耐热性β-木糖苷酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种耐热性0 -木糖巧酶、编码所述耐热性0 -木糖巧酶的多核巧酸、 用于表达所述耐热性0 -木糖巧酶的表达载体、整合了所述表达载体的转化体、W及使用 所述耐热性0-木糖巧酶制备木质纤维素分解产物的方法。
[0002] 本申请要求基于2014年12月12日在日本申请的特愿第2014-252069号的优先 权，并在本文中引用其内容。
【背景技术】
[0003] 除了对运输用能源供应的担忧之外，由于全球变暖和大气污染等环境上的问题， 近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质是地球上最丰富的可再生 能源，作为石油替代资源而备受期待。作为植物生物质的主要成分的木质纤维素为纤维素、 半纤维素（包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）等多糖类和木质素。运些多糖类被各种 糖巧水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖，用作生物燃料或化学品原料。
[0004] 木质纤维素具有复杂的结构，是难分解性的，难W用单一的酶分解、糖化 Oiy化Olyze)。因此，对于多糖类中的纤维素的水解，通常需要糖巧水解酶中的内切葡聚糖 酶（内切-1，4-0 -D-葡聚糖酶，EC 3. 2. 1. 4)、外切型纤维二糖水解酶（1，4-0 -纤维二糖 糖巧酶（cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC 3. 2. 1. 91、EC 3. 2. 1. 176)、0 -葡糖巧酶 巧C 3. 2. 1. 21)运=种酶。另一方面，半纤维素的结构因植物的种类而异，例如，在阔叶树和 草本植物中，木聚糖构成了主要成分。对于木聚糖的水解，需要木聚糖酶（内切-1,4-0-木 聚糖酶，EC 3. 2. 1. 8)、0 -木糖巧酶巧C3. 2. 1. 37)。0 -木糖巧酶对通过木聚糖酶水解半 纤维素生成的低聚糖进行水解，是设及单糖生成工艺的水解酶之一。 阳0化]在W往的W木质纤维素为资源的生物乙醇的制备中，W乙醇的高能效转化为目 的，尝试了基于高固液比（30~60%的固液比（solid loading))的糖化处理化y化olysis process)。运种基于高固液比的木质纤维素的酶糖化（enzymatic hy化olysis)的生物质糖 化液的粘性高化y化olyzed biomass solution),难W进行木质纤维素的水解反应。因此， 通过使用耐热性酶在例如80°C W上的高溫下进行酶解糖化处理，除了加快水解反应速度之 夕F，降低了生物质糖化液的粘性，从而有望实现缩短糖化反应时间化y化olysis reaction time)并降低酶量。因此，对于各种糖巧水解酶，期望开发耐热性更优异的酶。
[0006] 大多数耐热性糖巧水解酶可W通过如下方式获得：对生存于高溫环境下的嗜热性 微生物进行分离鉴定，从运些分离培养的微生物中克隆基因，确定DNA序列后，利用大肠杆 菌或丝状真菌等表达而获得。例如，专利文献1公开了来源于丝状真菌的0-木糖巧酶，专 利文献2公开了在30°C表现出酶活性的、来源于丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)的 0-木糖巧酶。专利文献3中公开了在抑5. 5 W下、50°C W上表现出酶活性的、来源于酸热 脂环酸芽抱杆菌（Alixyclobacillus acidocaldarius)的0-木糖巧酶。专利文献4公开 了在45°C表现出酶活性的、来源于解纤维顶抱霉（Acremonium cellulolyticus)的0-木 糖巧酶。并且，非专利文献1~6报道了最适溫度为60°C左右的、分离自特定细菌或丝状 真菌的e-木糖巧酶。另外，非专利文献7报道了最适溫度为95°c的高耐热性e-木糖巧 酶。其中，所述酶在W对硝基苯基-P-D-化喃木糖巧（下文中有时缩写为PNP讶为底物时 的催化效率Kcat/Km极高，为1173. 4mM Is 1，但PNK(的分解活性的半衰期在90°C下约为30 分钟，热稳定性不充分。
