专利名称：α-酮酸还原酶及其制备方法，以及使用此酶制备光学活性的α-羟基酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种新的与还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性α-酮酸还原酶(α-keto acid reductase)。本发明还涉及编码此还原酶的多核苷酸，此还原酶的制备方法，以及使用表达此还原酶的重组体制备光学活性的α-羟基酸(α-hydroxy acids)，特别是(R)-2-氯扁桃酸(chloromandelic acid)的方法。
背景技术：
一般而言，酶类不仅具有高催化活性还表现出立体特异性、底物特异性及反应特异性。除了一些特例外，酶的立体特异性几乎是绝对的。
根据近来的研究，在医药、农药、动物饲料、香料等领域使用光学活性物质的重要性正日益增长。具体地，光学异构体相互间往往具有完全不同的生理活性，因此，特异地得到光学异构体的技术是非常重要的。例如，当两个对映体中仅有一个具有所需的生理活性时，对映体混合物存在的问题不仅在于混合物中的另一个异构体不具备活性，而且还在于它可能竞争性地抑制有效对映体的共存。由于这种竞争，外消旋体的生物活性与有效对映体的生物活性相比可能大大地降低至1/2。因此，发展获得光学纯的对映体的方法(合成或拆分)是一项工业上重要的的目标。
为实现此目标，广泛采用的技术包含先合成外消旋体接着有效的光学拆分已合成的外消旋体。但是，依照此包含合成后光学拆分的技术，不期望的对映体总是作为副产物被合成出来。因而，该技术在有效的利用原料上还存在着疑问。即使回收的副产物可再生为原料，持续不断的副产物仍反复的合成出来。因此，既不产生副产物又不产生大容量废液的酶光学拆分方法已引起了注意。酶光学拆分方法是利用酶的特异性具体地生成目标对映体。此方法可抑制不必要的对映体的合成从而产生少量的不必要对映体。采用此方法的结果是，可容易地获得高光学纯度的产物。另外，此方法有利于有效地利用原料。
光学活性的α-羟基酸包括光学活性的扁桃酸，它是合成医药和农药的有用的中间体。已知的制备苯环上具有取代基团的光学活性的扁桃酸的方法包括如下·包含分级结晶外消旋体的光学拆分法(未审查已公布日本专利，申请号(JP-A)2001-72644)；·色谱光学拆分法(Journal of Chromatography，282，83-8，(1983))；·使用腈水解酶的方法(JP-A平成4-99496；JP-A平成6-237789)；·通过氧化外消旋体中的一个异构体获得光学异构体的方法(JP-A平成6-165695)；及·使用羟基腈裂解酶的方法(JP-A2001-354616)。
使用腈水解酶的方法需要扁桃腈衍生物作为原料。氰化钠是合成扁桃腈衍生物所必需的。
另外，使用羟基腈裂解酶的方法需要苯甲醛和氢氰酸作为原料。由于其毒性，氢氰酸必须小心操作。
微生物介导的不对称还原苯环无取代的苯酰甲酸(phenylglyoxylic acid)制备光学活性的扁桃酸的方法是本领域已知的(JP-A昭和57-198096；JP-A昭和57-198097；JP-A昭和63-32492；JP-A平成6-7179等)。
通过酶反应获得苯环上具有取代基的扁桃酸衍生物的光学活性物质的方法将具有重大的作用。然而，本领域还没有在工业规模上可行的酶方法。
发明概述本发明的目的是提供一种制备苯环上有取代基团的光学活性的α-羟基酸的酶方法。
本发明的另一目的是提供一种新颖的酶，它通过利用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下简称NADH)作为辅酶还原α-酮酸生成高光学纯度的α-羟基酸。本发明的另一目的是分离出一条可作为重组体的编码具有所需性能的酶的DNA。此外，本发明的另一目的是提供一种利用重组体制备光学活性的α-羟基酸的方法。
本发明揭示了肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.Dextranicum)可立体选择性地还原2-氯苯酰甲酸(2-chlorophenylglyoxylic acid)为(R)-2-氯扁桃酸。该反应的产率和立体选择性均很高。
本发明人从此菌株的去细胞提取物中纯化出电泳呈现一条单一带的可还原2-氯苯酰甲酸的酶。发明人还测定了此酶的各种性能。从而，发明人发现此酶是一种新的可还原多种类型的α-酮酸的α-酮酸还原酶。在一个还原反应中，此酶可高产率及高光学纯度的还原2-氯苯酰甲酸为(R)-2-氯扁桃酸。此外，发明人分离出编码此酶的DNA并获得了高度表达此酶的转化体。已证实此转化体可用于酶法制备光学活性的α-羟基酸，从而使本发明得以成功地完成。
如上所述，微生物介导的不对称地还原苯环无取代的苯酰甲酸制备光学活性的扁桃酸的方法是本领域已知的。然而，通常，难以预料同一种微生物可催化相似的还原反应，该反应的底物为苯环上有取代基团的苯酰甲酸。由于存在取代基的空间位阻现象、底物或微生物产物的毒性和由取代基决定的底物电子效应差异，相似反应的进程是不可预料的。
例如，如前面所述的例子所示，Candida famata IFO 0856(JP-A平成6-7179)可与无取代的苯酰甲酸衍生物反应而不能与具有式(I)的2-氯苯酰甲酸反应。由于式(I)化合物为苯环的邻位上有氯取代基的苯酰甲酸衍生物，所以本发现是令人惊讶的。更惊讶地，通过微生物生成光学活性的扁桃酸具有高的足够实用的光学纯度。
到目前为止，已知的具有NADH依赖的还原α-酮酸活性的酶包括D-乳酸脱氢酶(D-LDH)，D-α-羟基异己酸脱氢酶(D-HicDH)，及D-扁桃酸脱氢酶(D-ManDH)，它们可从乳酸菌等中高度纯化得到，并且它们的各种性能已经被阐明(Enzyme Microb.Technol.，14，28-35(1992)；Appl.Environ.Microbiol.，68，2，947-951(2002))。但是，所有的这些脱氢酶均对与α-酮酸相应的α-羟基酸显示脱氢活性。因而，表明这些已知的酶与本发明的α-酮酸还原酶相比具有不同的性能。
具体地，本发明涉及一种α-酮酸还原酶，编码此还原酶的DNA，此还原酶的制备方法，它们的用途，及α-羟基酸的制备方法(介绍如下)。
(1)一种α-酮酸还原酶，它具有如下物理化学性质(i)功能用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶还原α-酮酸生成(R)-α-羟基酸；及(ii)底物特异性
(a)在还原反应(i)中用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶；(b)还原2-氯苯酰甲酸为(R)-2-氯扁桃酸；及(c)可还原2-氯苯酰甲酸，但基本上不能使2-氯扁桃酸的两个光学异构体中的任一个脱氢；(2)根据(1)所述的α-酮酸还原酶，进一步具有如下物理化学性质(iii)最佳pHpH5.0至5.5；(iv)最佳温度45至55℃；及(v)分子量为约35,000道尔顿和约63,000道尔顿，分别由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤测定；(3)根据(1)所述的α-酮酸还原酶，它是由属于明串珠菌属(Leuconostoc)的微生物产生的；(4)根据(3)所述的α-酮酸还原酶，其中的属于明串珠菌属的微生物是肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)；(5)根据(4)所述的α-酮酸还原酶，其中的属于肠系膜明串珠菌的微生物是肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种；(6)一种编码蛋白质的多核苷酸，其中所述的蛋白质为可催化α-酮酸还原的酶，并且其中所述的多核苷酸选自包含以下的组(a)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(b)编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；(c)编码含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，其中SEQ ID NO2的一个或多个氨基酸被替代、删去、插入，和/或添加；(d)可与含有核苷酸序列SEQ ID NO1的DNA在严格的条件下杂交的多核苷酸；和(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有50％或更高的同源性的氨基酸序列的多核苷酸；(7)一种由(6)所述的多核苷酸编码的蛋白质；(8)一种重组载体，其中插入了(6)所述的多核苷酸；
