％的654溶液。在整个测算过程中，添加50mM化is-HCl缓冲液 (P册.0)替代基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化酶，将W相同条件反应的混合液作为对 照区。此外，酶（基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化酶）与纯化水与缓冲液的混合液在 反应溫度下保溫5分钟后（预溫育），添加底物溶液，开始反应。10分钟的反应结束后，向 各混合液添加等量的0. 2M胞2〇)3溶液并进行揽拌，使反应停止，然后进行5分钟离屯、处理， 得到上清液。上清液中的对硝基苯酪含量是用分光光度计测算420nm的吸光度，使用预先 制作的对硝基苯酪含量与420nm吸光度的校准曲线进行计算，由与对照区的差求得通过酶 的水解生成的对硝基苯酪含量。W 1分钟生成1 y mol对硝基苯酪的酶活性为1U，除W蛋白 质质量得到的值为比活性扣/mg)。此外，各个测算通过3次独立的试验进行，求得平均值和 标准误差（St曰nd曰rd errors)。 阳187] 其结果为，在使用基因重组大肠杆菌破碎上清液时和使用纯化酶时，确认到他们 两者都具有P -木糖巧酶活性（PNK(水解活性）。
[0188] <8〉0JlM-273-l 的底物特异性
[0189] 对于0J1M-273-1基因编码的酶蛋白（0J1M-273-1)，研究了其相对于各种纤维素 底物及半纤维素底物的水解活性。作为底物，使用了 CMC(Sigma社制）、木聚糖（来源于样 木，Sigma社制）、阿拉伯聚糖（来源于甜菜，Sigma社制）、阿拉伯半乳聚糖（来源于落叶松、 Sigma 社制）、PNPX (Sigma 社制）、PNPG (Sigma 社制）、PNPAF (Sigma 社制）、PNPAP (Sigma 社 审Ij )、PNPGA (Sigma 社制）、PNPFP (Sigma 社制）、PNPRP (Sigma 社制）、PNPMP (Sigma 社制）、 PNPadX (Sigma 社制）、W及 PNPbdFP (Sigma 社制）。 阳190] 具体而言，WCMC、木聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖W外的底物（PNP底物）为 底物时，除了使用稀释为0. 〇2mg/mL的纯化酶与20mM的各底物水溶液在105°C反应之外， W与上述<7〉相同的方式进行，求取通过酶的水解生成的对硝基苯酪含量，算得比活性扣/ mg)。
[0191] W CMC、木聚糖、阿拉伯聚糖或阿拉伯半乳聚糖为底物时，除了使用稀释为 0. 02mg/mL的纯化酶与1质量％的各底物水溶液在105°C反应之外，W与上述<7〉相同的方 式反应，反应结束后，添加等量的3, 5-二硝基水杨酸试剂值NS溶液）在100°C进行5分钟 热处理，冰上冷却5分钟后，在室溫下，W 17, 500g进行5分钟的离屯、分离处理，得到上清 液。上清液中的还原糖含量W如下方式求得，用分光光度计测算上清液在540nm的吸光度， 使用由葡萄糖制作的校准曲线（W木聚糖为底物时为由木糖制作的校准曲线，W阿拉伯聚 糖、阿拉伯半乳聚糖为底物时为由阿拉伯糖制作的校准曲线）进行计算，由与对照区的差 求得通过酶的水解生成的还原糖含量。W 1分钟生成1 y mol还原糖（Re化ced Sugar)的 酶活性为1U，除W蛋白质质量得到的值为比活性扣/mg)。 阳192] 测定结果示于图5中。酶活性表示为W相对于PWX的水解活性为100%的相对值 巧elative activity, % )。其结果为，0J1M-273-1 表现出对于 PNPX、PNPAF、PNPAP、阿拉 伯聚糖、W及阿拉伯半乳聚糖的高水解活性，对于PNPG与木聚糖也表现出了弱分解活性， 但对于其他底物，几乎没有表现出水解活性。 阳19引 <9〉0JlM-273-l的0-木糖巧酶的动力学化inetics) 阳194] 对0J1M-273-1的PNP底物水解的最大初速度（Vmax)、米氏常数（Km)及催化效 率化cat/Km)进行了研究。动力学的测定，除了将PNra水溶液的浓度设为0. 2mM、0. 5mM、 ImM、3mM、5mM、IOmM或20mM，将PNPAF水溶液及PNPAP水溶液的浓度分别设为ImM、3mM、5mM、 10mM、20mM、30mM、40mM、50mM或60mM，使用稀释为0.0 lmg/血的酶在105°C使他们反应之外， W与上述<7〉相同的方式进行，算得PNP底物水解活性扣/mg)。最大初速度（Vmax)和米氏 常数（Km)是通过使用数据分析软件化igin化i曲t Stone社制）进行米-曼式模型拟合求 得的，由所得数值算得催化效率化cat/Km)。
