一株蜡状芽胞杆菌及其分泌的杀线虫蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株蜡状芽胞杆菌(Bacillus?cereus)，其代号为CM7，用于专利程序的保藏编号为CGMCC?No.4233。该菌株的发酵液中存在一种菌体分泌的蛋白物质能杀死线虫，该蛋白能通过硫酸铵沉淀和柱层析分离出来，分子量大小为38.5kD，等电点(pI)为7.77，由376个氨基酸组成。CM7菌株能稳定定殖在番茄等多种植物根内并抑制根结线虫的侵入减少结瘤，根结抑制率在90％以上。因此，该菌株制成的菌剂可以防治植物根结线虫病。
【专利说明】一株蜡状芽胞杆菌及其分泌的杀线虫蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体是涉及生物防治植物寄生线虫的技术和功能菌株的应用，主要是一株蜡状芽胞杆菌及其分泌的杀线虫蛋白物质在生物防治植物寄生线虫的应用，属于农作物防病【技术领域】。
【背景技术】
[0002]植物线虫是植物侵染性病原之一，它们寄生在各种植物的根、茎、叶、花、芽和果实上。线虫比其他重要病原一真菌、细菌、病毒等，具有主动侵袭寄主和自行转移为害的特点，它们对植物的危害，除吸取寄主的营养和对植物的组织造成机械的损伤外，主要在于现场的分泌物和唾液等，能引起植物产生一系列的生理病变，从而破坏植物的正常代谢和机能，影响生长和发育，致使植物的产量减少，品质下降，甚至死亡和绝产。根结线虫Meloidogyne spp.是严重危害农业生产的一类土传病原,可以寄生于多种农作物,尤其是蔬菜，在热带和亚热带地区造成了严重减产。近年来，随着我国温室蔬菜种植面积不断扩大，蔬菜根结线虫并的发生逐年加重，已经成为无公害温室蔬菜生产的一大障碍。多年来，国内外不断加强对根结线虫的防治工作，包括化学杀线剂的使用、选育抗病品种和生物防治等。由于化学杀线剂的使用会产生农药残留对环境造成污染以及破坏人体健康，而生物防治不会有此问题的产生，有利于环境保护、维护人类健康和维护生态平衡等优点，因此生物防治植物寄生线虫已经成为今年来研究热点。
[0003]植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各个组织和器官内部、可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生的细菌。研究表明，植物内生细菌可以在植物体内稳定定殖并且自身代谢产物可以影响到植物，因此使其具有促生作用，生防作用，非豆科植物的固氮作用以及作为外源基因的载体等生物学作用。蔡学清等(蔡学清，林彩萍，何红,等.内生枯草芽孢杆菌Bs - 2对水稻苗生长的效应[J].福建农林大学学报(自然科学版)，2005，34 (2):189—194)在研究内生枯草芽孢杆菌Bs_2菌株对水稻苗促生作用机制中发现，用该菌的菌体、不同菌液含量及外分泌物对水稻苗生长均表现出不同程度的促进作用，提高其对外界环境的抗逆性，促其生长。因此植物内生细菌作为自然界广泛存在又能稳定定殖的菌种资源在促生以及生防等方面具有广阔的应用价值。
[0004]植物线虫是植物侵染性病原之一，它们寄生在各种植物的根、茎、叶、花、芽和果实上。线虫比其他重要病原一真菌、细菌、病毒等，具有主动侵袭寄主和自行转移为害的特点，它们对植物的危害，除吸取寄主的营养和对植物的组织造成机械的损伤外，主要在于现场的分泌物和唾液等，能引起植物产生一系列的生理病变，从而破坏植物的正常代谢和机能，影响生长和发育，致使植物的产量减少，品质下降，甚至死亡和绝产。根结线虫Meloidogyne spp.是严重危害农业生产的一类土传病原,可以寄生于多种农作物,尤其是蔬菜，在热带和亚热带地区造成了严重减产。近年来，随着我国温室蔬菜种植面积不断扩大，蔬菜根结线虫并的发生逐年加重，已经成为无公害温室蔬菜生产的一大障碍。多年来，国内外不断加强对根结线虫的防治工作，包括化学杀线剂的使用、选育抗病品种和生物防治等。由于化学杀线剂的使用会产生农药残留对环境造成污染以及破坏人体健康，而生物防治不会有此问题的产生，有利于环境保护、维护人类健康和维护生态平衡等优点，因此生物防治植物寄生线虫已经成为今年来研究热点。
[0005]彭双等(彭双，杨茹，闻淑珍，陈双林.杀线虫植物内生细菌和根际放线菌对根结线虫的防效[J].植物保护学报，2012，,39(1):63-69)从六种植物体内分离出112株内生细菌，以松材线虫为靶标筛选到16株内生细菌具有杀线虫活性，其中13株内生细菌的发酵上清液对松材线虫的24h杀线虫率均达到了 100%，在番茄移栽时施入内生细菌BCM2的固体菌剂抑制根结率达到了 83.31%。
【发明内容】
[0006]为了生物防治植物寄生线虫，减少高度农药的使用，本发明提供了一株能分泌杀线虫蛋白的蜡状芽孢杆菌，以及该菌株在生防植物根结线虫的应用。[0007]本发明所说的蜡状芽胞杆菌，其代号为CM7，是蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)它的保藏编号为CGMCC N0.4233。
[0008]本发明还公开了蜡状芽胞杆菌CM7菌体分泌的杀线虫蛋白，该杀线虫蛋白能在蜡状芽胞杆菌CM7发酵液中通过常规的硫酸铵沉淀和柱层析方法分离出来，分子量和等电点测定采用常规的电泳技术方法，该杀线虫目的条带单一，共计有376个氨基酸，相对分子质量(Mr)为38.5kD,其等电点(pi)值为7.77，详见附图1。
