专利名称：铜绿假单胞菌泳动能力相关基因pa5001及应用的制作方法
铜绿假单胞菌泳动能力相关基因州50 /，用
技术领域：
本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌泳动能力相关基因 滞亂
背景fit^铜绿假单胞菌(尸犯油monos ae一丽a, PA)，属于假单胞菌属(Pseudomonas)，
又称为绿脓杆菌，革兰氏阴性菌，是一种在自然界(如土壤、7Mn空气)中广泛的条fm病菌。
在临床上常引誠治性反复性感染，其中生物l鹏的形成是一个重要的因素，细菌在鹏的屏障 保护作用下具剤艮强的抗药'隨抗吞噬、抗趋化作用。据J隨，60%以上微生物感染是由细菌生 物鹏誠的。
鞭毛作为主要运动器官和重要的毒力因子，对铜绿假单胞菌获得营^tl质，MW害物质， 转移到M的寄主，找到^S的固着位点和向环境扩散传播M重要作用。泳动是细菌在单端鞭 毛的推动下，单个菌体细胞妇JCM量高的环境中的运动方式，是一种个体的行为。鞭毛介导的
泳动在生t^形成的早期和形成正常的生物MM，中皿^i的作用。
目前已知至少有35个基因与鞭毛的合成和功能相关，新的鞭毛相关基因不断的被发现。对鞭 秘动能力相关基因的研究可以为揭示鞭^it动机理、研織基因的功能，探索铜绿假单胞菌的 致病机制，为药物设计^i共新的耙位点，为预防和抑制铜绿假单胞菌的感染Jii共理论依据。
发明内容本发明目的是发现与鞭^S动能力相关的新基因，以此为耙位点，设计新的抗菌药
物，预防和治疗铜^fFi单胞菌引起的感染。
本发明,的铜绿假单胞菌泳动能力相皿因尸乃OW,具有如序列，列1所示核苷,列。 战的铜绿假单胞菌泳动能力相关基因賴5,的应用，用于以该基因为新药耙点设计并制备
抑制菌#^动能力的药物，以斷氐其毒力^r病性，增强抗生素的药效。
本发明的基因iM50W获得方法是禾佣Mu转座重组技术，构建转座子插入突效库，筛选 鞭毛泳动能力丧失的突变子，提取基因组DNA，用及卵HI酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18 载体连接，舰电转化将连接产,ihA大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂在含氨精霉素和卡那 霉素双抗的LB平板上，经过PCR和酶切鉴定，筛选阳性转化子，测序确定转化子中Mu所插入 片段的核苷,列，经NCBI Blast比对确定Mu所插入的基因位置。
本发明的有^C^:
賴J膨基因Mu插入失活的突变株丧失泳动能力，说明此基因与铜绿假单胞菌鞭毛的运动有
关，而该基因是一个功能完全未知的新基因，本实验首^a现其与鞭^t动能力相关。新基因功 能的发a)t揭示鞭毛运动机制、,药物设计的耙位点，预防和治疗铜绿假单胞菌的感染都有指
图1、铜绿假单胞菌泳动能力的检测
1.野生型PA68作为阳'舰照2、賴5W/::Mu突变株 图2转化子PCR产物的电泳检测，1.DL2000 2.Mu克隆子PCR产物
以Mul和Mu2为引物，以克隆子菌液为模板，理论上可以扩增出700bp左右的特异性片段， 表明克隆子质粒中携带着Mu转座子DNA片段。 图3.克隆子酶切产物电泳图
1、 DL15000 2、质粒3、质粒酶切
具#^ 式
鄉例l:鹏Mu转^fi^bm行^^的粒
1. 从于37。C培养16 20 h的Df^平社挑取一个PA68单離，转至U含有5mL LB液体培养基 的试管中，37°C， 200rpm，过夜振荡培养14 18h。
2. 次日按1 : 100转接到含有100 mL LB液体培养基的三角瓶中，37°C， 200rpm，振荡培养约 3-5h， ^f顿752分光鹏计测定细菌;t^^在540腦处的吸爐，在ODswH).5 0.6时，停
止培养。