(9)根据(8)所述的重组载体，其中进一步插入了编码脱氢酶的多核苷酸，该脱氢酶用β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶催化氧化-还原反应；(10)根据(9)所述的载体，其中的脱氢酶为甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase)；(11)根据(10)所述的载体，其中的甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)；(12)根据(9)所述的载体，其中的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶；(13)根据(12)所述的重组载体，其中的葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；(14)一种可表达的转化体，它含有(6)所述多核苷酸或(8)所述重组载体；(15)一种制备(7)所述蛋白质的方法，其中所述的方法包含培养(14)所述转化体和收集表达产物的步骤；(16)一种制备(1)所述的酶或(7)所述的蛋白质的方法，其中所述方法包含培养可产生(1)所述的酶或(7)所述的蛋白质的属于明串珠菌属Leuconostoc的微生物步骤；(17)根据(16)所述的方法，其中的属于明串珠菌属Leuconostoc的微生物是肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)；(18)根据(17)所述的方法，其中的属于肠系膜明串珠菌的微生物是肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种；(19)一种制备光学活性的α-羟基酸的方法，其中所述方法包括如下顺序的步骤(i)α-酮酸与(a)(1)或(2)所述的α-酮酸还原酶；(b)(7)所述的蛋白质；(c)产生所述α-酮酸还原酶或所述蛋白质的微生物；或(d)这种微生物的加工产物；反应；及(ii)收集步骤(i)产生的光学活性的α-羟基酸；(20)根据(19)所述的方法，其中α-酮酸是具有式(I)的苯酰甲酸衍生物 式(I)其中X是氢原子，碱金属，或碱土金属；及R表示在邻，间，或对位上的一个或多个取代基团，该取代基团选自卤原子，羟基，C1-3烷基，C1-3烷氧基，C1-3硫烷基(thioalkyl group)，氨基，硝基，巯基，苯基，苯氧基(phenoxy group)，并且其中所述的方法包括收集具有式(II)的光学活性的扁桃酸的步骤 式(II)其中X和R如式(I)所定义；(21)根据(20)所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的邻位被取代；(22)根据(21)所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的邻位被卤原子取代；(23)根据(20)所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的间位被取代；(24)根据(23)所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的间位被卤原子取代；(25)根据(19)所述的方法，其中α-酮酸是2-氯苯酰甲酸，光学活性的α-羟基酸是(R)-2-氯扁桃酸；(26)根据(19)所述的方法，其中的微生物是(14)所述的转化体；(27)根据(19)所述的方法，其中所述的方法还包含转化氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤；(28)根据(27)所述的方法，其中通过辅酶为氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的催化脱氢酶的作用，使氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；及(29)根据(28)所述的方法，其中辅酶为氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的催化脱氢的酶为甲酸脱氢酶和/或葡萄糖脱氢酶。
图1所示的照片描绘了用SDS-PAGE电泳的图样，电泳道1(lane 1)表示分子量标记，电泳道2为实施例1中获得的酶，箭头所示的带代表此酶。
图2所示的图表显示了pH值对实施例9中得到的酶的2-氯苯酰甲酸还原活性的影响。纵坐标表示相对酶活性(％)，最大值为100％，横坐标表示pH值。
图3所示的图表显示了温度对实施例9中得到的酶的2-氯苯酰甲酸还原活性的影响。纵坐标表示相对酶活性(％)，最大值为100％，横坐标表示温度(℃)。
图4所示的图表显示了实施例9中得到的酶对2-氯苯酰甲酸还原活性的pH稳定性。纵坐标表示相对酶活性(％)，最大值为100％，横坐标表示pH值。
图5所示的图表显示了实施例9中得到的酶对2-氯苯酰甲酸还原活性的热稳定性。纵坐标表示相对酶活性(％)，最大值为100％，横坐标表示温度(℃)。
图6描绘了质粒pSE-LMK1的构建，该质粒中嵌入了来自肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种α-酮酸还原酶的衍生基因。在质粒图中，P(trc)代表trc启动子，T(rrnB)代表rrnBT1T2终止子，amp代表抗氨卞西林(ampicillin)的β-乳糖的基因，ori代表质粒的复制起点，rop代表ROP-蛋白质基因，以及laqIq代表乳糖阻遏物，pSE-LMK1的LmKAR代表来自肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种的α-酮酸还原酶基因。
图7描绘了质粒pSE-MCF26的构建，该质粒中嵌入了来自母牛分支杆菌的基因产生的甲酸脱氢酶。在质粒图中，P(trc)代表trc启动子，T(rrnB)代表rrnBT1T2终止子，amp代表抗氨卞西林的β-乳糖的基因，ori代表质粒的复制起点，rop代表ROP-蛋白质基因，以及laqIq代表乳糖阻遏物，McFDH代表衍生自母牛分支杆菌的甲酸脱氢酶基因。
图8描绘了质粒pSE-LMK1的构建，该质粒中嵌入了来自肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种产生的α-酮酸还原酶和来自母牛分支杆菌的基因产生的甲酸脱氢酶。在质粒图中，P(trc)代表trc启动子，T(rrnB)代表rrnBT1T2终止子，amp代表抗氨卞西林的β-乳糖酶的基因，ori代表质粒的复制起点，rop代表ROP-蛋白质基因，以及laqIq代表乳糖阻遏物，McFDH代表衍生自母牛分支杆菌的甲酸脱氢酶基因，LmKAR代表衍生自肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种的α-酮酸还原酶基因。
图9描绘了质粒pSG-LMK1的构建，该质粒中嵌入了来自肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种产生的α-酮酸还原酶和来自枯草芽孢杆菌产生的葡萄糖脱氢酶基因。在质粒图中，P(trc)代表trc启动子，T(rrnB)代表rrnBT1T2终止子，amp代表抗氨卞西林的β-乳糖酶的基因，ori代表质粒的复制起点，rop代表ROP-蛋白质基因，以及laqIq代表乳糖阻遏物(lactose repressor)，BsGlcDH代表来自枯草芽孢杆菌产生的葡萄糖脱氢酶基因，LmKAR代表来自肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种的α-酮酸还原酶基因。
发明详述本发明所述的α-酮酸还原酶具有如下物理化学性质(i)功能用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶还原α-酮酸为(R)-α-羟基酸；及(ii)底物特异性(a)在还原反应(i)中用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶；(b)还原2-氯苯酰甲酸为(R)-2-氯扁桃酸；及(c)可还原2-氯苯酰甲酸，但基本上不能使2-氯扁桃酸的两个光学异构体中的任一个脱氢；优选地，本发明所述的α-酮酸还原酶还具有如下物理化学性质(iii)最佳pHpH5.0至5.5；(iv)最佳温度45至55℃；及(v)分子量为约35,000道尔顿和约63,000道尔顿，分别由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(以下简称为SDS-PAGE)和凝胶过滤测定。
本发明所述的α-酮酸还原酶可从肠系膜明串珠菌肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种获得。此来自微生物的α-酮酸还原酶基本上不能利用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(以下简称为NADPH)作为辅酶。但是，不管使用NADPH的能力如何，具有上述物理化学性质(i)和(ii)的酶均包含在本发明所述的α-酮酸还原酶内。优选地，本发明所述的α-酮酸还原酶包括还具有上述性质(iii)-(v)的酶。
