大 量的花青素，并且在功能上可与ZmCl相互替代。
[0020] 通过对比光照下高原115和Opata不同时期胚芽鞘以及暗处理胚芽鞘中花青素的 积累量、TaMYB-7D以及结构酶基因的表达模式，发现TaMYB-7D的表达与胚芽鞘中花青素的 合成以及DFR(二羟基黄酮醇还原酶）的表达成正相关。因此很有可能光诱导了 TaMYB-7D 基因的表达，TaMYB-7D蛋白进入细胞核激活DFR基因的转录，从而促进高原115胚芽鞘中花 青素的合成。利用OpataX高原115重组自交系F8代群体研宄了紫色胚芽鞘性状的遗传 规律，表明紫色和白色胚芽鞘品系的分离比为1 : 1，符合F8代理论分离比例，由此推测高 原115紫色胚芽鞘性状由完全显性的单基因控制，同时发现胚芽鞘的颜色与TaMYB-7D的表 达之间呈现共分离现象，说明它们之间是连锁的。以上结果表明TaMYB-7D是控制高原115 紫色胚芽鞘性状的主效基因。
[0021] 本发明揭示了光诱导的小麦TaMYB7D基因具有调控花青素合成代谢的MYB类转录 因子的转录活性，并且是小麦品种高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
[0022] 具体地，在一方面，本发明涉及调控花青素合成与代谢的小麦新基因 TaMYB7D，其 核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示的序列。
[0023] 优选地，基因 TaMYB7D的编码序列为SEQ ID NO :2所示的序列。
[0024] 在本发明的另一个方面，涉及基因 TaMYB7D所编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3所示的序列。
[0025] 在本发明的又一个方面，涉及一种重组载体，其包含权利要求1或2所述的基因 TaMYB7D〇
[0026] 在本发明的另一个方面，涉及一种宿主细胞，其包含权利要求1或2所述的基因 TaMYB7D或权利要求4所述的重组载体，所述宿主细胞是植物细胞或微生物细胞。
[0027] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求1或2所述的基因在转化植物获得转基因 植物中的应用。
[0028] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求1或2的基因在调控花青素合成与代谢中 的应用，其中载体pBract214的序列号为SEQ ID N0:4。
[0029] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求3所述的蛋白在调控花青素合成与代谢中 的应用，其中载体pBract214的序列号为SEQ ID N0:4。
[0030] 在本发明的另一个方面，涉及一种调控小麦中花青素合成与代谢的方法，包括将 权利要求1或2所述的基因与ZmR基因共转染到小麦中，使权利要求1或2所述的基因和 ZmR基因进行表达，其中所述ZmR基因与pBract214载体的序列为SEQ ID NO :5所示的序 列。
[0031] 在本发明的另一个方面，涉及一种培育转染权利要求1或2所述基因的植株的方 法，包括构建含权利要求1或2所述基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化小麦 细胞；和将转化的小麦细胞培育成转基因小麦。
[0032] 本发明的有益效果如下：本发明将TaMYB7D定位于小麦7D染色体上，蛋白质产 物亚细胞定位于细胞核。推导的氨基酸序列表明TaMYB3编码一个调控花青素合成代谢的 MYB类转录因子。紫色籽粒小麦品种高原115胚芽鞘中TaMYB7D能够在光的诱导下表达量 上调。瞬时表达时，TaMYB7D高原115籽粒的果皮细胞合成花青素。此外，胚芽鞘的颜色与 TaMYB-7D的表达之间呈现共分离现象，这表明TaMYB7D具有调控花青素合成代谢的转录活 性，并且是高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
【具体实施方式】
[0033] 下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例 仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。
[0034] 实施例1 :TaMYB7D基因的克隆
[0035] 所有的实验材料购自中国科学院西北高原生物研宄所。所有用于DNA和RNA提取 的样品都在取样后，液氮迅速冷冻并保存在-80冰箱中。所有的核苷酸序列测定都是在深 圳华大基因有限公司完成。DNA的提取采用CTAB法（Murray and Thompson，1980)，RNA的 提取采用改进的Trizon法（Li and Trick，2005)。质粒提取使用北京博大泰克生物基因 技术有限公司的试剂盒（中国）。核苷酸和蛋白序列比对使用软件Vector NTI Advance 10. 0(http ://www. invitrogen. com/)。蛋白系统发生树构建使用软件 MEGA 4. 0(http :// www. megasoftware· net/)。基因图绘制使用 GSDS 软件（http ://gsds. cbi. pku. edu. cn/ help.php)〇
[0036] 本发明通过拟南芥和玉米中与花青素合成相关的MYB基因 AtTT2和ZmCl序列在 普通小麦基因组测序数据库、乌拉尔图小麦（AA)基因组数据库和节节麦（DD)基因组数据 库中进行同源搜索，7AS、7BS、7DS上各存在一个与MYB基因高度同源的重叠群序列。针对 7AS、7BS、7DS上MYB基因的特异引物设计MYB基因第7同源群的保守引物TaMYB7-ATG (ATG GGGAGGAGGGCGTGCTGTGCCAAGGA)和 TaMYB7-TAA(TTAACCGGCCATGTGCAGGGACTTGAGCC)。
