体中稳定表达本发明的耐热性P-木糖巧酶。另一方面，对于使用通过特定化合物 或溫度条件等诱导表达的所有表达诱导型启动子所制备的转化体，通过对此转化体进行培 养，且进行适应于各自表达诱导条件的诱导处理，能够在所述转化体中表达本发明的耐热 性0 -木糖巧酶。
[0136] 由转化体生产的耐热性0-木糖巧酶能够W留存于所述转化体中的状态使用，也 可W从所述转化体中提取纯化。 阳137] 从转化体中提取或纯化耐热性e -木糖巧酶的方法只要是不损害耐热性e -木糖 巧酶活性的方法即可，没有特别的限制，可W利用从细胞或活体组织中提取多肤时通常使 用的方法来进行提取。作为所述方法，例如可列举将转化体浸入适当的提取缓冲液中，提取 耐热性0-木糖巧酶后，将提取液与固体残渣分离的方法。作为上述提取缓冲液，优选为含 有表面活性剂等增溶剂的提取缓冲液。在转化体为植物的情况下，在浸入提取缓冲液前，可 W预先将所述转化体切碎或粉碎。此外，作为分离提取液和固体残渣的方法，例如可使用过 滤法、压缩过滤法、或离屯、分离处理法等公知的固液分离处理，也可W对浸入提取缓冲液状 态的转化体进行挤压。提取液中的耐热性P-木糖巧酶可W利用盐析法、超滤法或层析法 等公知的纯化方法进行纯化。
[0138] 本发明的耐热性0-木糖巧酶在转化体中W具有分泌信号肤的状态表达时，在对 上述转化体进行培养后，回收从所得到的培养物除去转化体的培养液上清，由此能够简便 的获得含有耐热性P-木糖巧酶的溶液。此外，本发明的耐热性P-木糖巧酶具有化S标 记等标记时，通过利用上述标记的亲和层析法，能够简便的纯化提取液或培养液上清中的 耐热性0 -木糖巧酶。
[0139] 目P，本发明的耐热性0 -木糖巧酶的制备方法包括在对所述本发明的转化体内生 产耐热性0 -木糖巧酶，W及根据需要从所述转化体中提取纯化所述耐热性0 -木糖巧酶。
[0140] [糖巧水解酶混合物] 阳141] 本发明的糖巧水解酶混合物含有上述本发明的耐热性0-木糖巧酶或由上述本 发明的耐热性0-木糖巧酶的制备方法制备的耐热性0-木糖巧酶、W及至少一种其他糖 巧水解酶。由上述本发明的耐热性0-木糖巧酶的制备方法制备的耐热性0-木糖巧酶可 W是包含在转化体中的状态的耐热性P -木糖巧酶，也可W是从转化体中提取纯化的耐热 性0-木糖巧酶。通过将本发明的耐热性0-木糖巧酶W与其他糖巧水解酶的混合物的形 式用于多糖类的水解反应，能够更高效地分解由难分解的含有纤维素、半纤维素和木质素 的木质纤维素所构成的材料。
[0142] 作为上述糖巧水解酶混合物中含有的所述耐热性0 -木糖巧酶之外的其他糖巧 水解酶，只要是具有木质纤维素水解活性的酶即可，没有特别的限制。作为所述糖巧水解酶 混合物中含有的所述耐热性P -木糖巧酶之外的其他糖巧水解酶，例如可列举木聚糖酶等 半纤维素酶、纤维二糖水解酶、P -葡糖巧酶、或内切葡聚糖酶等。作为本发明的糖巧水解酶 混合物，优选为除了所述耐热性0 -木糖巧酶之外，还含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶中 的至少一种糖巧水解酶的混合物，更加优选为除了所述耐热性0 -木糖巧酶之外，还含有 半纤维素酶和内切葡聚糖酶运两种糖巧水解酶的混合物。其中，优选除所述耐热性P-木 糖巧酶之外，还含有选自由木聚糖酶、0 -木糖巧酶、纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶构成 的组中的至少一种糖巧水解酶的混合物，更加优选除所述耐热性0 -木糖巧酶之外，还含 有木聚糖酶、P-木糖巧酶、纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶全部运些糖巧水解酶的混合 物。
[0143] 上述糖巧水解酶混合物中含有的其他糖巧水解酶优选为至少在85°C具有糖巧水 解酶活性的耐热性糖巧水解酶，更加优选为在70~90°C具有糖巧水解酶活性的耐热性糖 巧水解酶。通过使上述糖巧水解酶混合物含有的全部酶为耐热性的（例如酶活性的最适溫 度或酶蛋白的热变性溫度为70°C W上），能够在高溫条件下高效进行基于上述糖巧水解酶 混合物的所述木质纤维素构成的材料的水解反应。目p，上述糖巧水解酶混合物仅含有耐热 性糖巧水解酶时，通过将所述糖巧水解酶混合物用于由所述木质纤维素构成的材料的糖化 处理，使得可W在糖化溫度为70~90°C的高溫环境下进行所述材料的水解反应（高溫糖 化：hi曲temperature hy化olysis)。通过该高溫糖化，可W显著减少酶量和糖化时间，大 幅降低糖化成本化y化olysis cost)。