[0007] 现有技术文献 阳00引专利文献
[0009] 专利文献1 :特表平11-507837号公报
[0010] 专利文献2 :特开平11-313683号公报
[0011] 专利文献3 :特表2011-523346号公报
[0012] 专利文献4 :特开2013-59272号公报
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 1 :Ko;rmelink 等，《Journal of Biotechnology (生物技术杂志）》， 1993 年，第 27 卷，第 249-265 页。
[0015] 非专利文献 2 ,Herrmann 等，《Biochemical Journal (生化杂志）》，1997 年，第 321 卷，第375-381页。
[0016] 非专利文献 3 :kitamoto 等，《Applied and !Environmental Microbiology 应用 与环境微生物学）》，1999年，第65卷，第20-24页。
[0017] 非专利文献 4 :La Grange 等，《Applied and !Environmental Microbiology 应用 与环境微生物学）》，2001年，第67卷，第5512-5519页。
[0018] 非专利文献 5 :化ao 等，《Applied and !Environmental Microbiology (应用与环 境微生物学）》，2011年，第77卷，第719-726页。
[0019] 非专利文献 6 :Morais 等，《Journal of Biological Qiemistry(生物化学杂 志）》，2012年，第287卷，第9213-9221页。
[0020] 非专利文献7 :Shi等，《Biotechnology for Biofuels(生物燃料技术）》，2013年， 第6卷，第27期。
【发明内容】
[0021] 本发明要解决的技术问题 阳02引本发明的目的是提供一种至少在105°C且抑5. 0的条件下表现出W PNPX为底物的 水解活性的新耐热性P-木糖巧酶、编码所述耐热性P-木糖巧酶的多核巧酸、用于表达所 述耐热性0 -木糖巧酶的表达载体、整合了所述表达载体的转化体、W及使用所述耐热性 0-木糖巧酶制备木质纤维素分解产物的方法。
[0023] 解决技术问题的技术手段
[0024] 本发明的发明人为了解决上述问题，通过从溫泉高溫±壤中直接提取DNA来进行 难培养微生物群的大规模宏基因组测序，成功获取了具有新的氨基酸序列的耐热性0 -木 糖巧酶，从而完成了本发明。
[00巧]目P，作为本发明的耐热性0-木糖巧酶、多核巧酸、表达载体、转化体、耐热性 0 -木糖巧酶的制备方法、糖巧水解酶混合物、W及木质纤维素分解产物的制备方法，可W 列举下列[1]~[10]的实施方案。
[0026] 山一种耐热性e -木糖巧酶，其具有由下列（A)、做或似构成的e -木糖巧 酶催化区域：
[0027] (A)由序列号1或2所示氨基酸序列构成的多肤；
[0028] 度）由序列号1或2所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形 成的氨基酸序列所构成、并且至少在l〇5°C且抑5. 0的条件下具有W对硝基苯基-0 -D-化 喃木糖巧为底物的水解活性的多肤；
[0029] 似由与序列号1或2所示氨基酸序列具有75% W上序列一致性的氨基酸序列所 构成、并且至少在105°C且P册.0的条件下具有W对硝基苯基-0 -D-化喃木糖巧为底物的 水解活性的多肤。
[0030] 凹上述山的耐热性0 -木糖巧酶，其还进一步具有选自由a A-阿拉伯巧喃糖 巧酶活性和〇寸-阿拉伯化喃糖巧酶（日1'油；[]10口7拘]1031(1日36)活性构成的组中的至少一种 活性。
[00川 閒一种多核巧酸，其具有由下列（a)~（e)中碱基序列构成的编码0 -木糖巧酶 催化区域的区域：
[0032] (a)编码由序列号1或2所示氨基酸序列构成的多肤的碱基序列；