本发明中，一种酶对2-氯扁桃酸的脱氢酶活性可由如下测试程序确定在30℃下培育酶，反应溶液为50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，其中含有2.5mM NAD+和1mM 2-氯扁桃酸；并测定与NADH产生相关的340nm吸收值的增长值。1U定义为一分钟内催化生成1μmol NADH所需的酶量。
另一方面，本发明中，以某种蛋白质还原2-氯苯酰甲酸的活性为相对100％活性，并且此蛋白质对2-氯扁桃酸的每一光学异构体的脱氢酶活性为20％或更低，可证实此蛋白质对2-氯扁桃酸两种光学异构体均基本缺乏脱氢酶活性。因而，“基本上不能使2-氯扁桃酸的两个光学异构体中的任一个脱氢；”表示以酶还原2-氯苯酰甲酸的活性为相对100％活性，该酶对2-氯扁桃酸的任一光学异构体的脱氢酶活性为20％或更低。
此外，以某种蛋白质对NADPH依赖地还原2-氯苯酰甲酸的活性为相对100％活性，并且此蛋白质的NADPH依赖的2-氯苯酰甲酸还原活性为20％或更低，可证实此蛋白质基本缺乏利用NADPH的能力。
根据本发明所述，NADPH依赖的2-氯苯酰甲酸还原活性可由如下测试程序确定在30℃下培育酶，反应溶液为50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)，其中含有0.2mM NADPH和1mM 2-氯苯酰甲酸；测定与NADPH减少相关的340nm吸收值的减少值。1U定义为一分钟内催化减少1μmolNADPH所需的酶量。
可选择地，本发明优选的α-酮酸还原酶具有以下特性(1)可使用NADH作为辅酶；(2)对α-羟基酸基本缺乏脱氢酶活性；及(3)使用NADH作为辅酶还原2-氯苯酰甲酸为(R)-2-氯扁桃酸，其光学纯度为99％ee(富对映体)或更高。
例如，可从属于肠球菌属(Enterococcus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，或明串珠菌属(Leuconostoc)的乳酸菌培养物中纯化得到具有上述物理化学性质的α-酮酸还原酶。本发明所述α-酮酸还原酶产量显著的微生物包括肠球菌属中的Enterococcus faecalis和Enterococcus hirae；乳杆菌属中的Lactobacillus fructivorans和Lactobacillus hilgardii；明串珠菌属中的肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种。肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种菌株可用于制备本发明所述的α-酮酸还原酶，包括ATCC 17072和NRIC 1085。
本发明所述的α-酮酸还原酶可按如下方法制得。首先，在培养基中培养上述微生物，例如通常用来培养乳酸菌的MRS培养基。然后收集足够的该微生物成熟细胞，在添加了还原剂(例如2-巯基乙醇)和蛋白酶抑制剂(例如甲苯磺酰氟)的缓冲液中溶解细胞制得去细胞提取液。根据蛋白质的溶解性(有机溶剂沉淀；硫酸铵盐析等)适当合并各馏分；阳离子交换色谱；阴离子交换色谱；凝胶过滤；疏水性色谱；和使用鳌合剂、染料、抗体等的亲合色谱可从去细胞提取液中纯化得到所需的酶。例如，可通过苯基-琼脂糖凝胶疏水色谱，Mono Q阴离子色谱，丁基-琼脂糖凝胶疏水色谱，及羟基磷灰石吸附色谱一系列处理纯化得到电泳呈现一条单一带的本发明所述的酶。
本发明涉及编码α-酮酸还原酶的多核苷酸和其同源多核苷酸。除了天然多核苷酸如DNA和RNA外，本发明所述的多核苷酸可以为含有人工核苷酸衍生物的人工分子。本发明所述的多核苷酸还可以为DNA-RNA嵌合分子。编码α-酮酸还原酶的本发明所述的多核苷酸含有核苷酸序列SEQ IDNO1。核苷酸序列SEQ ID NO1编码的蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2。包含上述氨基酸序列的蛋白质是本发明所述α-酮酸还原酶的优选实施例。
编码本发明所述α-酮酸还原酶的同源多核苷酸包括编码具有上述物理化学性质(i)和(ii)的蛋白质的多核苷酸，并且此蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，其中一个或多个氨基酸被删除、替代、插入，和/或增加。本领域普通技术人员可利用定点突变(Nucleic Acid Res.，10，6487(1982)；Methods in Enzymol.，100，448(1983)；“Molecular Cloning 2ndEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；“PCR A Practical Approach”，IRLPress，200(1991))等方法在多核苷酸序列SEQ ID NO1适当引入取代物、删除物、插入物和/或增加物，获得本发明的同源多核苷酸。
本发明所述的同源多核苷酸还包括可与含有核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸，并且多核苷酸序列SEQ ID NO1编码具有上述物理化学性质(i)和(ii)的蛋白质。术语“在严格条件下杂交的多核苷酸”是指与一个或多个探针DNAs杂交的多核苷酸，该探针含有任意选自序列SEQ ID NO1的至少20，优选至少30个连续残基序列(例如，40，60或100个连续残基)，例如，在手册所述条件下(于42℃用含有0.5xSCC的原始清洗缓冲液清洗)使用ECL直接核酸标记与检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)。
本发明所述的同源多核苷酸还包括编码与氨基酸序列SEQ ID NO2至少50％，优选至少60％，和更优选70％或更高同源性的蛋白质的多核苷酸。本发明优选的蛋白质含有与氨基酸序列SEQ ID NO2 80％或更高，85％或更高，优选90％或更高，和更优选95％或更高(例如98％或更高)同源性的氨基酸序列。例如通过英特网，依据使用程序如BLAST和FASTA的蛋白质的氨基酸序列数据库(例如，SWISS-PROT和PIR)、DNA序列数据库(例如，DDBJ，EMBL和Gene-Bank)、或从DNA序列推断氨基酸序列的数据库，可完成对蛋白质同源性的研究。
本发明的多核苷酸包括分离多核苷酸。术语“分离多核苷酸”是指与天然存在的多核苷酸相比以不同形式存在的多核苷酸。例如，分离多核苷酸包括整合到其它有机体基因组中的载体和多核苷酸。此外，分离多核苷酸包括以cDNA、PRR产物或限制酶切片断形式获得的多核苷酸。此外，编码融合蛋白质的多核苷酸的部分多核苷酸也包含于术语“分离多核苷酸”。
SWISS-PROT数据库使用BLAST程序用于研究针对氨基酸序列SEQID NO2的同源性。结果，在已知的蛋白质中，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)产生的酮泛解酸(keto pantoic acid)还原酶表现出最高的同源性。然而，酮泛解酸还原酶与本发明所述的α-酮酸还原酶具有不同的性质，并且以NADPH依赖方式还原酮泛解酸。
SEQ ID NO2与此酮泛解酸还原酶(EC 1.1.1.169)的同源分数为67/148(45％)一致和95/148(63％)阳性。由于仅根据序列的一部分计算得到同源性，因此使用Genetyx-win软件包(Software Development Co.，Ltd.)中的最大匹配程序重新计算同源性。两者间新计算得到的同源性为46％(J.Biochem，，92，1173-1177(1984))。这里所使用的术语“50％或更高同源性”是指测定的同源分数，例如，用最大匹配程序(Maximum Matching program)。
此外，本发明涉及含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质。本发明进一步包括含有氨基酸序列SEQ ID NO2的同源蛋白质。
这里所使用的术语“α-酮酸还原酶的同源物(homolog)”是指一种蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，其中一个或多个氨基酸被删除、替代、插入和/或增加，并且该蛋白质与含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质功能相当。α-酮酸还原酶的同源物可能含有突变的氨基酸序列SEQ ID NO2，例如，100个氨基酸残基或更少，通常50个残基或更少，优选30个残基或更少，更优选15个残基或更少，再更优选10个残基或更少，最优选5个氨基酸残基或更少发生突变。一般，为了维持蛋白质的功能，蛋白质的氨基酸被与原始氨基酸性质相近的氨基酸取代。上述氨基酸取代称为“保守取代”。