[0144] [木质纤维素分解产物的制备方法]
[0145] 本发明的木质纤维素分解产物的制备方法为包括利用本发明的耐热性0-木糖 巧酶将由木聚糖酶水解半纤维素生成的低聚糖、或者由纤维二糖水解酶水解纤维素生成的 低聚糖水解为单糖，从而得到木质纤维素分解产物（例如包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等单 糖的分解产物）的方法。 阳146] 木质纤维素分解产物的制备方法具体而言为，通过使木质纤维素所构成的材料、 例如包含选自由半纤维素和纤维素构成的组中的至少一种的木质纤维素所构成的材料与 本发明的耐热性P-木糖巧酶、本发明的转化体、利用本发明的耐热性P-木糖巧酶的制备 方法制得的耐热性0 -木糖巧酶、或者本发明的糖巧水解酶混合物接触，生产包括例如半 纤维素分解产物、纤维素分解产物、或者半纤维素分解产物与纤维素分解产物双方的由所 述木质纤维素构成的材料的分解产物的方法。 阳147] 作为所述木质纤维素所构成的材料、只要至少包含半纤维素或纤维素即可，没有 特别的限制。作为所述材料，例如可列举杂草或农业废弃物等纤维素类生物质、或者废纸 等。优选在使所述材料与本发明的耐热性P-木糖巧酶接触前，先进行破碎或切碎等物理 处理、利用酸或碱等的化学处理、或者浸溃或溶解于适当的缓冲液中的处理等。
[0148] 目P，本发明的木质纤维素分解产物的制备方法还可W进一步包括，在使所述材料 与本发明的耐热性P-木糖巧酶接触前，进行物理处理、化学处理、或者浸溃或溶解于缓冲 液中的处理。
[0149] 利用本发明的耐热性0-木糖巧酶进行的半纤维素的水解反应的反应条件只要 是使所述耐热性P-木糖巧酶表现出纤维寡糖水解活性的条件即可。例如优选在70~ 110°C且抑4. 5~7. 0的条件下进行反应，更加优选在90~110°C且抑4. 5~6. 5的条件下 进行反应，进一步优选在95~Iior且pH4. 5~6. 0的条件下进行反应。上述水解反应的 反应时间可考虑供水解的所述材料的种类、预处理方法、或者用量等进行适当的调整。例如 进行10分钟~100小时，在分解纤维素类生物质的情况下，能够W 1~100小时的反应时 间进行上述水解反应。
[0150] 在上述木质纤维素所构成的材料的水解反应中，除了本发明的耐热性0 -木糖巧 酶之外，优选还使用至少一种其他糖巧水解酶。作为所述其他糖巧水解酶，可W使用与上述 糖巧水解酶混合物中含有的糖巧水解酶一样的糖巧水解酶，优选的是，至少在85°C、优选至 少在70~90°C、更优选在70~105°C、进一步优选在70~110°C具有糖巧水解酶活性的耐 热性糖巧水解酶。此外，上述木质纤维素分解产物的制备方法的一个方面为使用本发明的 耐热性0-木糖巧酶、本发明的转化体、或者利用本发明的耐热性0-木糖巧酶的制备方法 制得的耐热性0 -木糖巧酶，另一方面为使用所述糖巧水解酶混合物。 阳151] 实施例 阳152] 下面示出实施例对本发明进行进一步的详细说明，但本发明并不局限于W下实施 例。 阳153][实施例1]来自于溫泉±壤的新耐热性0 -木糖巧酶的克隆
[0154] <1〉来自于溫泉±壤的DNA提取与全基因组序列（Whole Genome Sequence, WG巧
[0155] W在70~90°C表现出活性的新耐热性e-木糖巧酶的基因捜索为目的，从中性~ 弱碱性溫泉采集上壤DNA，进行构成运些±壤的微生物群的基因组DNA的碱基序列解码。 阳156] 作为中性~弱碱性溫泉±壤样本，从在野外有喷出高溫溫泉的日本国内的3处的 5个地点（宏基因组DNA样本N2、AR19、AR15、OJl和Hl)采集含有±壤、泥、生物垫的溫泉 水。运些溫泉±壤样本在采集溫度58~78°C且抑7. 2~8的范围内。 阳 157]使用 DNA 提取试剂盒（IS0IL Large for Beads ver. 2, NIPPON GE肥社制），从所 采集的溫泉上壤样本各IOg中提取DM。