一种耐热性β-葡萄糖苷酶及其突变体的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐热性β-葡萄糖苷酶及其突变体的应用。所述耐热性β-葡萄糖苷酶的突变体G224T、N223S和N223S/G224T，氨基酸序列如SEQ：ID?NO.1、ID?NO.2和ID?NO.3所示；β-葡萄糖苷酶及其突变体可用于酶解槲皮素糖苷制备槲皮素。利用本发明制备槲皮素具有转化效率高，反应副产物少，产物分离和纯化容易，化学污染少、得到的槲皮素产物量大且纯度高等优点。
【专利说明】一种耐热性β-葡萄糖苷酶及其突变体的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体说涉及一种耐热性β -葡萄糖苷酶突变体N223S、G224T和N223S/G224T，以及该酶及其突变体在酶解槲皮素糖苷制备槲皮素中的应用。
技术背景
[0002]碳水化合物是存在于生物质中最主要化合物，预计每年产生60亿吨。为了利用这些天然原料，微生物产生各种各样的能水解和修饰碳水化合物(如糖苷配基包括有芳香基和烷烃基，糖基包括有葡萄糖、乳糖、果糖和木糖)的糖苷水解酶，这些酶能够催化水解结合于非还原性末端的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体，被作为专一催化剂被广泛用于食品加工、饲料工业、纸浆造纸工业、淀粉、纺织，以及利用其专一性优势选择性制备含碳水化合物原材料的生物技术过程。 [0003]槲皮素具有较好祛痰、止咳，平喘作用，还具有降低血压，增强毛细血管抵抗力，调血脂，扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用，传统中医作为活血止血药，此外，还具有抗菌抗病毒活性，抗氧化及清除氧自由基作用，抗炎镇痛等传统药理作用。有研究表明，槲皮素等黄酮类化合物的抗氧化活性远高于传统的抗氧化物如VC、VE ;而黄酮苷元清除人体氧自由基的生物活性明显优于黄酮糖苷，黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7倍。现代研究亦表明槲皮素可预防肿瘤发生，对急性肿瘤细胞具有明显抑制及凋亡作用，这些发现使人们对富含黄酮苷元的高附加值产品的需求在未来食品药品工业中将日益增长。
[0004]由于槲皮素分子中含有五个活泼的酚羟基，而酚羟基的保护-去保护使得其化学合成的成本居高不下，目前工业化生产制备槲皮素主要采用提取法和水解法。提取法是从植物或植物提取物中采用溶剂萃取法提纯槲皮素，该法单纯采用溶剂萃取法往往得到黄酮类混合物，难以低成本制备单一的槲皮素；水解法目前多以芦丁等低成本糖苷型黄酮化合物为原料以化学法水解为主，尤采用酸水解法，较少采用酶催化水解法。酸水解法虽水解效率较高，但专一性较差，容易破坏苷元的结构以及待水解物中的其他活性成分，水解温度较高，使用的酸对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，对环境造成污染；而现有的酶催化水解法主要以糖苷酶为催化剂，如CN1483825A公开的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，以高温好氧菌Bacillus sp.JF、曲霉菌、黑曲霉菌、罗伦隐球酵母菌、草地蘑菇菌与芦丁单品或槐米混合培养，液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，通过调控反应条件水解芦丁生产异槲皮苷和槲皮素的混合物，因此很难实现用现有菌株发酵所得粗酶液直接降解底物来制取并分离得到量大且纯度高的槲皮素苷元产物。
[0005]槲皮素(Quercetin, 3，3’，4’，5，7_五羟基黄酮)是一种在自然界分布非常广泛的黄酮醇类化合物，但以自由态(槲皮素苷元)形式分布在自然界中甚少，大多数以结合态(槲皮素糖苷)的形式广泛存在于多种植物的花、果实和叶中，尤其是洋葱、大蒜、苹果中含量丰富。研究发现洋葱中槲皮素及其衍生物含量尤为丰富，洋葱皮中槲皮素及其糖苷的含量远远高于整个根茎的平均含量，其含有的黄酮类化合物主要为槲皮素-3-0-葡萄糖苷(异槲皮苷；quercetin3-0_glucoside ；isoquercetin)> 槲皮素-4’ -O-葡萄糖苷(绣线菊苷；quercetin4’ -O-glucoside)、槲皮素_3，4’ -O-葡萄糖苷(quercetin3, 4’ -O-diglucoside)、懈皮素(quercetin; quercetin aglycone),其糖苷均为葡萄糖在C-3或/和C-4’位羟基糖基化而形成。因此，把槲皮素糖苷转化成苷元形式，是提高其生物利用率的前提。因此获得高活性水解槲皮素糖苷底物的葡萄糖苷酶更具工业应用前景。
[0006]极端嗜热袍菌属Thermotoga所产的β -葡萄糖苷酶(Tm-BglA)属于水解酶家族1，在95°C下保温6h仍保留60%活性，极具工业应用潜力。但是这些酶由于底物作用范围广(已报道的底物:纤维二糖、乳糖、水杨苷、熊果苷、烷基糖苷、对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷和对硝基苯酚-β -D-果糖苷、对硝基苯酚-β -D-半糖乳糖苷、黄豆苷、染料木苷、丙二酰黄豆苷、丙二酰染料木苷、昆布二糖和槐糖)，通常水解底物槲皮素糖苷(槲皮素-3-0-葡萄糖苷、槲皮素_4’ -O-葡萄糖苷和槲皮素_3，4’ -O-葡萄糖苷)的专一性不高。