[0009]蜡状芽胞杆菌CM7菌株能通过沾根或伤根接种方法稳定定殖在番茄等多种植物根内并抑制根系结瘤，调查结瘤抑制率防效在90%以上。因此，该菌株制成的菌剂可以防治植物根结线虫病，本发明还公开了由所述的蜡状芽胞杆菌CM7制成的杀线虫菌剂。。
[0010]本发明公开了上述蜡状芽胞杆菌CM7在防治植物根结线虫中的应用。具体的应用方法是将蜡状芽胞杆菌CM7通过人工接种方法在番茄等植物根内定殖。
[0011]蜡状芽胞杆菌CM7用于生物防治植物根结线虫的人工接种方法:可以是在番茄等植物移栽时采用常规沾根接种或菌剂施入植物根部接种的方法。
[0012]上述方法中的蜡状芽胞杆菌CM7用于沾根接种的菌悬液，是采用下述两种方法制备:方法一:选用常规发酵方法繁殖菌体，去除发酵液，留下菌体用生理盐水悬浮制成的菌悬液，含菌量用血球计数板计数达到IX IO5~5.0X IO5个.g-ι为CM7的菌悬液。方法二:干燥的菌剂1:100加入温水(20-40°C )搅拌均匀5-8小时后为菌悬液。
[0013]上述方法中的干燥菌剂的制备方法是常规发酵菌体，发酵液和载体(土壤细粉或滑石粉或麦麸细粉等)4:1比例混合均匀，40°C烘干到完全干燥，该干燥菌剂在干燥条件保臧时间是1_2年。
[0014]上述方法中的蜡状芽胞杆菌CM7用于菌剂施入植物根部接种的方法是:干燥菌剂拌入细土，比例是1:50，番茄等植物移栽时施入根部，每株植物用量30-50克。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是CM7菌株杀线虫蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中:样品I是柱层析时收集杀线虫活性最高的第一管，样品2是第二管，样品3是第三管，随着时间的延长，蛋白浓度降低。
[0016]图2:植物内生细菌CM7的16S rDNA系统发育树。
[0017]本发明所说的蜡状芽胞杆菌CM7，于2010年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)，它的保藏编号为CGMCCN0.4233。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:具杀线虫活性植物内生细菌的筛选和定殖测定
[0019]取植物材料流水清洗表面，用0.1 %升汞浸泡lmin，无菌水清洗5次后于1%NaClO中浸泡5min，再用无菌水清洗5次，转移至无菌组织匀浆器中捣碎，加入IOmL无菌水，静置5min后取上层汁液梯度稀释，各稀释度取0.1mL分别涂布NA平板，28°C培养I~7d，挑取形态不同的单菌落纯化保存。取0.1mL最后一次漂洗消毒材料的无菌水，涂平板，验证消毒是否彻底。从六种植物体内分离出112株植物内生细菌，其中有64株可以在黄瓜无菌苗中稳定定殖，接种7d定殖量均能达到IXlO5Cfu/株，其中CM7菌株能达到2X IO6Cfu/株，对照处理苗中未检测到细菌。从这64株内生细菌中筛选到16株对松材线虫具有杀线虫活性，其中CM7菌株的发酵上清液对松材线虫的24h杀线虫率达到了 100%。
[0020]取饱满的黄瓜种 子清水浸泡2h，表面消毒(方法同上)，放到装有IOmL马铃薯葡萄糖培养基的带盖试管中，25°C光照培养箱中培养7d，取子叶展开生长状况良好的试管苗，将0D600 = 0.5±0.02 (约107cell/mL)的待测菌株菌液用伤根法穿刺接种到试管苗茎基部，0.2mL/株，每菌处理3株黄瓜无菌苗，无菌水处理为空白对照。置25°C光照培养箱中培养7d，取出整株苗按照上述方法分离内生细菌，并统计内生细菌定殖数量。CM7菌株可以在黄瓜无菌苗中稳定定殖，接种7d定殖量均能达到2 X IO6Cfu/株，对照处理苗中未检测到细菌。
[0021]实施例2:CM7菌株的鉴定
[0022]CM7菌株形态学及生理生化鉴定方法按常规方法进行(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社，2001.)。菌株CM7态特征和生理生化特性见表1:菌落圆形，边缘缺刻，表面光滑干燥有光泽(似蜡)，无粘性，不透明，淡黄色，在LB液体培养基中呈混浊，不形成菌膜。
[0023]表1:杀线虫活性植物内生细菌CM7的形态特征和生理生化特性
[0024]
【权利要求】
1.一株蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus) CM7，它的保藏编号为CGMCC N0.4233 ；
2.一种由权利要求1所述的蜡状芽胞杆菌CM7菌体分泌的杀线虫蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.权利要求1所述的蜡状芽胞杆菌CM7在防治植物根结线虫中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是将蜡状芽胞杆菌CM7通过人工接种方法在植物根内定殖。
5.一种由权利要求1所述的 蜡状芽胞杆菌CM7制成的杀线虫菌剂。
【文档编号】C12R1/085GK103937720SQ201410164404
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】闫淑珍, 陈雅丽, 胡海静, 陈双林 申请人:南京师范大学