[0037] 在小麦品种高原115(紫色胚芽鞘）、中国春（白色胚芽鞘）、Opata(白色胚芽鞘） 和W7984基因组DNA(紫色胚芽鞘）中进行PCR扩增，琼脂糖电泳后均得到了一条约850bp 左右的条带（图1)。分别进行目的带的回收、T-载体克隆，每个品种分别送20个阳性克隆 进行测序。
[0038] 测序后序列经过拼接比对，发现在小麦品种高原115中存在三个高度同源的Rc基 因序列，而在中国春、Opata和W7984中只测到一个基因序列，在NCBI中进行blast表明 它们均为MYB基因序列。在中国春和Opata中得到的序列与高原115中的一个序列几乎 完全一致，而在W7984中得到的序列与高原115中另一个序列完全一致。为了确定该结果 是否准确，该实验从PCR扩增基因组DNA开始到最后测序均重复一次，得到的结果依然如 此。通过与基因组数据库中拿到的重叠群进行比对，将其分别命名为TaMYB-7A、TaMYB-7B、 TaMYB-7D。其中存在于高原115、中国春和Opata中的TaMYB-7A基因组序列均为866bp，且 高度相似，相似度达到99. 96%，只在第81个碱基处出现了一个G/C突变；存在于高原115 中的TaMYB-7B基因组序列为852bp ;存在于高原115和W7984中的TaMYB-7D基因组序列 完全相同，大小为872bp (图1)。
[0039] 在小麦种子萌发后3d剪取胚芽鞘并提取RNA，反转成cDNA，以微管蛋白基因 Tubulin为内标基因，利用保守全长引物TaMYB7-ATG和TaMYB7-TAA PCR扩增高原115、中 国春、Opata以及W7984胚芽鞘cDNA(图3)。从图中可以看出在高原115和W7984胚芽鞘 cDNA中扩增得到了一条750bp左右的条带，而在中国春和Opata胚芽鞘cDNA中没有扩增出 任何条带。
[0040] 实施例2 :TaMYB7D生物信息学分析
[0041] TaMYB7D的⑶S序列全长759bp，编码252个氨基酸（图4)。在其N-端有一个典 型的R2R3-MYB结构域，在R2结构域中规则分布3个色氨酸残基W，在R3结构域中规则分布 2个色氨酸残基W，同时在R3结构域中存在一个不完全相同的与bHLH蛋白作用的D/ELx 2R/ Kx3Lx6Lx3R结构元件；在C-端存在一个可能的转录激活区域。这表明TaMYB-7D有可能是一 个正调控的R2R3-MYB转录因子。
[0042] 择了已知的并进行了功能验证的MYB基因进行系统发生树分析，构建了包括金 鱼草、拟南芥、辣椒、胡萝卜、草莓、非洲菊、番茄、苹果、烟草、矮牵牛、葡萄、玉米以及小麦 中MYB转录因子的系统进化树（图5)。在系统进化树上TaMYB-7D与AtMYB12、AtTT2、 ZmCl、TaMYB10-A、TaMYB10-B、TaMYB10-D、TaMYB3、TaMYB320 聚为一类，所有这些基因均调 控植物中黄酮醇或花青素的生物合成。AtMYB12分别调控烟草咖啡酰奎宁酸和番茄黄酮 醇的合成（Luo et al.，2008)，同时也能够诱导小麦胚芽鞘中花青素的合成（Gao et al.， 2011) ;AtTT2是调控拟南芥中种皮原花青素生物合成的关键基因；TaMYB10-A、TaMYB10-B、 TaMYBlO-D与小麦红色种皮性状相关；ZmCl是玉米中发现的第一个与花青素合成有关的 MYB转录因子。这说明TaMYB-7D属于调控花青素合成类的MYB类转录因子。
[0043] TaMYB_7D的基因结构与其它植物的同源基因差异较大，在其基因结构内只含有1 个内含子，除了 TaMYB3基因外，其它调控花青素合成的MYB基因含有2个内含子（图6)。 TaMYB-7D-个内含子的丢失可能伴随着外显子区域部分编码区的删除，这可能就是导致其 编码的氨基酸序列变短的原因。TaMYB3和TaMYB-7D同时存在于小麦基因组中，分别定位于 第4和第7同源群，它们的基因结构以及在系统进化树上聚类关系都非常相似，基因编码区 序列的一致性达到74. 70%。
[0044] 实施例3 :TaMYB3蛋白的亚细胞定位
[0045] 利用带有GFP和35S启动子的pk7FWG2-R载体，将TaMYB-7D基因构建到pk7FWG2-R 载体上，通过基因枪转化法，将构建好的pk7FWG2-R-TaMYB-7D融合表达载体转入洋葱表皮 细胞。结果表明，在转化空载体pk7FWG2-R的洋葱表皮细胞中，GFP表达后激发的绿色荧光 分布于整个洋葱表皮细胞中；当转化重组质粒pk7FWG2-R-TaMYB-7D进入洋葱表皮细胞时， 只在细胞核和细胞膜上观察到绿色荧光（图7)。这表明TaMYB-7D除了定位于细胞核外，还 有可能定位于细胞膜。
[0046] 实施例4 :TaMYB3的表达受到光的诱导
[0047] 分别在恒温光照培养箱和暗培养箱中培养高原115和Opata的种子，在种子萌发 后，每隔24h观察胚芽鞘的颜色并照相。在光照条件下，高原115的种子在萌发后2d观察到 胚芽鞘中有紫色色素的积累，萌发后5d色素积累达到最大值；暗处理的高原115胚芽鞘中 几乎没有色素的积累（图8)。以微管蛋白基因 Tubulin为内标，通过RT-PCR分析了在高原 115不同时段的胚芽鞘中TaMYB-7D基因的表达模式，发现在光照条件下种子萌发后2d开始 TaMYB-7D基因均有非常强烈的表达，萌发后5d开始减弱；同时在暗处理3d的胚芽鞘中没 有TaMYB-7D基因的表达，这表明TaMYB-7D基因的表达是由光照控制的。从图8可以看出 TaMYB-7D的表达