【发明内容】
[0007]本发明通过对极端嗜热袍菌属(Thermotiga)的家族I的β -葡萄糖苷酶Tm-BglA与纤维四糖进行分子对接，以及Tm-BglA的苷元结合位点预测,选择位于Tm-BglA蛋白结构中第五β -折叠股上的两个氨基酸(Ν223和G224)进行单突变和双突变，分别将位于223位和224位上的天冬酰胺(N)和甘氨酸(G)分别替换成丝氨酸⑶和苏氨酸(T)，获得突变基因，然后插入表达质粒并转化宿主获得重组工程菌，令其表达，获得β -葡萄糖苷酶突变体N223S, G224T, N223S/G224T。
[0008]本发明提供了耐热性葡萄糖苷酶及其突变体在制备槲皮素中的应用，所述耐热性β -葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0.1-3之一所示。
[0009]本发明所述的耐热性β -葡萄糖苷酶是指来源热袍菌属Thermotiga的糖苷水解酶家族I β-葡萄糖苷 酶(TbglA)。
[0010]上述耐热性β -葡萄糖苷酶突变体，是根据热袍菌属Thermotiga的家族I β -葡萄糖苷酶基因(TbglA)序列设计突变引物，并以含TbglA的重组质粒为模板进行PCR扩增获得突变基因，然后插入表达质粒并转化宿主令其表达，即而获得β_葡萄糖苷酶突变体。
[0011]本发明还公开了一种槲皮素制备方法，是用上述的耐热性β-葡萄糖苷酶或其突变体水解槲皮素糖苷底物。所述的槲皮素糖苷底物，可以是从蔬菜、水果以及中草药中提取的槲皮素糖苷中任何一种。优选从洋葱皮中提取槲皮素糖苷。
[0012]水解槲皮素糖苷的反应条件为:ρΗ4.2-8.2，温度60_90°C下，保温时间IOmin~2h。
[0013]本发明通过定点突变获得高活性水解槲皮素糖苷底物的葡萄糖苷酶的突变体N223S、G224T和N223S/G224T，并对其进行高效表达，进一步经破细胞、热处理和离心分离所得到的β-葡萄糖苷酶及的粗酶液对槲皮素糖苷水解获得组分单一的槲皮素产物，这不仅排除了供体菌共生的其他一系列酶系的干扰，而且相对其野生型酶，水解槲皮素_3，4! -O-葡萄糖和槲皮素-4' -O-葡萄糖的活性分别得到显著提高，具有转化效率高，反应副产物少，产物分离和纯化容易，得到的槲皮素产物量大且纯度高等优点。
【专利附图】
【附图说明】[0014]图1空白对照的HPLC图谱(未加酶的洋葱皮槲皮素糖苷，在90°C和pH6.2下保温lOmin)。
[0015]图2 β -葡萄糖苷酶(野生型:在90°C和pH6.2下反应10min)水解洋葱皮槲皮素糖苷的HPLC图谱。
[0016]图3突变酶G224T?(在90°C和pH6.2下反应10min)水解洋葱皮槲皮素糖苷的HPLC图谱。
[0017]图4突变酶N223S(在90°C和pH6.2下反应10min)水解洋葱皮槲皮素糖苷的HPLC图谱。
[0018]图5空白对照的HPLC图谱(未加酶的洋葱皮槲皮素糖苷，在80°C和pH6.2下保温20min)。
[0019]图6突变体N223S/G224T (在80°C和ρΗ6.2下反应20min)转化洋葱皮槲皮素糖苷的HPLC图谱。
[0020]色谱条件:仪器:Agilent HPLC-1100型高效液相色谱仪；色谱柱=AgilentZORBAX-C18 (4.6X150mm，5ym);检测器:UV detector ;检测波长:254nm ;柱温:30°C ;流速:1.0111171^11;流动相4相为甲醇，8相为0.05%磷酸-水溶液。进样量为10μ L。以保留时间定性，以峰面积定量，以外标法计算。标准样品购于Extrasynthese公司。其中，保留时间6.7min为槲皮素_3，4’ -O-葡萄糖苷(3，4’ -Q)，保留时间9.Smin为槲皮素-3-0-葡萄糖苷(3-Q)，保留时间10.9min为槲皮素-4’ _0_葡萄糖苷(4’ -Q)，保留时间14.5min为槲皮素(Q)。
[0021]梯度程序:
[0022]
【权利要求】
1.一种耐热性β-葡萄糖苷酶及其突变体在制备槲皮素中的应用，其特征在于，所述耐热性β -葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0.1-3之一所示。
2.根据权利要求1所述的一种耐热性葡萄糖苷酶及其突变体的应用，其特征在于所述耐热性β -葡萄糖苷酶突变体在是热袍菌属(Thermotiga)的家族I的β -葡萄糖苷酶。
3.根据权利要求1所述的一种耐热性葡萄糖苷酶及其突变体的应用，其特征在于，利用耐热性β-葡萄糖苷酶或其突变体水解槲皮素糖苷制备槲皮素底物。
4.根据权利要求3所述的一种耐热性β-葡萄糖苷酶及其突变体的应用，其特征在于水解条件为:ρΗ4.2-8.2，温度60-90°C下，保温时间IOmin~2h。
5.根据权利要求3所述的一种耐热性β-葡萄糖苷酶及其突变体的应用，其特征在于所述的槲皮素糖苷底物，是从蔬菜、水果以及中草药中提取的槲皮素糖苷中任何一种。
6.根据权利要求3所述的一种耐热性β-葡萄糖苷酶及其突变体的应用，其特征在于所述的槲皮素糖苷底物是洋葱皮槲皮素糖苷。
【文档编号】C12R1/01GK103589702SQ201310581301
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】曹志刚, 薛业敏, 林宇菲, 孙慧慧 申请人:南京市第一医院, 南京师范大学