3. 在无菌斜牛下将菌,移到一个无菌的预冷的50mL离心管中，在冰J^置10min，使培 辨隨(TC。
4. 于4。C， 6000rim，离心10min，收集菌体。
5. 但ij出培，，用100mL预冷的300mM蔗糖重悬菌体，4°C， 6000rpm，离心10min。
6. 鼓(5),依細50 mL、 20 mL预冷的300函蔗糖溶體悬、洗涤菌体。
7. 最后将细胞溶于lmL300mM蔗糖溶液中，條成100nL/管，制备好感受态细脱悬液，冰浴 保絲用。
8. 取l&Mu转座复合物，加入到100^L感受态细脱悬液中，混匀，吸取混合物加ASU预冷的 0.2cm电转化杯中，用Bio-Rad电穿 L仗设置电压2,6kv，进行电击，记录下电击所用的电压
和时间。
9. 在电击后的转化体系中加入職37。C温浴的900^ SOC培养基中，37°C， 200 rpm，复苏lh。
10. 取适量复苏后的转化4本系涂tt含50pg/mL卡那霉素的LB平板上。37'C培养16—18 h，阴 '舰照除转化体系中不力口 Mu转座复合物外，其^1程与样品完全相同。如果在阴'M照平 fei:无M:长出，,性平^h长出的转化子进fi^—步筛选。
11. 取2^1菌液做模板，以人工Mu转座子上的特异序列Mul ( 5，-GCAACTGTCCATACTCTGA-3')和Mu2 (5，- CGCTGGGTTTATCGTCGA-3，)做引物，用 PCR方法扩增Mu转座子片段。同时分别以铜绿假单胞^0株皿粒pHTH2做阴性及阳性 对照。扩增^f牛为，先在94。C预变性15min，然后，94。C变性lmin， 55。C退火lmin， 72°C 延伸lmin,共30个循环，雜72。C延伸10min。
12. PCR产鹏0.8。/。 (W/V)琼月l^繊中电泳检测，EB染色后紫外灯下观察结果并留照片， 具有700bp卡那霉素抗性基因的转化^^有Mu转座子。
鄉例2:鹏泳动齡的糊
1. 在无菌塑料培养皿内铺上一层泳动能力检测培养基，室温下干^il夜。检观,毛泳动能力的
培养基5g/LNaCl， 10g^胰蛋白胨，0.3% (W/V)琼月離(Spanish條)，pH值调至7.2左右。
2. 从Mu转座子突^库中活化突变菌株。
3. 用无菌的牙签挑取在LB平板Jtii夜培养的PA68的Mu转座突变子，点种到泳动培养基的表 面。30°C，正置i歸16 24h。
4. 泳动能力检测细菌会依赖鞭^g动在表型检测培养基的表面以接种点为圆心向周围泳动生 长，形成一个圆环，筛选出》恸能力丧失或减弱的突变子(图l)。
^6fi例3:铜绿假单胞菌^J^J相^S因的克隆
野生型和缺陷縫因组DNA的提取
1. 从ifl羊划线培养的LB固体平社挑取单麟，接种到5mL L"broth液体培养基中，37°C， 200rpm，过夜培泰
2. 次日按l : 100的比例转擬ljl0mLL"broth液体培养基中，37°C， 200rpm，培养14-16h;
3. 将菌鹏移至一llmL离心管中，4°C， 12000iprn^离心lmin。弃去上清，麟菌体；
4. 在离心管中加入l.lmL裂解缓冲液(20mMTris.HClpH8.0， 10mMEDTA， 10mMNaCl， 20% 蔗糖)重新悬浮菌体，再加入50MLRNase (10mg/ml)， 37。C水浴lh;
5. 加入1.1 mL的2% SDS,充分振荡至溶液澄清，再加U^iL蛋白酶K (20 mg/ml)， 37。C水浴 过夜，其间经常摇动一下离心管，使蛋白酶K能充分水解蛋白；
6. 加入2.2mL的Tris饱和苯酚/氯仿l:l混合液，剧烈振荡，12000 ipm，离心20min;
7. 吸^U:层Ji7iC相转移至另一新离心管中，SOT酚/氯仿抽提3次，操作步骤同上，至蛋白抽 提干净为止；
