次，然后用 0. lmol/L NaOAc, 0. 4mol/L NaCl,0. 01g/L Tween-80 (pH4. 0)溶液洗脱。洗脱液采用截留分子量为IOOOODa的超滤膜浓缩，浓缩液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得胰激肽释放酶的酶活为1198U/mg。实施例4称取一定量的畜禽胰腺，高速组织捣碎机处理，在pH5. 5条件下，添加4倍原料量的预冷的25%こ醇和5%原料量的CaCl2，搅拌，速度为80r/min，20°C下提取2. 5h，之后过滤。采用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基こ酸为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)为偶联试齐U，己ニ胺(DAH)为间隔臂。纯化时在一定量胰激肽释放酶粗品中加入0.02mol/L PBS,
0.lmol/L NaCl,0.01g/L Tween-80 (pH7. 2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌lh，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗涤 3 次，然后用 0. lmol/L NaOAc, 0. 4mol/L NaCl,0. 01g/L Tween-80 (pH4. 0)溶液洗脱。洗脱液采用截留分子量为IOOOODa的超滤膜浓缩，浓缩液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得胰激肽释放酶的酶活为1336U/mg。实施例5称取一定量的畜禽胰腺，高速组织捣碎机处理，在pH5. 5条件下，添加5倍原料量的预冷的25%こ醇和6%原料量的CaCl2，搅拌，速度为80r/min，20°C下提取3h，之后过滤。采用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基こ酸为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)为偶联试齐U，己ニ胺(DAH)为间隔臂。纯化时在一定量胰激肽释放酶粗品中加入0.02mol/L PBS,
0.lmol/L NaCl,0.01g/L Tween-80 (pH7. 2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌lh，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗涤 3 次，然后用 0. lmol/L NaOAc, 0. 4mol/L NaCl，0. 01g/L Tween-80 (pH4. 0)溶液洗脱。洗脱液采用截留分子量为IOOOODa的超滤膜浓缩，浓缩液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得胰激肽释放酶的酶活为1263U/mg。
权利要求
1.ー种胰激肽释放酶的制备方法，其特征在于首先畜禽胰腺经高速组织捣碎机处理，后在酸性条件下制备粗胰激肽释放酶，再过滤，磁性亲和分离，超滤浓缩，冷冻干燥，得到胰激肽释放酶产品。
2.根据权利要求I所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于畜禽包括猪、牛、羊坐寸o
3.根据权利要求I所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于制备粗胰激肽释放酶的エ艺步骤为畜禽胰腺经高速组织捣碎机处理，在pH值5. 5条件下，添加2-5倍原料量的预冷的25%こ醇和3-6%原料量的CaCl2，搅拌制取粗胰激肽释放酶。
4.根据权利要求3所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于搅拌速度为60 90r/min, 15_25°C下提取 2_3h。
5.根据权利要求I所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于磁性亲和分离的エ艺步骤为在胰激肽释放酶粗品中加入0.02-0.05mol/L PBS,0. 1-0. 3mol/L NaCl,0. 01-0. 03g/L Tween-80 (pH7. 2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌l_2h，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗漆 3 次，然后用 0. lmol/L NaOAc, 0. 4mol/L NaCl, 0. 01g/L Tween-80 (pH4. 0)溶液洗脱。
6.根据权利要求5所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于选用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基こ酸(GAA)为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)碳ニ亚胺盐酸盐(EDC HCl)为偶联试剂，己ニ胺(DAH)为间隔臂。
7.根据权利要求I所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于超滤浓缩采用截留分子量为IOOOODa的超滤膜。
8.根据权利要求I所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于冷冻干燥的エ艺步骤为将浓缩后的洗脱液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得到优质胰激肽释放酶。
9.根据权利要求I所述的制备胰激肽释放酶的方法，其特征在于所得胰激肽释放酶酶活可达1100U/mg以上。
全文摘要
本发明公开了一种制取胰激肽释放酶的方法，畜禽胰腺经高速组织捣碎机处理后，在酸性条件下，添加乙醇和CaCl2制备粗胰激肽释放酶，再过滤，磁性亲和分离，超滤浓缩，冷冻干燥，得到胰激肽释放酶产品。本工艺与传统工艺相比，操作简单，缩短了提取时间，提高了产品收率，酶活可达1100U/mg以上。
文档编号C12N9/64GK102864135SQ20121037849
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者周青 申请人:青海华邦生物科技有限公司