一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,编码蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]根结线虫是一种重要的专性寄生植物线虫，同时也是危害最为严重的植物寄生线虫之一，在全球范围内能侵染不同科的超过3000种植物(Sasser, 1980)，并造成巨大的经济损失。其中爪哇根结线虫是世界上分布范围最广的根结线虫之一，在多个国家都是农业生产中重要的有害生物(Sasser, 1980)。因此对爪哇根结线虫的特性研宄，以及其与寄主相互作用的研宄是一个非常重要且亟待研宄的课题。
[0003]在对根结线虫寄生作用的研宄中，对其产生的效应蛋白的研宄是一项非常关键且具有重大意义的课题。TTL蛋白(Transthyretin-like Proteins)家族是一类只在线虫中存在的蛋白，该蛋白家族都含有一个保守的类甲状腺素运载蛋白结构域(Transthyretin-like domain,DUF290,McCarter et al., 2003)。自从第一个 TTL 蛋白从秀丽小杆线虫(C中分离(Sonnhammer et al., 1997)，目前已从南方根结线虫{M.1ncognita，Bellaf1re et al., 2008)、大豆抱囊线虫(/Z glycines, Gao et al.,2003 )、松材线虫(Bursaphelenchusxylophi Ius,王宝文，2011)、马来布鲁线虫(Brugiamalayi, Hewitson et al., 2008)、奥氏奥斯特线虫(Ostertagia ostertagi, Saverwynset al., 2008)等多种线虫中发现了 TTL蛋白。
[0004]正如名称所不，TTL蛋白与 TTR (Transthyretin)和 TRP (Transthyretin-likeproteins)序列存在相似性(Saverwyns et al., 2008)。TTR是一类只在脊椎动物中发现的蛋白，该蛋白主要存在于血液和细胞外液中，负责运输甲状腺激素和维生素A (Hennebryet al., 2006) ;TRP广泛分布在不同生物中，如细菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物，参与调节各种生理代谢(Eneqvist et al., 2003; Lundberg et al., 2006; Sauer-Eriksson etal., 2009)，如在细菌和脊椎动物中TRP与嘌呤的代谢相关(Lee et al., 2006; Mat1lloet al., 2009)，但在植物中TRP与油菜素内酯的代谢相关(Nam et al., 2004; Li, 2005)；相反，只在线虫中发现的TTL蛋白确切的功能尚不清楚，但由于TTL与TTR和TRP存在相似性，所以推测TTL可能与激素转运和代谢(McElwee et al., 2004; Parkinson et al.,2004; Bellaf1re et al., 2008)、营养物质的消化和吸收(Furlanetto et al., 2005)或神经系统的功能(Jacob et al., 2007)有关。但是Saverwyns通过实验证实，奥氏奥斯特线虫的TTL蛋白不能实现TTR的功能(Saverwyns et al., 2008)，而且Sauer通过生物信息的方法预测，虽然TTL蛋白与TTR和TRP有同源性，但它们的功能似乎没有相似性(Sauer-Eriksson et al., 2009)。
[0005]因此，目前对于线虫TTL蛋白的认识几乎是一项空白。对于其是否能够作用于线虫寄生植物的过程、有什么作用以及作用过程和机制仍然不清楚(Bellaf1re，2008)。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有根结线虫防治技术不足以及根结线虫效应蛋白TTL的研宄不足，提供一种与爪哇根结线虫感病性相关的效应基因及其编码蛋白，为抗线虫品种植物的培育提供新靶标，对培育抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。
[0007]本发明的目的是提供一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl。
[0008]本发明另一目的是提供所述爪哇根结线虫效应基因的编码蛋白。
[0009]本发明再一目的是提供所述爪哇根结线虫效应基因及其编码蛋白的应用。
[0010]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,其DNA全长核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]本发明还公开了一种上述效应基因编码的蛋白MJ-TTL，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
[0012]在严格条件下与基因杂交且编码与爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子、与基因Mj-ttl^ 90%以上同源性且编码爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子均在本发明的保护范围之内。
[0013]一种重组载体，由基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成，所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]优选地，所述植物表达载体可以是一般表达载体或RNAi载体，可以根据需要进行选择。作为RNAi载体，优选为pTRV2载体；作为过表达载体，优选为pCambial300。
[0015]一种重组菌，包含上述重组载体。
[0016]对于含有上述爪哇根结线虫效应基因的重组基因表达盒、转基因细胞系等，也都应属于本发明的保护范围。
[0017]本发明还提供基因Mj-ttm蛋白MJ-TTL在提高植物抗根结线虫能力中的应用。包括基因在构建抗根结线虫植物中的应用。
[0018]所述构建抗根结线虫植物的具体步骤为:
51.重组表达载体pTRV2-ttl构建:
SI 1.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫RNAJf RNA反转录为cDNA ；
512.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，PCR扩增程序为95°C2min ；95°C 10s，60°C 15s，68°C lmin，30个循环；将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶feci和ZhI进行酶切，并纯化回收；
513.同时使用限制性内切酶feci和ZhI酶切载体pTRV2，并纯化回收；
514.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl;重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体5^1和ZhI酶切位点之间插入了双链DNA片段，DNA片段的序列为基因的cDNA序列的79bp?428bp，如SEQ ID NO:4所示；
52.将载体pTRVl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A;将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B ;以pTRV2空载体作对照；
53.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；将重组农杆菌A、B使用0.0lM KH2PO4重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物；
引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO: 19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ IDNO:20所示；
引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO:21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO:22所不O
[0019]本发明通过大量的研宄和探索，获得了一种爪哇根结线虫效应蛋白编码基因并明确了其功能和作用机制。该基因cDNA全长456bp，编码151个氨基酸残基的
MJ-TTL蛋白，该蛋白预测分子量为17.28KDa，等电点为5.04，含信号肽，含有一个保守的DUF290结构域；Southern杂交结果表明，在爪哇根结线虫基因组中以单拷贝形式存在。
[0020]MJ-TTL蛋白特异的在爪哇根结线虫亚腹食道腺中表达，并在寄生过程中被分泌到寄主组织中，定位在细胞质中。MJ-TTL效应蛋白的作用机理是:MJ-TTL被线虫分泌到植物中，然后与植物中的FTRc相互作用，加速植物细胞内H2O2的降解，抑制ROS的积累，从而抑制植物PTI反应的产生来促进根结线虫的侵染和寄生。因此，可以利用根结线虫基因或植物/irc基因为靶标，构建抗根结线虫转基因植物。
[0021]本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因编码蛋白及其应用。该效应基因的序列如SEQ ID NO:1?2所示，其编码蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO:
3所示。
[0022]本发明明确了基因特异的在根结线虫亚腹食道腺中表达，并被分泌到寄主组织中。同时确定了 MJ-TTL的作用机理，即该蛋白通过与植物中FTRc相互作用，增强植株对ROS的降解能力，抑制了 ROS在线虫侵染初期在植物细胞内的积累，进而抑制了植物PTI反应的发生，从而使植物对爪哇根结线虫表现出更高的感病性。
[0023]本发明为抗线虫品种植物的培育提供了一个新的靶标一一基因，对实践中培育广谱抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。同时明确的MJ-TTL的作用机理均是线虫寄生研宄中的首次