例如，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，Trp均为非极性氨基酸，并且具有相似的性质。不带电荷的氨基酸包括Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Gln。酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸包括Lys，Arg和His。
这里所使用的术语“与含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质功能相当”是指蛋白质具有上述的酶学性质(i)至(ii)。本领域普通技术人员可利用定点突变(site-directed mutagenesis)(Nucleic Acid Res.，10，6487(1982)；Methods in Enzymol.，100，448(1983)；“Molecular Cloning 2ndEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；“PCR A Practical Approach”，IRLPress，200(1991))等方法在多核苷酸序列SEQ ID NO1适当引入取代、删除、插入和/或添加，获得编码α-酮酸还原酶的同源物的多核苷酸。通过在宿主中导入和表达编码α-酮酸还原酶的同源物的多核苷酸可获得SEQ IDNO2的α-酮酸还原酶的同源物。
此外，这里所使用的术语“α-酮酸还原酶的同源物”是指一种具有与氨基酸序列SEQ ID NO2至少50％，优选至少60％，更优选70％或更高同源性的蛋白质。蛋白质同源性研究可依据使用程序如BLAST和FASTA的各种氨基酸数据库和DNA数据库完成。可利用的数据库包括蛋白质的氨基酸数据库，例如SWISS-PROT和PIR；DNA序列数据库，例如DDBJ、EMBL和Gene-Bank；和从DNA序列推断氨基酸序列的数据库。所有的这些数据库可通过英特网使用。
根据本发明所述，α-酮酸还原酶或其同源物可以含有其它的氨基酸序列，只要该蛋白质与含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质功能相当。例如，标记序列如组氨酸标记或HA标记可加入本发明所述的蛋白质中。可选择地，蛋白质可以以与其它蛋白质融合的形式存在。此外，本发明所述的α-酮酸还原酶或其同源物包括蛋白质片段，只要它与含有氨基酸序列SEQ IDNO2的蛋白质功能相当。
具有本发明所述的还原α-酮酸的酶活性的蛋白质可纯化为基本纯的蛋白质样品。这里所使用的术语“基本纯的蛋白质样品”是指基本上不含有其它生物分子的样品。具体地，基本纯的蛋白质样品通常干重纯度为75％或更高，或80％或更高，优选85％或更高，更优选95％或更高，再更优选99％或更高。测定蛋白质纯度的方法是本领域已知的。具体地，蛋白质的纯度可用各种柱色谱法或电泳分析法如SDS-PAGE测定。
编码本发明所述的α-酮酸还原酶的多核苷酸可通过如下方法分离得到根据核苷酸序列SEQ ID NO1设计PCR引物，并且以从还原酶生产菌株中获得的染色体DNA或cDNA文库为模板进行PCR得到本发明的DNA。
此外，用已获得的DNA片断作为探针，在(a)将来自还原酶产生菌株的染色体DNA的限制酶切片断导入噬菌体或质粒，并且用该噬菌体或载体转染大肠杆菌Escherichia coli获得的文库，或(b)通过克隆杂交，斑块杂交等方法得到的cDNA文库中筛选，制备得到本发明所述的多核苷酸。
可选择地，本发明所述的多核苷酸可通过如下方法获得分析PCR得到的DNA片断的核苷酸序列；根据已分析得到的DNA序列设计PCR引物，用于延伸已知DNA序列的外链；用适当的限制酶消化还原酶产生菌株的染色体DNA；然后以该DNA为模板通过自环化反应进行反向-PCR(Genetics，120，621-623(1988))。此外，本发明所述的多核苷酸可通过RACE法获得。(Rapid Amplification of cDNA End，“PCR Jikken Manual(Manual for PCRexperiments)”，25-33，HBJ Publishing Bureau)。
除了由上述方法克隆得到的基因组DNAs和cDNAs外，本发明所述的多核苷酸还包括合成的DNAs。
本发明所述的多核苷酸可通过上述方法从选自属于以下各属的微生物中分离得到假丝酵母属Candida隐球酵母属Cryptococcus
汉森酵母属HansenulaOgataea毕赤酵母属Pichia红冬孢酵母属Rhodosporidium红酵母属Rhodotorula糖酵母属Saccharomyces丝孢酵母属TrichosporonYamadazyma红球菌属Rhodococcus拟无枝酸菌属Amycolatopsis产碱菌属Alcaligenes节杆菌属Arthrobacter短杆菌属Brevibacterium丛毛单胞菌属Comamonas棒状杆菌属Corynebacterium肠杆菌属Enterobacter肠球菌属Enterococcus乳杆菌属Lactobacillus明串珠菌属Leuconostoc微杆菌属Microbacterium微球菌属Micrococcus变形菌属Proteus；和假单胞菌属Pseudomonas。
用上述具有式(I)的苯酰甲酸衍生物为底物，属于上述各属的微生物可产生(R)-扁桃酸衍生物。
更具体地，属于选自前面所列的各属的微生物包括Candida ernobii；Candida gropengiesseri；Candida magnoliae；清酒假丝酵母(Candida sake)；休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)；
Candida sylvatica；黄色隐球酵母(Cryptococcus flavus)；Cryptococcus humicolus；Cryptococcus marcerans；Hansenula beckii；加拿大汉逊氏酵母(Hansenula canadensis)；葡糖酶汉逊氏酵母(Hansenula glucozyma)；Ogataea pini；Pichia carsonii；Pichia fabianii；甲虫毕赤氏酵母(Pichia haplophila)；Pichia subpelliculosa；Rhodosporidium dacryodieum；Rhodosporidium diobovatum；Rhodosporidium toruloides；Rhodotorula glutinis；Rhodotorula minuta；Rhodotorula rubra；Saccharomyces cerevisiae；Trichosporon brassicae；Trichosporon pullulans；Yamadazyma castillae；Yamadazyma nakazawae var.akitaensis；Yamadazyma scolyti；Rhodococcus erythropolis；Rhodococcus fascians；Rhodococcus obuensis；Rhodococcus rhodochrous；Amycolatopsis orientalis subsp.orientalis；Alcaligenes sp.；Arthrobacter protophormiae；
Brevibacterium iodinum；Comamonas testosteroni；Corynebacterium ammoniagenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus casseliflavus；Enterococcus faecalis；Enterococcus hirae；Lactobacillus viridescens；Lactobacillus mali；Lactobacillus collinoides；Lactobacillus fructivorans；Lactobacillus hilgardii；肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种；Micrococcus luteus；Proteus vulgaris；和Pseudomonas diminuta。
所有这些微生物可产生高光学纯度的(R)-扁桃酸衍生物。
这些微生物菌株可从各个保藏单位获得。上述菌株保藏单位包括IFOOSAKA发酵研究所(Institute for Fermentation OSAKA)；DSM德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)；ATCC美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)；JCM日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms)，RIKEN(物理化学研究所The Institute of Physical and Chemical Research))；IAM应用微生物研究所(Institute of Applied Microbiology)，东京大学；和NRICNODAI培养物保藏中心(NODAI Culture Collection Center)，应用生物科学院，东京农业大学。
