一种改造后的犬α1-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药技术领域。更具体地，涉及一种改造后的犬α 1-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]干扰素(IFN)是在特定的诱导剂作用下，由细胞产生的一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，当它再次作用于其他细胞可以使其立即获得抗病毒，抗肿瘤等多方面的免疫力。大量体外和体内试验表明，犬α 1-干扰素对生产中具重大威胁的病毒传染病均具有防御和抑制作用。干扰素以其作用广泛、残留小等特点，有较广阔的应用前景。但是由于干扰素成本价格高和动物经济价值的问题，在兽医临床的应用还主要局限于宠物疾病的治疗，在产业动物的治疗主要局限在试验阶段，而且主要辅助治疗病毒病和寄生虫病。因此，犬α 1-干扰素的高效表达以及成本的降低意义重大。
[0003]目前，利用酵母和大肠杆菌表达干扰素的工作取得了一些成果，例如专利申请号200310109820.6公开了一种含大肠杆菌偏嗜密码子的猪α -干扰素。本发明人课题组前期的专利申请200810027952.7公开了一种经修饰的猪α -干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法，对于猪α-干扰素的制备取得了较好的成果。
[0004]虽然，利用酵母表达干扰素的工作取得了一些成果，但是对于不同的基因、不同物种来源的同源基因(基因的序列和性质等具有差别)，如何修饰干扰素基因，致使其与酵母的偏嗜性匹配，以提高干扰素的表达量；表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以及活性的测定等均有较大的差异，没有形成一个稳定的、完整的技术方案，不利于发展犬α 1-干扰素的工业化生产，不能从根本上解决犬α 1-干扰素的成本问题，影响其推广应用。
[0005]为了提高犬α 1-干扰素在毕赤酵母中的表达水平，降低生产成本，形成工业化生产条件，有必要探索一种针对犬α 1-干扰素基因进行修饰、确定修饰位点、修饰数量的方法，有必要对其诱导表达的关键条件进行改进和优化设置。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有犬α 1-干扰素制备技术的缺陷和不足，提供一种经修饰的可与毕赤酵母匹配的犬α 1-干扰素基因、建立一种可在毕赤酵母中稳定、高效表达犬α 1-干扰素的技术方法，为企业化生产犬α 1-干扰素，提高生产效率、降低生产成本奠定技术基础。
[0007]鉴于密码子的兼并性和酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，本发明对犬α 1-干扰素基因的14种关健密码子进行了修饰，使其能满足酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，但并没有改变干扰素蛋白的氨基酸和氨基酸的排列顺序，从而大大地提高了该基因在毕赤酵母中的表达水来。本发明对犬α 1-对干扰素的表达条件进行了优化，其中包括溶氧量的控制，减少污染的措施，甲醇的添加时间和添加量，诱导表达的温度和收获蛋白的时间，蛋白含量的测定方法，蛋白活性的测定扩大培养条件等。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种经修饰改造的犬α 1-干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]具体地，上述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因是对犬α 1_干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行了修饰后得到，所述14个关键密码子为Cys、Pro、Leu、Thr、Gly、Val、Gin、Ala、Ser、Asn、Phe、Asp、Lys 和 Arg 对应的密码子。
[0010]更具体地，所述14个关键密码子为为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子⑶C，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU。
[0011]一种犬α 1-干扰素表达载体，其构建使用了分泌型的表达载体PPICZa C，所述表达载体含有EcoR I和Xba I酶切位点，一个强启动子AOXl启动子，一个Zeocin抗性选择位点，强分泌信号α因子信号肽如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
[0012]其中，所述α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽和间隔肽，所述间隔肽由Iys-Arg -Glu-Ala- Glu-Ala氨基酸序列组成，Iys-ArgC端由膜结合蛋白酶ΚΕΧ2基因产物识别，-Glu-Ala-外侧由STE13基因产物识别。
[0013]一种上述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质(即犬α 1_干扰素)的制备方法，包括以下步骤:
51.根据犬α1-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成犬α 1-干扰素基因；所述引物序列如下:
上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ；
下游引物 P2:5’_ GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’ ；
上游引物Pl在其3’端加入了&…I限制性内切酶位点，下游引物Ρ2在其5’端加入了 Xba I限制性内切酶位点；并在EcoR I酶切位点的上游增加一个碱基G ；
犬α 1-干扰素基因测序正确后，对犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行修饰改造，改造的位点主要是:为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子CUC，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU ；
本发明参照酵母密码子偏爱性改造去除信号肽后的犬α 1-干扰素密码子，首先确保编码蛋白的氨基酸不会改变，在此基础上选择酵母表达系统偏爱的密码子，将原稀有密码子替换，同时考虑Α+Τ含量和G+C含量，两者过高或过低都会降低蛋白翻译效率甚至导致蛋白表达，而且不能出现提前终止的序列，综合考虑各方面因素合理的对原基因成功进行了修饰；
52.将经修饰的犬α1-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验； 53.收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；
54.测定蛋白的含量及活性。
[0014]其中，步骤S2包括以下步骤:
521.用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5 ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28?30°C，200转/min振荡过夜，至0D600=2?6，细胞处于对数生长期；
522.将步骤S21获得的细胞在3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5 ml的BMMY培养基中，控制溶氧量和防止污染，在15 ml的试管中继续振荡培养；所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY、采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5?20% ；
523.每间隔24h加入100%甲醇至终浓度为1%，加入量为每毫升BMMY培养基加10微升，进行诱导培养。
[0015]步骤S2所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，所述镜检是直接涂片镜检或用复红染色镜检。
[0016]步骤S3所述收获蛋白为培养96?120h后室温下1500?3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存；步骤S3所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。
[0017]由述制备方法制备得到的经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质，即犬α 1-干扰素，也在本发明的保护范围之内。
[0018]本发明对溶氧量的控制和减少污染的措施，是在实验表达过程中，不断摸索在保证酵母不受污染的情况下如何能更好地保持酵母的通气的前提下，通过采用四层干净纱布外加两层报纸包裹摇瓶口或试管口，既保证了通气性又保证了酵母不受污染。在摇床使用过程中还需经常进行酒精喷雾消毒以尽可能保证外界环境的无菌。同时，培养基的体积只能占培养器皿的5?20%，最高不能超过20%。
[0019]本发明对无菌检验的方法的改进包括:蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，乳白色是酵母菌正常的颜色；在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，可以直接涂片镜检，也可以用复红染色镜检。在显微镜下，没有染色的酵母菌是白色圆型的菌体，染色的酵母菌是红色圆型的菌体，没有其它形态的菌体出现，这说明培养的酵母菌没有污染。收获过程中闻酵母发酵的味道，甜的是没有污染的，如果出现很臭的味道，并且菌液颜色是暗黑的，则说明在培养过程中污染了大肠杆菌；用SDS-PAGE进行检测，干扰素蛋白只有I条20KD左右的条带，如果污染了除了目的条带之外还会出现很多其它的蛋白条带。