专利名称：一种含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学鱼类育种技术领域，尤其涉及一种含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用。
背景技术：
目前，获得较快生长速度的鲤鱼依然是产业发展的需求，因此，选育出生长速度快，品质优良的鲤鱼品种，尤其是选择优良的候选基因及适当的处理方法在提高鲤鱼生长速度的同时不影响其他性状的表达，具有重要的意义。传统的原核内显微注射法、精子载体法、脂质体转染法、反转录病毒载体法、细胞核移植方法等改善动物品种性能的方法皆因成本高、效率低或者插入片段小等缺点而无法广泛应用。含有鲤IGF2b基因的慢病毒是一种用人工分离和修饰的方法获得的病毒液，即根据鲤鱼RNA反转录为cDNA，再设计相应引物进行PCR扩增，用相应内切酶切割获得含有 IGF2b的基因片段，最终用此基因片段与载体pLenti6. 3-IRES-EGFP相连接从而获得含有鲤IGF2b基因的慢病毒；其具体制备方式见专利申请号为201110356210. O的专利申请文件中所述。用此含有鲤IGF2b基因的慢病毒处理鲤鱼来感染鲤特定组织中非分裂期和分裂期细胞，从而影响特定组织靶基因的表达以致其生长状况发生变化。此种育种方法应用于鱼类可在短期内确定具有目的基因的品系，提高鲤鱼产肉量，从而缩短鱼类育种时间，并且能使整合于靶细胞基因组的目的基因长期、稳定的表达，此类研究至今未见报道。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用。技术方案具体处理步骤如下(I)用人工分离和修饰的方法获得含有鲤IGF2b基因的慢病毒；(2)让鲤鱼感染所述慢病毒，即在鲤鱼体内注射所述慢病毒；(3)用绿色荧光来确定感染是否成功感染48h后，通过荧光显微镜观测法观察绿色荧光蛋白的表达状况，如有绿色荧光蛋白的表达，则表明所述鲤鱼已感染上所述慢病作为本发明的进一步改进，步骤(2)中所述慢病毒的感染在幼鱼阶段完成。作为本发明的更进一步改进，步骤(2)中，在所述鲤鱼体重为5g时注射所述慢病毒。作为本发明的一种优选方案，步骤(2)中鲤鱼注射部位为背部肌肉。
作为本发明的更进一步优选方案，步骤(2)中鲤鱼注射部位为背鳍最前端定点到侧线垂直距离的中间点。本发明还包括观测由于感染而引起鲤鱼性状的变化的步骤(4) :3个月后，验证鲤鱼生长状况和血液指标状况。有益效果3个月后，验证被感染鲤鱼的生长状况和血液指标状况，其验证方法为根据阴性对照、阳性对照，对比不同注射剂量的鲤鱼的体重变化状况及血液指标的变化状况。结果显示，用已检测的含有鲤IGF2b基因的慢病毒感染鲤鱼幼体，感染组相比对照组，鲤鱼体重获得了显著增加的效果，且剂量较大时效果更好，同时对鲤鱼血液指标没有影响，安全性好。此种育种方法应用于鱼类可在短期内确定具有目的基因的品系，缩短鱼类育种时间，并且能使整合于靶细胞基因组的目的基因长期、稳定的表达，由于未对血液指标造成影响，所以安全性好。
图I为荧光显微镜检测到慢病毒注射48h后鱼体绿色荧光蛋白的表达，通过此表达可以显示被慢病毒感染的鲤鱼背部肌肉的生长效果，有绿色荧光显示说明已被感染图2养殖3个月后不同实验组鱼的体重性状的差异
具体实施例方式实施例I为了控制试验误差，所有注射工作由一个人完成，所有实验组都在同一塘中养殖， 所有的养殖管理均由一个人进行。(I)含有鲤IGF2b基因的慢病毒来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心鲤复合育种课题组，其制备方法参看专利申请号为201110356210.0的专利申请文件，250尾鲤取自中国水产科学研究院无锡淡水渔业研究中心南泉养殖基地，共设立5个实验组一个是不做任何处理的阴性对照组；一个是注射不含鲤IGF2b基因的慢病毒稀释液的阳性对照组，注射量为20μ L，总计约含I. IXlO5个病毒；另外三个是按照低、中、高三个不同浓度梯度注射含鲤IGF2b基因慢病毒稀释液的慢病毒感染组，其注射剂量分别为10 μ L，20 μ L和40 μ L，分别对应含病毒个数为
5.54X IO4个病毒，1.1X IO5个病毒，2. 22 X IO5个病毒。(2) 48h后，随机选取阴性对照组、阳性对照组和各剂量感染组鱼各2尾，进行绿色荧光蛋白(GFP)荧光检测。结果显示，各剂量感染组鱼均已感染鲤IGF2b基因慢病毒，见图 I ;(3)在⑵的基础上，养殖3个月后，测量体重，计算不同实验组鱼之间的生长表现。结果显示，感染鲤IGF2b基因慢病毒的鲤鱼比未感染此病毒的鲤鱼体重明显大，且最高感染剂量40uL组的体重最大，见图2。(4)在(3)的基础上，测量了不同实验组鱼的血液指标，包括肾脏、肝脏、以及IGF2 信号转导路径上的蛋白共9个指标，测定样本量为20尾鱼，结果见下表。
权利要求
1.一种含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用，按如下步骤实现(1)用人工分离和修饰的方法获得含有鲤IGF2b基因的慢病毒；(2)鲤鱼感染所述慢病毒在鲤鱼体内注射所述慢病毒；(3)用绿色荧光来确定感染是否成功感染48h后，通过荧光显微镜观测法观察绿色荧光蛋白的表达状况，成功感染慢病毒的鲤鱼体内有绿色荧光蛋白的表达。
2.根据权利要求I所述的含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用，其特征为步骤(2)中所述慢病毒的感染在幼鱼阶段完成。
3.根据权利要求I所述的含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用，其特征为步骤(2)中，在鲤鱼体重为5g时注射所述慢病毒。
4.根据权利要求I 3中任一项所述的含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用，其特征为步骤(2)中鲤鱼注射部位为背部肌肉。
5.根据权利要求I 3中任一项所述的含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用，其特征为步骤(2)中鲤鱼注射部位为背鳍最前端定点到侧线垂直距离的中间
6.根据权利要求I 3中任一项所述的含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用，其特征为还包括步骤(4):观测由于感染而引起鲤鱼性状的变化在鲤鱼感染所述慢病毒3个月后，验证鲤鱼的生长状况和血液指标状况。
全文摘要
本发明涉及一种含有鲤IGF2b基因的慢病毒在提高鲤鱼产肉量上的应用，采用含有鲤IGF2b基因的慢病毒来感染鲤特定组织中非分裂期和分裂期细胞，从而影响特定组织靶基因的表达以致其生长状况发生变化，结果显示用已检测的含有鲤IGF2b基因的慢病毒感染鲤鱼幼体，3个月后，感染组相比对照组，鲤体重获得了显著增加，同时鲤鱼血液各项指标没有影响，安全性好。
文档编号C12N7/01GK102604897SQ20121008762
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者张宁, 徐跑, 苏胜彦, 董在杰, 袁新华 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心