本领域普通技术人员还可以从各种样品中分离所需的微生物。
表达α-酮酸还原酶的载体可通过向已知的表达载体插入编码本发明所述的α-酮酸还原酶的多核苷酸而制得，其中的多核苷酸可用上述方法分离得到。
本发明所述的α-酮酸还原酶还可以从重组体获得，通过培养由这种表达载体转染的转化体。
根据本发明所述，对于用来表达α-酮酸还原酶的被转染微生物的类型没有限制，只要这些微生物可以被重组载体转染，所述重组载体含有编码具有α-酮酸还原酶活性的多肽的多核苷酸并且能表达α-酮酸还原酶。可使用的微生物包括那些已研发出宿主-载体系统的微生物，例如细菌如埃希氏菌属Escherichia，杆菌属Bacillus，假单胞菌属Pseudomonas，沙雷菌属Serratia，短杆菌属Brevibacterium，棒状杆菌属Corynebacterium，链球菌属Streptococcus，和乳杆菌属Lactobacillus；放线菌如红球菌属Rhodococcus和链霉菌属Streptomyces；酵母菌如糖酵母属Saccharomyces，克鲁维酵母属Kluyveromyces，裂殖酵母属Schizosaccharomyces，接合酵母属zygosaccharomyces，亚罗酵母属Yarrowia，丝孢酵母属Trichosporon，红冬孢酵母属Rhodosporidium，毕赤酵母属Pichia，和假丝酵母属；和真菌如链孢菌属Neurospora，曲霉属Aspergillus，头孢霉属Cephalosporium，和木霉属Trichoderma。
制备转化体和构建适合宿主的重组载体的方法可使用分子生物学、生物工程和基因工程领域通常使用的技术(例如，参见Sambrook et al.，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratories)。为了在微生物中表达编码电子供体为NADH的本发明所述的α-酮酸还原酶的基因，必需将上述DNA插入质粒载体或噬菌体载体，上述载体在微生物中是稳定的并且可以转录和翻译基因信息。
为达到上述目的，调节转录和翻译的单位—启动子位于本发明所述的DNA的上游5′末端，并且优选终止子位于此DNA的下游3′末端。启动子和终止子在用作宿主的微生物中应起到作用。对上述的各种微生物可使用的载体、启动子和终止子在“Biseibutugaku Kisokoza 8，Idenshikogaku(Fundamental Course in Microbiology(8)Genetic Engineering)”，KyoritsuShuppan，specifically for yeasts，in“Adv.Biochem.Eng.，43，75-102(1990)”和“Yeast，8，423-488(1992)”中有详细的描述。
例如，对于埃希氏菌属，特别是大肠杆菌，可使用的质粒包括pBR系列和pUC系列质粒；可使用的启动子包括来自lac(来自β-半乳糖苷酶基因)、trp(来自色氨酸操纵子)、tac和trc(它们是lac和trp的嵌合体)、λ噬菌体的PL和PR等的启动子。可使用的终止子来自trpA、噬菌体、rrnB核糖体RNA等。在可使用的表达本发明所述还原酶的各种质粒中，优选使用载体pSE420D(记载于JP-A 2000-189170)，在多克隆位点部分修饰的商业可使用的pSE420(Invitrogen)。
对于芽孢杆菌属，可使用的载体是pUB110系列和pC194系列质粒；载体可整合到宿主染色体。可使用的启动子和终止子来自apr(碱性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy(α-淀粉酶)等。
对于假单胞菌属，已为Pseudomonas putida和Pseudomonas cepacia研发出宿主-载体系统。基于参与了甲苯化合物分解的TOL质粒，可使用宽宿主带载体—pKT240(包含需要自发复制的RSF-衍生基因)。可使用来自脂肪酶基因的启动子和终止子(JP-A平成5-284973)。
对于短杆菌属，特别是Brevibacterium lactofermentum，可使用的质粒载体包括pAJ43(Gene，39，281(1985))。用于大肠杆菌Escherichia coli的启动子和终止子可不经修饰的用于短杆菌Brevibacterium。
对于棒状杆菌属，特别是Corynebacterium glutamicum，可使用的质粒如pCS11(JP-A昭和57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.，196，175(1984))。
对于链球菌，可使用的质粒载体如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.，26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.，50，94(1985))。
对于乳杆菌属，可使用的质粒载体如pAMβ1(J.Bacteriol.，137，614(1979))它曾是为链球菌属Streptococcus研发的。并且还可使用用于大肠杆菌的启动子。
对于红球菌属，可使用从Rhodococcus rhodochrous分离得到的质粒载体(J.Gen.Microbiol.，138，1003(1992))。
对于链霉菌属，质粒可根据Hopwood等人所著的“Gentic Manipulationof StreptomycesA Laboratory Mannual”(Cold Spring Harbor Laboratories，(1985))中描述方法构建。特别是对于Streptomyces lividans，可使用pIJ486(Mol.Gen.Genet.，203，468-478(1986))、pKC1064(Gene，103，97-99(1991))和pUWL-KS(Gene，165，149-150(1995))。同样的质粒还可用于Streptomyces virginiae(Actinomycetol.，11，46-53(1997))。
对于糖酵母属，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，可使用YRp系列、YEp系列、YCp系列和YIp系列质粒；整合载体(参见EP537456等)它通过含有多拷贝-核糖体基因的同源重组体而整合于染色体，可使所需的基因多拷贝，并且掺入的基因在微生物中可稳定存在。因此，这些类型的载体非常有用。可使用的启动子和终止子来自编码ADH(乙醇脱氢酶)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶)、PHO(酸性磷酸酯酶)、GAL(β-半乳糖苷酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ENO(烯醇化酶)等的基因。
对于克鲁维酵母属Kluyveromyces，特别是Kluyveromyces lactis，可使用的质粒例如来自Saccharomyces cerevisiae的2-μm质粒、pKD1系列质粒(J.Bacteriol.，145，382-390(1981))、来自pGK11并含有杀伤活性的质粒、KARS(克鲁维酵母属Kluyveromyces自主复制序列)质粒和可通过含有核糖体基因的同源重组体整合于染色体上的质粒。可使用的启动子和终止子来自ADH、PGK和其类似物。
对于裂殖酵母属Schizosaccharomyces，可使用的质粒载体包含来自Schizosaccharomyces pombe的ARS(自主复制序列)和来自Saccharomycescerevisiae的补充辅源营养的可选择标记(Mol.Cell.Biol.，6，80(1986))。可使用的启动子如来自Schizosaccharomyces pombe的ADH启动子(EMBOJ.，6，729(1987))。特别是，可从TaKaRa Shuzo Co.，Ltd.商业获得的pAUR224。
对于接合酵母属zygosaccharomyces，可使用的质粒源自那些例如来自zygosaccharomyces rouxii的pSB3(Nucleic Acids Res.，13，4267(1985))；可使用的启动子如来自Saccharomyces cerevisiae的PHO5启动子和来自zygosaccharomyces rouxii的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶)启动子(Agri.Biol.Chem.，54，2521(1990))。