[0195] 结果示于表2中。最大初速度在底物为PNPAF时最大，但催化效率在底物为PNPX 时最大。运表示PNPX为最适合于0J1M-273-1的底物。 阳196][表引 阳1巧1
[0198] <10〉W PNPX为底物的0 -木糖巧酶活性的抑及溫度依赖性
[0199] 对0J1M-273-1基因编码的酶蛋白（0J1M-273-1)的PNra水解活性的溫度依赖性 及抑依赖性进行了研究。测算中使用了将上述<6〉中得到的纯化酶稀释为0.1 mg/血而得 到的纯化酶溶液。 阳200] 纯化的0J1M-273-1的PNra水解活性的溫度依赖性的测定除了使反应溫度为60、 70、80、90、95、100、105、110或115°(：来进行之外，^与上述<7〉相同的方式进行，求得因酶 的水解生成的对硝基苯酪含量，算出PNra水解活性扣/mg)。 阳201] 结果示于图6中。酶活性表示为W表现出最高水解活性的105°C的值为100%的相 对值巧elative activity, % )。0J1M-273-1在溫度范围60~110°C内表现出对于PNPX 水解活性（图6)。在60~105°C的范围内，在酶反应溫度上升的同时，PWX水解活性也上 升，表现出最高活性的最适溫度灯。Pt)为105°C。将酶反应溫度设为105°C W上时，PNK(水 解活性急剧下降。 阳20引纯化的0J1M-273-1的PNPX水解活性的抑依赖性的测定除了使用稀释为0. lmg/ 血的纯化酶溶液和150 y L McIlvaine缓冲液（P册~8)在105°C反应之外，W与上述<7〉 相同的方式进行，求得因酶的水解生成的对硝基苯酪含量，算出PNra水解活性扣/mg)。 阳203] 结果示于图7中。酶活性表示为W表现出最高水解活性的抑5. 0的值为100% 的相对值巧elative activity, %)。抑标绘了底物、缓冲液和酶的混合液的测量值。 0J1M-273-1在抑4. 5~7的范围内表现出PNra水解活性。最适抑为5. 14 (底物、缓冲液 和酶的混合液的测量值）。 阳204] <11〉0 -木糖巧酶的热稳定性测定
[0205] 对0J1M-273-1的PNPX水解活性的热稳定性进行了研究。测算中使用了将上述 <6〉中得到的纯化酶稀释为0.1 mg/血而得到的纯化酶溶液。 阳206] 具体而言，将由6 y L纯化酶溶液（0.1 mg/mL)、294 y L纯化水、150 y L 200mM的醋 酸缓冲液（9册.0)构成的混合液在85°(：、90°(：、95°(：、100°(：或105°(：的各溫度下保溫（预溫 育）0、30、60、120或240分钟后，W与上述<7〉相同的方式进行，在95°C下测定PWX水解活 性，求得因酶的水解生成的对硝基苯酪含量，算出比活性扣/mg)。
[0207] 结果示于图8中。酶活性表示为W非处理区（保溫时间0分钟）的活性为100% 的相对值巧elative activity，％)。W酶活性降为非处理区的50%的保溫时间为半衰期 Thgif。0J1M-273-1的Thgif在保溫溫度为85°C时为约240分钟，在90°C及95°C时为约180分 钟，在100°C时为约130分钟。另一方面，将保溫溫度设为105°C时，PNK(水解活性急剧下 降，30分钟即降至约30%。
【主权项】
1. 一种耐热性β-木糖苷酶，其具有由下列（A)、（B)或（C)构成的β-木糖苷酶催化 区域： (Α)由序列号1或2所示氨基酸序列构成的多肽； (Β)由序列号1或2所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的 氨基酸序列所构成、并且至少在l〇5°C且ρΗ5. 0的条件下具有以对硝基苯基-β -D-吡喃木 糖苷为底物的水解活性的多肽； (C)由与序列号1或2所示氨基酸序列具有75%以上序列一致性的氨基酸序列所构 成、并且至少在105°C且ρΗ5. 0的条件下具有以对硝基苯基- β -D-吡喃木糖苷为底物的水 解活性的多肽。2. 根据权利要求1所述的耐热性β -木糖苷酶，其还进一步具有选自由a -L-阿拉伯 呋喃糖苷酶活性及a -L-阿拉伯吡喃糖苷酶活性构成的组中的至少一种活性。