列进行比对发现，在CYP704B2基因的基因组序列第1267个碱基之后的2个G碱基缺失； 该突变位点位于第4个外显子，蛋白序列分析比对显示，该突变引起了移码突变，造成提前 终止（参见图4-a和图4-b这两张图共同组成野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因 DNA序列的比对图，反色显示位置为cyp704B2-2基因的突变位点），导致野生型中C端220 个氨基酸在2245突变体中替换为一个丙氨酸（参见图5,反色显示位置为cyp704B2-2翻译 的氨基酸序列中与野生型不同的氨基酸，短横线表示缺失的氨基酸）。
[0058] 实施例7 :突变位点分子标记设计与基因型鉴定
[0059] 根据实施例6中得到的突变位点两侧的序列设计基因特异引物：正向引物2245_ F，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；反向引物2245_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 不O
[0060] 在实施例5中所述PCR反应条件下，用上述引物对对93-11和2245突变体进行扩 增。
[0061] 扩增产物在12 %聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如 下：（1)聚丙烯酰胺胶的配制：12% PA胶80mL，10%过硫酸胺250 μ L(冬天）/125 μ L(夏 天），四甲基乙二胺（TEMED)SOyL。摇匀后灌胶。用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用酒 精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2%的R印el Silane后，再用酒精擦净、干燥，将另 一块平板涂上 0· 5% 的 Bingding Silane I. 5mL(在 I. 5ml 离心管中加入 7. 5 μ L Binding Silane和7. 5 yL冰醋酸，补足95 %乙醇至I. 5mL)。操作过程中，防止两块玻璃板相互污 染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。（2)预电泳：待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝 胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽（阴极）装入IXTBE的电极缓冲液，将聚合 的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入〇. 5XTBE的电极缓冲液。恒定功率40W-65W，预电 泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。（3)电泳：扩增产物中加入 5 μ I 5 X Loading Buffer混合后95°C变性5分钟，立亥Ij转移到冰上冷却，吸取1. 5-3 μ 1加 入上样孔；恒定功率40W-65W进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部结束。视SSR扩增产物 分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间。（4)银染显色，将带胶的一块玻璃板放 入10%的冰乙酸固定液中，65r/min振荡约30min，直至二甲苯腈全部脱色；蒸馏水冲洗2 次，每次5min ;将冲洗后的胶板放入新配制的染色液（2L水中加入2g硝酸银、3mL 37%甲 醛）中65r/min摇动30min ;将染色后的胶板放入蒸馏水冲洗5s，立即拿出进行显影；将胶 板快速转移到4°C预冷的显影液（2L水中加入30g氢氧化钠 ，IOml 37%甲醛）轻轻摇动至 带纹出现；将胶板置于10%的冰乙酸固定液中至无气泡产生为止；用蒸馏水冲洗2次，每次 2min ;室温下自然干燥后，拍照保存图像。
[0062] 结果见图6, 2245突变体的扩增产物比野生型93-11略短，与测序结果一致。
[0063] 实施例8 :基因型-突变表型共分离验证
[0064] 在2245X93-11的F2群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株各18株提取 叶片DNA，方法同实施例4。用实施例7中所述引物2245_F和2245_R进行扩增这些DNA，并 如实施例7中所述方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0065] 电泳结果见图7,表型为野生型植株扩增产物的电泳带型全部为野生型93-11或 杂合型带型，突变体扩增产物的电泳带型全部与2245 (cyp704B2-2)的带型相同。这一结果 表明实施例6中所述突变位点与隐性核雄性不育基因是共分离的。这一结果结合该突变体 的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可推断2245突变体的雄性不育表 型是由实施例6中所述的突变造成的。
[0066] 实施例9 :突变基因的杂交转育
[0067] 可按图8的步骤将2245的不育基因 cyp704B2-2通过杂交转育到其它水稻遗传背 景中：
[0068] ①杂交：
[0069] 以2245为母本，与受体水稻材料为父本杂交获得F1种子；
[0070] ②第一轮回交：
[0071] F1播种后获得F i植株，将F i植株与轮回亲本进行杂交，获得BC i种子；
[0072] ③BC1不育基因选择（前景选择）：
[0073] 播种BC1种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例4中 所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对（2245_F* 2245_R)进行扩增和电泳，选取 基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；
[0074] ④队背景选择：
[0075] 采用一组（例如100个，或200个等）在2245和轮回亲本之间存在多态的，且在 基因组上均匀分布的分子标记（可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等 类型标记），对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高（例如大于88%相 似度，或2%中选率等）的材料；
[0076] ⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC2种子；
[0077] ⑥BC2的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回 亲本相似度高于选择标准（如相似度大于98%，或2%中选率等）的BC 2R植株；
[0078] ⑦自交获得BC2F2种子：对步骤⑥中选出的BC 2植株进行自交，获得BC 2F2种子；
[0079] ⑧BC2F2的前景选择：将步骤⑦中获得的BC 2F2种子播种，获得500株以上幼苗，在 幼苗期采集采集叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对（2245_ F和2245_R)进行扩增和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合 野生型的单株；
[0080] ⑨BC2F2的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景 筛选，选出100%背景纯合的单株。如果中选单株的2245_?/2245_1?引物对扩增带型为纯合 突变体，则该单株为我们的最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它水 稻材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得不育株 用于杂交育种或制种。
【主权项】
1. 一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其为水稻CYP704B2基因第1267个碱 基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于第4个外显子。2.如权利要求1所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。3.含有权利要求1或2所述CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载体。4. 含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中 的应用。6. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不 育的转基因水稻中的应用。7. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制 种中的应用。8. 检测权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，其 特征在于，该分子标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为： 上游引物2245_F:AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示） 下游引物2245_R:TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO. 3 所示）。9. 权利要求8所述的分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。10. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法， 其特征在于，通过下述引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物： 所述引物对的核苷酸序列为： 上游引物2245_F:AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示） 下游引物2245_R:TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO. 3 所示）； 如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着该待 检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。
【专利摘要】本发明提供一种水稻CYP704B2基因突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将籼稻品种93-11经钴60辐射诱变引起水稻CYP704B2基因1267个碱基之后的2个G碱基缺失，将该CYP704B2基因突变体命名为cyp704B2-2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，进一步证实该突变体引起水稻隐性雄性核不育，可用于制备隐性雄性核不育的转基因水稻，在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/29, C12N15/63, A01H5/00, C12Q1/68
【公开号】CN104894144
【申请号】CN201510387564
【发明人】黄培劲, 李新鹏, 李京琳, 安保光, 张维, 龙湍
【申请人】海南波莲水稻基因科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月6日