8. 吸取上清，加入约4mL ^57jC乙醇，用玻璃棒或枪 出沉淀，置于一个新的llmL离心管中， 70%乙麟一次，尽量少带出液体，真空千燥；
9. 在抽干后的DNA中加入1.5 mlTES溶液(500mMTris'HCl， pH8.0， 5mMEDTA， 50mMNaCl) 離DNA，之后加入15jilRNase (10mg/ml)， 37。C7夂浴lh;
10. 加入1.5mlTris饱和苯酚/氯仿抽提蛋白，12000 rpm，离心15min，取上清；鼓抽提一次， 社清；力口入1.51111氯仿翻提一次，肚清；
11. 加入约4mL^7jC乙醇，.2(rC體0.5h， 4'C， 12000 rpm，离心10min;
12. 弃去上清，沉淀用lmL70y。乙^fe涤2次，真空千燥后重溶预量的TE中。0.8%的琼月識 繊电泳诚检测DNA的质散浓度。
质粒的小量提取，参照〈(MolecularCloning》(Sambrook"a/" 1989)的方法并加以改进。
1. 挑取单m^种于5mLLB液体培养基中，37。C， 180ipm，过夜振荡培养；
2. 取l-1.5mL菌液转移至一 1.5mL离心管中，體0rpm， lmin，离心麟菌体；
3. 弃去上清，菌体尽a^干，置于冰上，加入100^L预冷的溶液I，重悬沉淀，冰浴5min;
4. 加入200pL溶液II (1%SDS， 0.2mol/LNaOH)，轻轻的混合均匀至溶 的清^&粘稠，冰
浴5min，注意溶液II要mffl现配；
5. 加入150mL溶淑IL轻轻的混匀，冰浴5min;
6. 4'C， 12000ipm，离心10min，吸社清转移至另一總中；
7. 加入8MLRnase (10mg/mL)，腿37。C水浴中45min;
8. 加入约400mL的Tris饱和苯酚/氯仿/异戊醇混合液(苯酚:氯仿:异戊醇=25 : 24 : 1)抽提，4°C ， 12000ipm，离心10min，吸取上清转移至另一新管中；
9. 加入约lmL预冷的^7K乙醇，混合均匀，-20°C，艘20min;
10. 4°C， 12000ipm，离心10min，弃去上清；
11. 用lmL 70%乙麟涤沉淀一次，真空千燥，沉淀溶预量的(10-50mL) TE (pH=8.0)戯
菌水中。
12. 0.8%的琼月離 赚电泳检测提取的质粒的量，以DL15000为DNA分子量标准。 载体pUC18质粒的酶切及去磷酸化处理
用P蹄胜内切酶SflmH I酶切处理pUC18质粒，酶切的方法参见TaKaRa公司产品说明书。 此酶切产物可以直接用电泳检测酶切结果，若酶切完全，则终止反应，采用加热处理(60。C 15min) 使限制性内切酶失活。
酶切反应体系的处理
(1) 用Tris饱和苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，4°C， 12000ipm，离心10min，转移上清翻一 新离心管中；
(2) 加入l/10体积的3MNaAC(pH4.8)， 2 ^^1R预冷的^7jC乙醇，混和均匀后，于一20。C中 體30min;
(3) 4°C， 12000 rpm离心10 min， DNA沉淀用70%乙^^条两次，真空千燥。溶于适量的 TE (10mMTris.HCl,lmMEDT入pH8.0)缓冲液顿菌水中。
为防止载体自身连接反应，斷撫化时的背景，提高连皆效率，用小肠碱性磷酸单酯酶(CIAP) 除去线形化的pUC18分子5'末端磷酸。具体方法按照说明书进行。 连接、转舰筛选
1. 连接反应体系(总{科只为20^1):
基因组DNA和质粒pUCl8的连接(15^1体系)
DNA 1^L ddH20 10pL pUC18 1mL
混匀，45。C水浴5溯后，鹏冰浴，再加T4连赚1.5pL， 10xbuffer 1.5&， 14-16。C水浴过夜。
2. 连接产物的处理