[0033] 化）编码由序列号1或2所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添 加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在105°C且抑5. 0的条件下具有W对硝基苯 基-0 -D-化喃木糖巧为底物的水解活性的多肤的碱基序列；
[0034] (C)编码由与序列号1或2所示氨基酸序列具有75% W上序列一致性的氨基酸序 列所构成的、并且至少在l〇5°C且P册.0的条件下具有W对硝基苯基-0 -D-化喃木糖巧为 底物的水解活性的多肤的碱基序列；
[0035] (d)与序列号3或4所示碱基序列具有80% W上序列一致性、并且编码至少在 105°C且P册.0的条件下具有W对硝基苯基-0 -D-化喃木糖巧为底物的水解活性的多肤的 碱基序列；
[0036] (e)与由序列号3或4所示碱基序列构成的多核巧酸在严格条件下进行杂交的多 核巧酸的碱基序列、且编码至少在105°C且P册.0的条件下具有W对硝基苯基-0 -D-化喃 木糖巧为底物的水解活性的多肤的碱基序列。
[0037] [4]上述[3]的多核巧酸，所述多肤还进一步具有选自由a A-阿拉伯巧喃糖巧酶 活性和a A-阿拉伯化喃糖巧酶活性构成的组中的至少一种活性。
[0038] [引一种表达载体，其整合了上述[3]或[4]的多核巧酸，在宿主细胞中可表达具 有0-木糖巧酶活性的多肤。
[0039] [6] -种转化体，其导入有上述閒的表达载体。
[0040] [7]上述[6]的转化体，其为真核微生物。
[0041] [引上述耐热性0 -木糖巧酶的制备方法，其包括在上述[6]或[7]的转化体中生 产上述耐热性P-木糖巧酶。 阳0创 [9] 一种糖巧水解酶混合物，其包含上述山或凹的耐热性0-木糖巧酶、上述
[3]或[4]的多核巧酸编码的耐热性0-木糖巧酶、或者利用上述[引的耐热性0-木糖巧 酶的制备方法制得的耐热性P -木糖巧酶、W及至少一种其他糖巧水解酶。
[0043] [10] -种木质纤维素分解产物的制备方法，其包括使由木质纤维素所构成的材料 与上述[1]或[2]的耐热性e -木糖巧酶、上述[3]或[4]的多核巧酸编码的耐热性e -木 糖巧酶、上述[6]或上述[7]中记载的转化体、利用上述[引的耐热性0-木糖巧酶的制备 方法制得的耐热性0 -木糖巧酶、或者上述[9]的糖巧水解酶混合物接触，由此生产木质纤 维素分解产物。 W44] 发明效果 W45] 本发明的耐热性0 -木糖巧酶至少在105°C且抑5. O的条件下具有W PNPX为底物 的水解活性。因此，上述耐热性P-木糖巧酶适合于高溫条件下的、由木质纤维素所构成的 材料的糖化处理化y^olysis process)。
[0046] 此外，作为另一方面，上述耐热性0-木糖巧酶适合于高溫条件下的、包含具有 0-木糖巧键的化合物的材料的糖化处理。另外，所述包含具有0-木糖巧键的化合物的材 料例如可W通过用木聚糖酶对包含半纤维素的木质纤维素所构成的材料进行水解而获得。
[0047] 此外，作为又一方面，上述耐热性0-木糖巧酶适合于高溫条件下的、包含阿拉 伯糖残基、更具体而言包含阿拉伯巧喃糖残基或阿拉伯化喃糖残基的材料的糖化处理 (hydrolysis process)。
[0048] 此外，本发明的多核巧酸、整合了所述多核巧酸的表达载体、导入有所述表达载体 的转化体适合用于制备本发明的耐热性0-木糖巧酶。
【附图说明】 W例图IA为开放阅读框0J1M-273的碱基序列（序列号如与0 -木糖巧酶候选基因 0J1M-273-1的碱基序列（序列号4)的比对图（前半部分）。
[0050] 图IB为开放阅读框0J1M-273的碱基序列（序列号3)与0 -木糖巧酶候补基因 0J1M-273-1的碱基序列（序列号4)的比对图（后半部分，图IA的延续）。
[0051] 图2为开放阅读框0J1M-273的氨基酸序列（序列号1)与0 -木糖巧酶候选基因 0J1M-273-1的氨基酸序列（序列号2)的比对图。 阳05引图3为0 -木糖巧酶候选基因0J1M-273-1的氨基酸序列（序列号2)与 Candida1:us Caldatribacteirum californiense 的 0-木糖巧酶（序列号 9)的比对图。 [0053] 图4为表示实施例1中的0J1M-273-1基因在大肠杆菌中表达得到的0J1M-27