对于毕赤酵母属Pichia，已为Pichia angusta(以前称为Hansenulapolymorpha)研发了一个宿主载体系统。虽然来自Pichia angusta的自主复制序列(HARS1和HARS2)可用作载体，但它们相当的不稳定。因此，多拷贝整合到染色体对于毕赤酵母属Pichia微生物是有效的(Yeast，7，431-443(1991))。另外，可使用甲醇诱导的AOX(乙醇氧化酶)和FDH(甲酸脱氢酶)诸如此类的启动子。此外，已研发出源自自主复制序列(HARS1、HARS2)的宿主-载体系统，该自主复制序列来自毕赤酵母属Pichia例如Pichia pastoris(Mol.Cell.Biol.，5，3376(1985))。并且可使用高效启动子例如甲醇诱导的AOX启动子，该启动子可用于高细胞密度培养(Nucleic Acids Res.，15，3859(1987))。
对于假丝酵母属，已为麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、白色假丝酵母Candida albicans、热带假丝酵母Candida tropicalis、产朊假丝酵母Candidautilis等研发出宿主-载体系统。已克隆出源自麦芽糖假丝酵母的自主复制序列(Agri.Biol.Chem.，51，1587(1987))，并且已为麦芽糖假丝酵母研发出使用这一序列的载体。此外，已为产朊假丝酵母研发出具有高效启动子单位的染色体-整合载体(JP-A平成08-173170)。
对于曲霉属，真菌中集中研究了黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。因而，可使用质粒载体和染色体-整合载体，以及来自细胞外蛋白酶基因和淀粉酶基因的启动子(Trends in Biotechnology，7，283-287(1989))。
对于木霉属Trichoderma，已为Trichoderma reesei研发出宿主-载体系统，并且可使用如来自细胞外纤维素酶基因的启动子(Biotechnology，7，596-603(1989))。
除了微生物还有为植物和动物研发的各种宿主-载体系统。特别是，包括为昆虫如蚕，植物如油菜籽、玉米、马铃薯等研发的系统。这些系统优选用于表达大量的外源蛋白质。
本发明涉及光学活性的α-羟基酸的制备方法，它包括步骤(1)α-酮酸与本发明所述的α-酮酸还原酶、具有所述还原酶酶活性的蛋白质、可产生所述还原酶或所述蛋白质的微生物、或上述微生物的加工产物反应；和(2)收集产生的光学活性的α-羟基酸。适于用来产生α-酮酸还原酶或具有本发明所述还原酶酶活性的蛋白质的微生物包括明串珠菌属Leuconostoc的所有菌株，具有产生此α-酮酸还原酶能力的突变体和变异体，以及由基因工程生成的具有产生本发明所述酶能力的转染菌株。期望的酶反应可通过含有α-酮酸底物的反应溶液与酶分子、酶分子的加工产物、含有酶分子的培养物、产生此酶的微生物、或此微生物的加工产物接触实现。但是，酶与反应溶液接触的方法不限于这些具体的例子。
具体地，具有产生本发明所述α-酮酸还原酶能力的微生物加工产物包括经去污剂或有机溶剂如甲苯处理细胞膜渗透性已改变的微生物；经玻璃珠或酶处理破碎微生物细胞制备去细胞提取物；并从去细胞提取物中得到部分纯化的样品。
根据酶学领域的知识可培养这些微生物。合成和天然的培养基均可使用只要这些培养基含有充足的碳源、氮源、无机物和其它营养物。液体和固体培养基均可使用。
具体地，考虑到所使用微生物的同化能力，一种或多种碳源适当的选自如下常用碳源糖类葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖；中性碳水化合物淀粉、淀粉水解产物、糖浆、黑带糖蜜、小麦、玉米等；醇类甘油、甲醇、乙醇等；脂肪酸乙酸、葡萄糖酸、丙酮酸、柠檬酸等；氨基酸甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺等；和碳水化合物常规石蜡等。
考虑到所使用微生物的同化能力，一种或多种氮源适当的选自如下常用氮源有机氮化合物肉汤；蛋白胨；酵母抽取物；大豆水解物；奶酪；酪蛋白氨基酸；各种氨基酸；玉米浸液；其他动物、植物和微生物的水解产物等；和无机氮化合物氨；铵盐如硝酸铵、硫酸铵和氯化铵；硝酸盐如硝酸钠；尿素等。
还可使用诱导剂增强微生物产生α-酮酸还原酶的能力。这些诱导剂包括的光学活性衍生物α-羟基酸和所需的α-酮酸，并且可依据所使用微生物的类型而使用。
此外，痕量的一种或多种无机盐适当的选自镁盐、锰盐、钾盐、钙盐、钠盐、铜盐、锌盐和它们的磷酸盐、盐酸盐、硝酸盐、醋酸盐等可用于培养基。而且，根据需要，可在液体培养基中加入消泡剂如植物油、去污剂和硅。
采用常用的培养方法如振荡培养、多孔旋转培养、连续培养和补料分批培养，微生物可在含有上述成分的液体培养基中培养。
根据微生物的类型、培养基、培养方法可选择适宜的培养条件。对培养条件的类型没有限制，只要菌株能增殖并且增殖的细胞具有将苯酰甲酸衍生物转化为扁桃酸衍生物的能力。
根据本发明所述，微生物通常在15-70℃温度条件下培养，优选25-40℃，调节培养起始pH值为pH4-10，优选pH6-8。对培养时间没有限制，只要可获得的微生物细胞具有将苯酰甲酸衍生物转化为扁桃酸衍生物的能力。通常，培养持续1-7天，优选1-3天。
本发明所述的上述微生物细胞的加工产物包括，例如，上述微生物的冻干细胞、丙酮脱水细胞、细胞的自溶产物、细胞提取物、破碎细胞和超声波破碎细胞。加工产物进一步包括综合使用已知方法从细胞提取物中纯化得到的酶，和可能已纯化的酶或部分纯化的酶。
此外，使用前，本发明所述的微生物细胞或它的加工产物可以被固定，例如，用已知的方法如聚丙烯酰胺法、含硫多糖凝胶法(κ-卡拉胶法，等)、藻酸胶法、琼胶法、或阴离子交换树脂法。
在确保能诱导所述酶的上述适宜的条件下培养微生物，并且向获得的液体培养基、从液体培养基中收集的细胞、或这些细胞的加工产物中加入反应底物进行使用本发明所述的酶或微生物的不对称还原反应。可选择地，在同样的培养条件下，如前述pH和温度范围，不对称还原反应可在培养微生物的1-7天同时进行。
示例的反应条件如下所示pH4.0-9.0，优选5.0-8.0；温度15-50℃，优选25-40℃；和反应时间4小时至7天。
一般而言，分别进行不对称还原反应比与培养微生物同时进行不对称还原反应能得到更佳的结果。
当不对称还原反应(asymmetric reduction)与培养微生物平行进行时，糖类、醇类或糖醇作为还原反应的能源可进行有效的反应。所述糖类包括葡萄糖、果糖和蔗糖；所述醇类包括乙醇、异丙醇和甘油；和所述糖醇包括山梨醇。还原反应中加入的作为能源的化合物的量取决于反应底物如α-酮酸的量。
当反应pH值随着还原反应能源的消耗而改变时，可使用适当的酸或碱调节pH值在某一范围内，维持改善的反应活性。
当在本发明中使用微生物活细胞时，优选在反应中加入去污剂以缩短反应时间。对于使用的去污剂类型没有限制，只要此去污剂能增加微生物活细胞的细胞膜渗透性。所述去污剂包括溴化十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲铵、Triton X-100、对-异辛基苯乙醚、吐温80和span 60，并且在反应溶液中优选使用的浓度约为0.0001％至1％。
在反应溶液中加入有机溶剂可起到相似的作用。对于使用的有机溶剂类型没有限制，只要它能增加微生物活细胞的细胞膜渗透性。所述有机溶剂包括甲苯和二甲苯，并且在反应溶液中优选使用的浓度约为0.0001％至1％。
不向反应溶液中加入去污剂或有机溶剂，而用去污剂或有机溶剂处理收集的细胞也可增加微生物细胞的细胞膜渗透性。
在有氧的条件下，本发明所述的不对称还原反应产生的常见副产物的量可能往往会增加。以防上述情况，在无氧或有限氧条件下进行反应可得到高产量的目标产物。例如，具体地，在反应中通入氮气或充满氮气下反应可使产量提高。
根据本发明所述，在光学活性的α-羟基酸制备方法中用作底物的α-酮酸包括，例如，如下所示的式(I)苯酰甲酸衍生物 式(I)其中X是氢原子，碱金属或碱土金属；和R表示选自在邻，间，或对位上的一个或多个取代基团，该取代基团选自卤原子，羟基，C1-3烷基，C1-3烷氧基，C1-3硫烷基，氨基，硝基，巯基，苯基，苯氧基。
取代基团的具体实例包括卤原子例如溴原子，氯原子，氟原子和碘原子；具有1-3个碳原子的支链或无支链低级烷基；烷氧基例如甲氧基和乙氧基；硫烷基例如硫甲基；氨基；硝基；巯基；苯基；苯氧基等。此化合物可含有一个或多个上述取代基，并且可进一步形成如低级亚烃基二氧基的环结构，例如亚甲二氧基，亚乙二氧基，亚丙二氧基。
当式(I)化合物为金属盐时(即，x是金属原子)，此金属原子可以为单价金属如钠和钾，或二价金属如钙和镁。
根据本发明所述，例如，式(I)化合物(如，底物)可为2-卤苯酰甲酸化合物如2-氯苯酰甲酸(位于邻位的R是Cl)和2-溴苯酰甲酸。
可选择地，3-卤苯酰甲酸化合物如3-氯苯酰甲酸(位于间位的R是Cl)和3-溴苯酰甲酸可在本发明中用作底物。