(1) TE补超200ML。
(2) 加入2倍4料只的^7乂乙醇和1/10《科只的3mol/LNaAc(pH4.8)， -2(rC腿20min沉淀DNA。
(3) 4°C 12000rpm离心10min，弃上清。
(4) 加入lmL70。/。的冷乙,DNA沉淀两次，真空千燥。
(5) 沉淀溶于5^L ddH20中。14^u ddH20， lpJ酶切处離的基因组DNA， 1m1酶切处理后的 载体pUC18片段，混和均匀，45。C水^^温5min。
(6) 取出后立即置于冰上，加入2^110xT4DNALigaseBuffer, 2MlT4DNALigase，混匀，16°C 反应16-24h;
3. ，杆菌感受态细胞的制备
(1) 挑取!^羊划线培养的单麟接种于5mLLB液体培养基中，37°C， 180rpm，过夜振荡培 养；
(2) 按1 : 100的比例转接至200mL LB液体培养基中，37°C， 180rpm，振荡培养至 OD6oo=0.5^0.6，约3腳5h;
(3) 将菌、皿移至无菌的250mL离心管中，4°C， 6000^，离心10min，收集菌体；
(4) 弃去上清，加入200mL的无菌去离子7K(预冷)，塞悬沉淀，4°C， 6000rpm，离心10min;
(5) 弃去上清，加入100mL的无菌去离子水(预冷)，重复步骤(4)的操作；
(6) 加入100mL的无菌10。/。甘油(预冷)，鼓步骤4),作；
(7)加入2mL无菌10%甘油(预冷)，塞悬沉淀，1.5 ml无菌离心管中，95^17管，-70。C保存。
4. 大肠杆菌DH5a的电转化方法
(1) 5^LDNA连接产物与95pL娥杆菌感受态细胞混匀，冰浴5誦10min。
(2) 混合物转移至预冷的0.2cm电转化杯中(阴性对照不加混合物，只加感受态细胞)，在 Bio-Rad电转化^Jti體2.50kv，进行电击。
(3) 从电转化杯中吸出电转化体系，并用lmL37'C预热的SOC液体培养基(20^L胰蛋白胨， 5g/L酵娜，0.5g/LNaC120mM葡萄糖，lOmM氯化镁)稀释后，37°C， 150转/赠 培养lh。
(4) 菌液^ 布^# 20mmol/LMgSO4 50Mg/mL卡那霉素和lOOng/mL氨节青霉素的LB固 体培养基上，37。C倒置过夜赚。
5. 克隆子的筛选、鉴定
(1) 舰夜培养的双抗平肚挑取转化子，小量提取质粒，用限制性内切酶&^HI酶切，并 以pUC18&raH I酶切产物为对照。
(2) 以DL15000为DNA标准，在0.8%琼月識MK中电泳检测鉴定，钐隨同时具有pUC18 载体带和外源目的基因带的克隆子(图3)。
(3) 同时以从转化子中提取的质粒为模板，用Mu转座子DNA片段的Mu转座子检测引物 Mul和Mu2进行PCR (具体方法同实施例1中所述)。电泳检测PCR产物，以DL2000 为DNA标准，以质粒pHTH2为正对照，若能扩增出700bp的特异性带，则说明转化子 质粒中含有AXMu转座子DNA片段，克隆成功(图2)。
(4) 对阳性转化子质^i4行测序。
6. 阳性转化子质粒的DNA测序 以Mu转座子两端的反向序列为依据设计的AM42P1作为引物进行测序。委肚海英俊公司
进行DNA测序，测定转座子插入位点侧翼500bp的核苷,列。
7. 基因定位
测序结果在铜绿假单胞菌的基因组数据库(http//wwwpseudomonas.com)或GenBank (http:〃wwwncbi.nlm.nih.gov/)中BLAST进行序列t浏找到Mu所插AS因在铜绿假单胞菌基因 组中的位置。
序列表
<110>南开大学
<120>^绿假单胞菌》恸能力相錢因别50W ^ffl
<160>1
<210>1
<211>957
<212>DNA
<213,绿假单胞菌(尸sezdb附owas aerwg/應a, PA) <400>1