3. -种多核苷酸，其具有由下列（a)~（e)中碱基序列构成的编码β-木糖苷酶催化 区域的区域： (a) 编码由序列号1或2所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列； (b) 编码由序列号1或2所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添 加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在105°C且pH5. 0的条件下具有以对硝基苯 基- β -D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列； (c) 编码由与序列号1或2所示氨基酸序列具有75%以上序列一致性的氨基酸序列所 构成的、并且至少在105°C且ρΗ5. 0的条件下具有以对硝基苯基- β -D-吡喃木糖苷为底物 的水解活性的多妝的喊基序列； (d) 与序列号3或4所示碱基序列具有80%以上序列一致性、并且编码至少在105°C 且PH5. 0的条件下具有以对硝基苯基- β -D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基 序列； (e) 与由序列号3或4所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷 酸的碱基序列、且编码至少在105°C且pH5. 0的条件下具有以对硝基苯基- β -D-吡喃木糖 苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列。4. 根据权利要求3所述的多核苷酸，所述多肽还进一步具有选自由a -L-阿拉伯呋喃 糖苷酶活性及a -L-阿拉伯吡喃糖苷酶活性构成的组中的至少一种活性。5. -种表达载体，其整合了根据权利要求3或4所述的多核苷酸，在宿主细胞中可表达 具有木糖苷酶活性的多肽。6. -种转化体，其导入有根据权利要求5所述的表达载体。7. 根据权利要求6所述的转化体，其为真核微生物。8. -种耐热性β -木糖苷酶的制备方法，其包括在根据权利要求6或7所述的转化体 中生产耐热性β-木糖苷酶。9. 一种糖苷水解酶混合物，其包含根据权利要求1或2所述的耐热性β -木糖苷酶、 根据权利要求3或4所述的多核苷酸编码的耐热性β -木糖苷酶、或者利用根据权利要求8 所述的耐热性β-木糖苷酶的制备方法制得的耐热性β -木糖苷酶、以及至少一种其他糖 苷水解酶。10. -种木质纤维素分解产物的制备方法，其包括使木质纤维素所构成的材料与根据 权利要求1或2所述的耐热性β -木糖苷酶、根据权利要求3或4所述的多核苷酸编码的 耐热性β -木糖苷酶、根据权利要求6或7所述的转化体、利用根据权利要求8所述的耐热 性β-木糖苷酶的制备方法制得的耐热性β-木糖苷酶、或者根据权利要求9所述的糖苷 水解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。
【专利摘要】本发明提供一种耐热性β-木糖苷酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的β-木糖苷酶催化区域：(A)由序列号1或2所示氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1或2所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成、并且至少在105℃且pH5.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号1或2所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列所构成、并且至少在105℃且pH5.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽。
【IPC分类】C12P19/04, C12N9/42, C12N1/19, C12N15/56, C12N1/21, C12N15/63, C12N1/15, C12P19/14, C12N5/10
【公开号】CN105695436
【申请号】CN201510895691
【发明人】大熊二郎, 须田汀, 山口明日香, 广濑佳嗣, 近藤康弘, 佐藤大, 柴田大辅
【申请人】本田技研工业株式会社
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2015年12月8日
【公告号】EP3031912A1, US20160168548