此外，上述化合物中的卤素在本发明中可被羟基(R是OH)或烷基(R是甲基或乙基)取代。
这些底物化合物可用常规的方法制备。如实施例中所示，2-氯苯酰甲酸可由2-氯苯甲酰氯为起始原料的2-氯苯基-氧代-乙腈合成得到。(Bull.Soc.Chim.Fr.，850，851(1959))。
用于制备本发明所述的光学活性的α-羟基酸的α-酮酸的具体实例和相应的α-羟基酸产物包括苯酰甲酸(R)-扁桃酸；2-酮异戊酸(R)-2-羟基异戊酸；2-酮异己酸(R)-2-羟基异己酸；3-氯苯酰甲酸(R)-3-氯扁桃酸；酮泛解酸(R)-泛解酸；三甲基丙酮酸(R)-2-羟基-3，3-二甲基丁酸(dimethylbutylate)；和2-氯苯酰甲酸(R)-2-氯扁桃酸。
在合适的浓度下使用本发明所述的反应底物，如α-酮酸，以确保能高效的产生所需产物。由于α-酮酸在水溶液中的溶解度很高，因此可在不抑制反应的高浓度范围内使用。反应溶液中α-酮酸的示例浓度为0.1-50％w/v，并优选1-20％w/v。α-酮酸可以任意方式添加，如，立即添加(分批操作)、逐步添加(分批补料操作)、或连续操作(补料操作(feed operation))。
这里所使用的术语“光学活性的α-羟基酸”是指α-羟基酸光学异构体中的一个的量大于另一个。根据本发明所述，优选的光学活性的α-羟基酸通常为50％ee(富对映体(enantiomeric excess))或更高的富对映体，优选80％ee或更高，更优选90％ee或更高，和再更优选95％ee或更高。例如，用光学拆分柱或类似的方法可测定光学活性的α-羟基酸的富对映体。通常，本发明所述的“光学异构体”也可称为“光学活性物质”或“对映体”。
通过利用微生物的NAD+还原能力(糖酵解，甲基营养菌C1复合同化路径，等)可由NAD+再生得到NADH，其中NAD+是由与前述还原反应有关的NADH产生。在反应系统中加入葡萄糖、乙醇、甲酸等可增强上述NAD+还原能力。可选择地，通过在反应系统加入具有将NAD+转化为NADH能力的微生物，它的加工产物或酶也可再生得到NADH。例如，使用含有葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶或有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶，等)的微生物；它的加工产物；和部分纯化或纯化的酶可实现NADH再生。NADH再生所需要的这些组分可直接或被固定在载体上后加入产生本发明所述的α-羟基酸的反应系统。可选择地，这些组分可通过NADH可渗透膜接触产生本发明所述的α-羟基酸的反应系统。
在上述制备α-羟基酸的方法中，使用被含有本发明所述的DNA的重组载体转染的微生物活细胞时，在某些情况下，可省略为了NADH再生附加的反应系统。具体地，还原反应中使用具有高NADH再生活性的微生物转化体时，不必添加用于再生NADH的酶也可有效地进行还原反应。可选择地，将编码用于再生NADH的葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶或有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶，等)的基因导入宿主，该宿主同时还具有编码本发明所述NADH依赖的α-酮酸还原酶的DNA，从而表达NADH再生酶和NADH依赖的α-酮酸还原酶，并最终得到更高效的还原反应。将两条或更多条基因导入宿主的方法包括(1)用两个或更多的重组载体转染宿主，所述载体分别插入了各自的基因并且所述载体相互间具有不同的复制起点以避免不相容性；(2)引入已插入两个(或所有)基因的单一载体；并且(3)将两个(或所有)或一个(或更多)所述基因导入宿主染色体。
当单一载体中插入了多个基因时，表达调控区，如启动子和终止子可连接于每个基因，或这些基因可表达为多顺反子操纵子如乳糖操纵子。
可使用的NADH再生酶例如来自分枝杆菌母牛分支杆菌的甲酸脱氢酶和来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶。具体地，在本发明所述方法中优选使用重组载体pSF-LMK1(含有编码α-酮酸还原酶和甲酸脱氢酶的基因)和pSG-LMK1(含有编码α-酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因)。
使用本发明所述酶的还原反应可在水；与水不混溶的有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、或正己烷；水不混溶有机溶剂与含水溶剂的两相系统；或与水混溶的有机溶剂的混合溶剂系统，如甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮或二甲亚砜中进行。可用固定的酶、膜反应器等进行本发明所述的反应。
本发明所述的反应可在反应温度4℃-60℃，优选15℃-37℃；pH值为3-11，优选5-9；底物浓度为0.01％-50％，优选0.1％-20％，更优选0.1％-10％进行。如果需要，可向反应系统加入辅酶NAD+或NADH，其浓度为0.001mM至100mM，优选0.01mM至10mM。底物可在反应起始时立即加入。但是，为了防止底物浓度变得过高，优选连续或逐步添加底物。
当葡萄糖脱氢酶用于再生NADH时，反应系统中要加入葡萄糖。同样地，当使用甲酸脱氢酶和醇脱氢酶时，要分别加入甲酸、乙醇或异丙醇。以与底物α-酮酸的摩尔比为0.1-20倍过量，并优选1-5倍过量加入这些化合物。另一方面，根据酶的活性，可加入的NADH再生酶如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶和醇脱氢酶比本发明所述的NADH依赖的α-酮酸还原酶0.1-100倍过量，并优选约0.5-20倍过量。
因此，由本发明所述的反应可不对称还原苯酰甲酸衍生物，制得光学活性的扁桃酸衍生物。所得的光学活性的扁桃酸衍生物可用常规的方法容易的分离得到。例如，光学活性的扁桃酸衍生物可按以下步骤结晶收集(1)通过离心从反应溶液中除去不溶物如细胞；(2)用适当的无机酸，如硫酸或盐酸降低反应溶液的pH值，优选至pH值约为1；和(3)用乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、己烷、苯、甲基异丁基酮、甲基叔丁基醚、二乙醚、或类似物提取后，减压浓缩提取液。
此外，为了改善反应产物的纯度，将反应浓缩物溶于少量丙酮，并经硅胶柱层析，己烷-丙酮混合溶剂为洗脱液，纯化得到高纯度的样品。可选择地，将反应物溶于热的苯、甲苯或己烷-乙酸乙酯混合溶剂中，然后冷却溶液重结晶可容易的使反应产物从杂质中分离出来。
使用本发明所述的微生物的不对称还原反应可高效的制备光学活性的α-羟基酸。使用本发明所述的方法可实现高产量。因此本发明所述的方法有利于工业应用。根据本发明所述制备得到的光学活性的α-羟基酸包括光学活性的扁桃酸衍生物是有用的光学拆分剂和合成光学活性医药和农药的原料。更具体地，光学活性的扁桃酸衍生物可用作抗血小板剂或抗肥胖药物合成和选择性结晶的中间体。
本发明提供了一种NADH依赖的α-酮酸还原酶，它可用于制备光学活性的α-羟基酸。本发明还提供了一种使用此酶由2-氯苯酰甲酸高效制备高光学纯度的(R)-2-氯扁桃酸的方法。
下面的实施例更详细地描述了本发明，但并不限定本发明的范围。本发明中引用的任何专利、专利申请和出版物均结合参考。
表格中菌株名一栏中的缩写是指以下保藏单位IFOOSAKA发酵研究所(Institute for Fermentation OSAKA)；DSM德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen)；ATCC美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)；JCM日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms)，RIKEN(物理化学研究所))；IAM应用微生物研究所(Institute of Applied Microbiology)，东京大学；和NRICNODAI培养物保藏中心(NODAI Culture Collection Center)，应用生物科学院，东京农业大学。
实施例1底物2-氯苯酰甲酸的合成在15ml甲苯中加入17.5克(0.1摩尔)2-氯苯甲酰氯，11.65克(0.13摩尔)氰化亚铜(I)，和8ml乙腈，回流3个小时，然后冷却到室温。过滤掉不溶物，然后用甲苯洗涤沉淀物。减压蒸发掉所得的滤液中的溶剂，剩余物蒸馏得到12.3克的2-氯苯基氧代乙腈(产率＝75％)。
16.5克(0.1摩尔)已制备好的2-氯苯基氧代乙腈于室温条件下，在110ml浓盐酸中培育5天，另外，还要加入1100ml水。产物混合物用酯提取，然后减压除去酯层溶剂。沉淀物在四氯化碳中重结晶，得到16.6克白色晶体。
此化合物(产率＝90％)经核磁共振氢谱、质谱和红外光谱等波谱分析确认为式(III)所示的2-氯苯酰甲酸。