利用罗氏诊断（Roche Dia即ostics)社制测序仪 GS化X Titanium 454及Illumina社制测序仪GA2x，对所提取的DNA进行宏基因组DNA的 鸟枪法测序。在454测序仪中使用5 y g所提取的DNA，在GA2X测序仪中，使用由基因组DNA 扩增试剂盒（GenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒，GE医疗社制）扩增的产物，进行宏基因组DNA 的序列解码。在利用GA2X进行的测序中，使用Illumina社制cBot，将DNA文库及试剂注入 流动槽（flow cell)，在流动槽内由DNAl分子自动形成具有同一序列的基因簇。使用GA2X 进行icnbp的配位末端测序，得到宏基因组序列数据。
[015引对溫泉±壤样本OJl (下文有时称为OJl宏基因组）进行宏基因组DNA的序列解 码，在454测序仪中，得到平均解码长度（read length)为39化P、总解码数（total read number)为6, 301, 450个、总基因组解码量（a total quantity of sequenced genomes)为 2, 456, 206, 434bp，在GA2x测序仪中，通过平均解码长度为114bp的配对末端，得到总解码 数为545, 185, 016个、总基因组解码量为62, 151，091，824bp，得到共计64. 6抓P的全基因组 序列（WG巧数据集。 阳159] <2〉溫泉宏基因组数据的拼接与统计量
[0160] 对于用454测序仪和GA2X测序仪读取的碱基序列，使用CLCbio社制化C Genomics Woricbench (CLC高通量数据分析平台，5. 4. 8版）进行质量过滤（如ality f iItering)及Denovo拼接。在质量过滤后，由454测序仪得到的解码的总解码长 度变为2, 446, 280, 45化P，由GA2X测序仪得到的碱基序列数据的总解码长度变为 54, 066, 191，00化P。拼接后，具有5(K)bp W上长度的重叠群的数量为2, 080, 555个，总全长 变为1，083,520,8586口，其中，最大重叠群长度为1，063,86%口。
[0161] <3〉0 -木糖巧酶的开放阅读框（OP巧预测
[0162] 从 Uniprot 数据库化ttp://www. uniprot.org/)下载 EC 号为 3.2. 1.4(纤维素 酶）、3. 2. 1.21(0 -葡糖巧酶）、3. 2. 1.37(0 -木糖巧酶）、3. 2. 1.91(纤维素 1,4-0-纤 维二糖糖巧酶）、3. 2. 1.8(内切-1,4-0-木聚糖酶）的序列（访问日期：2011/12/9), 构建运些糖巧水解酶基因的蛋白质组本地数据库。使用注释软件Metagene(Noguchi等， 《DNA Research值NA研究）》，2008,15化)），由上述<2〉所得重叠群序列推断基因区域 (=开放阅读框）（Metagene选项：-m)。为了从推断的ORF提取糖巧水解酶基因，使用了 BLASTP (blastall ver. 2. 2. 18)，参照了上述本地数据库。BLASTP的选项条件设为"过滤查 询序列=假"，"期望值巧Kle 2°"[ W下为默认值：空位开放罚分=-1，空位扩展罚分=-1， 全位比对的X下降值=0,阔值拓展命中=0,字段长度=默认（Cost to open a gap =-1, Cost to extended gap = -1， X dropoff value for gapped alignment = 0， Threshold for extending hits = 0, Word size = default)]，W命中 ORF 序列为糖巧水解酶基因进 行收集。收集的碱基序列包含纤维素酶、内切半纤维素酶、脱支酶等糖巧水解酶基因的碱基 序列。
[0163] <4〉基因的糖巧水解酶（GH)家族分类
[0164] 对于在上述<3〉中收集的碱基序列，W蛋白质功能区域序列数据库Pfam HMMs (Pfam 23.0版和HMMER 2. 3版；Finn等，《核酸研究数据库》，2010年，第38卷，第 D211-222页）为标准进行功能分类。具体而言，使用了