tcaggtaaaaatacgtcgccaggtcttctccagccatccgggacgctccggctcgcgcaa60
cgcgggccgcatggcctcgacgatactctgaccgacagcggcgaagctgaatcgttcgat120
ggccagcgcctggccgcttcgcgcgatccgctcggcgagagccgtatcgaggcgcaggat180
cgcgagcttttcctggatgtccgccaccgagcgatacagcacgatattctccatgtcccg240
gaaacccaaggcctcgttttcccgctcgccctggtcgteiggccagcagtacgcaaccgca300
ggccatcgcctcgaaattcttgatcatgtattcgcccatgccgacatccgcgctgacgaa360
gaaacggatgcggttgagcgtacgcaggtactcctcgccggacttggtcttggtcaccag420
caggttctccactccgcccaactcgtcgagcagcgccttgcgtccactgtaagccacgct480
gccggtactgccgacgaagcccagctcgatatcgcgcgccaggccc郷tcatgcaacag540
ggtctggtcgtagcccttgggcacgaataccgcgtcgaatccctcctggcgcaggcgttc600
gctgaccgtatggcccgaactgatcacccgtgcccagggcaggcgccggtaatgggcgct660
gaacttgccggtgtacttgcagggaatgtagttctggtaggcatcgtgctcgaggatcac720
caggttgggcacgctgcggatgaagcggacctggcgcatttccttcttgaaacggaggaa780
gaacaggatgcggtcgtagcgcgagacatccacgtgcttgcggaagtagccgcgc郷tc840
ggcctgctcctcgctgctcagccagcgggtatcgcactcgcaatgggcggcgatgccgtc900
gtacaggcgatccaggatcgcgcgctgctctttctggacc3gaaac3gaactttcat95权利要求
1.一种铜绿假单胞菌泳动能力相关基因PA5001，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
2、 权利要求l所述的铜绿假单胞菌泳动能力相关基因i^W/的应用，用于以该基因为新药靶点设计并制糊制菌4拟1c动能力的药物，以斷琪毒力^C病性，增强抗生素的药效。
全文摘要
本发明公开了铜绿假单胞菌泳动能力相关基因PA5001。属于微生物生物技术领域。此基因大小为957bp，目前国际上对该基因的功能尚没有报道，本实验首次发现其参与菌体的泳动能力。铜绿假单胞菌的泳动(swimming motility)是鞭毛介导的一种运动方式。本实验发现该基因的失活导致铜绿假单胞菌泳动能力丧失。铜绿假单胞菌的鞭毛及其所介导的运动能力是该菌的重要的毒力因子及致病因素。对该基因的发现及研究有助于研究铜绿假单胞菌鞭毛的运动机制，揭示铜绿假单胞菌的致病机理，为预防和治疗该菌引起的感染提供理论依据。
文档编号C12N15/31GK101368184SQ20081015228
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月10日 优先权日2008年10月10日
发明者乔明强, 刘力伟, 姚宏明, 张秀明, 徐海津, 李迎丽, 锐 牟, 白艳玲, 靳永新 申请人:南开大学