式(III)实施例2酵母的筛选液体培养基(pH6.0)含有3克/升酵母提取物、3克/升麦芽提取物、20克/升葡萄糖和5克/升聚蛋白胨，将其等分到各试管中(直径为18毫米)(每只试管中4毫升)，然后在高压灭菌锅中于121℃加热灭菌15分钟。表1中列出的每一微生物菌株分别是用铂环接种入各试管中，然后在30℃振动培养48小时得到的。
2毫升所得的培养基经离心处理后收集得到微生物的细胞，再将含10毫克2-氯苯酰甲酸和10毫克葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)1毫升加入到上述的微生物的细胞中，这些细胞在30℃振动反应48小时。
经离心分离除去反应溶液中的细胞，所得到的上清液中的2-氯扁桃酸通过C18反相柱的液相色谱(Wakosil II 5C18HG4.6mm×250mm，Wako纯化学工业有限公司)定量化。柱温设定为40℃。所需的化合物用50mM磷酸盐缓冲溶液(pH2.5)∶乙腈＝3∶1进行淋洗，流动速率为1毫升/分钟，254nm的紫外吸收作为定量指标。
进一步地，用乙酸乙酯从反应溶液中提取得到2-氯扁桃酸，除掉溶剂，提取出的2-氯扁桃酸的光学纯度通过光学拆分的液相色谱柱来确定。采用Chiralcell OJ-H(CHIRALCEL OJ-H 4.6×150mm；聚甲醛化学工业有限公司)为光学拆分柱。所需的化合物用正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝85∶15∶0.1作洗脱液，流动速率为1.5毫升/分钟，以254nm的紫外吸收来评价光学纯度。
上述的分析结果列于表1中。光学活性的(R)-2-氯扁桃酸产物也得以确定。
表1菌株名 积累量(克/升) 光学活性(％)Candida sake IFO 1517 0.661100
Candida shehatae IFO 1983 0.690 100Candida silvatica IFO 103111.27 99.8Candida magonliae DSM 706380.784 92.0Candida ernobii DSM 70858 0.508 84.1Cryptococcus marcerans IFO 18703.68 100Cryptococcus flavus IFO 0407 3.06 100Cryptococcus humicolus IFO 07601.20 99.4葡糖酶汉逊氏酵母属DSM 702710.232 99.3加拿大汉逊氏酵母DSM 70281 0.271 99.1Hansenula beckii DSM 70266 0.268 87.3Ogataea pini IFO 1342 0.654 100Pichia(毕赤酵母属)fabianii IFO 12530.242 98.4Pichia carsonii DSM 70392 0.675 97.5Pichia subpelliculosa IFO 0808 0.342 94.9甲虫毕赤氏酵母DSM 703650.299 94.7Rhodosporidium(红冬孢酵母属) 1.41 100toruloides IFO 1535Rhodosporidium diobovatum IFO 1830 1.16 100Rhodosporidium toruloides IFO 0559 2.92 96.2Rhodotorula(红酵母属)rubra IFO 1000.6350383Rhodotorula glutinis IFO 0898 0.511 100酿酒酵母IFO 0203 0.166 94.0Trichosporon(丝孢酵母属)brassicae 1.49 100IFO 1584Trichosporon pullulans IFO 12320.339 100Yamadazyma castillae IFO 1823 1.21 100Yamadazyma scolyti IFO 12800.511 100
Yamadazyma nakazawae var 96.00.454akitaensis IFO 1669实施例3细菌和放线菌的筛选牛肉膏培养基(Nissui制药有限公司)等分(4毫升)到试管中(直径为18毫米)，在高压灭菌锅中以121℃加热灭菌15分钟。表2中列出的每一微生物菌株分别是用铂环接种入各试管中，然后在30℃振动培养48小时得到的。
2毫升所得的液体培养基经离心处理后收集微生物的细胞，再将含10毫克2-氯苯酰甲酸和10毫克葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)1毫升加入到上述的微生物的细胞中，这些细胞在30℃振动反应48小时。
经离心分离除去反应溶液中的细胞，所得到的上清液中的2-氯扁桃酸定量化，其光学纯度用实施例2所描述的方法确定。
上述的分析结果列于表2中。光学活性的(R)-2-氯扁桃酸产物也得以确定。
表2累计量光学活性菌株名 (克/升) (％)Amycolatopsis orientalis subsp.
orientalis IFO 12806 2.42 97.9Rhodococcus erythropolis JCM 6822 2.28 100Rhodococcus fascians IFO 120774.79 99.7Rhodococcus obuensis JCM 6048 2.72 99.4Rhodococcus rhodochrous DSM 363 1.42 100Alcaligenes sp.IAM 1015 1.47 97.8
Arthrobacter protophormiae IFO 12128 5.3198.7Brevibacterium iodinum IFO 35582.2993.4Comamonas testosteroni IFO 12048 2.4595.4Corynebacterium ammoniagenes IFO 6.9298.212072Enterobacter cloacae IFO 3320 3.0698.7Micrococcus luteus IFO 33332.00100Proteu vulgaris IFO 3851 2.49100Pseudomonas diminuta IFO 12697 2.7698.7实施例4乳酸菌的筛选MRS培养基(乳酸杆菌MRS肉汤；Difco实验室)等分(4毫升)到试管中(直径为18毫米)，在高压灭菌锅中以121℃加热灭菌15分钟。表3中列出的每一微生物菌株分别是用铂环接种入各试管中，然后在30℃振动培养48小时得到的。
2毫升所得的液体培养基经离心处理后收集到微生物的细胞，再将含10毫克2-氯苯酰甲酸和10毫克葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)1毫升加入到上述的微生物的细胞中，这些细胞在30℃振动反应48小时。
经离心分离除去反应溶液中的微生物细胞，所得到的上清液中的2-氯扁桃酸定量化，其光学纯度用实施例2所描述的方法确定。
上述的分析结果列于表3中。光学活性的(R)-2-氯扁桃酸产物也得以确定。
表3菌株名 积累量(克/升) 光学活性(％)Enterococcus casseliflavus NRIC 0106 3.63 99.0Enterococcus faecalis IFO 129663.89 99.0Enterococcus hirae ATCC 49611 1.15 98.4Lactobacillus viridescens NRIC 10733.09 99.1Lactobacillus mali NRIC 1076 2.02 99.1
Lactobacillus collinoides NRIC 1049 5.3799.0Lactobacillus fructivorans NRIC 0224 5.2298.9Lactobacillus hilgardii DSM 20051 8.0698.8肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种NRIC 1085 9.4999.1肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种ATCC 170728.8799.8实施例5能产生(S)异构体的乳酸菌的筛选MRS培养基(乳酸杆菌MRS肉汤；Difco实验室)等分(4毫升)到试管中(直径为18毫米)，在高压灭菌锅中以121℃加热灭菌15分钟。表4中列出的每一微生物菌株分别是用铂环接种入各试管中，然后在30℃振动培养48小时得到的。
2毫升所得的液体培养基经离心处理后收集到微生物的细胞，再将含10毫克2-氯苯酰甲酸和10毫克葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)1毫升加入到上述的微生物的细胞中，这些细胞在30℃振动反应48小时。
经离心分离除去反应溶液中的细胞，所得到的上清液中的2-氯扁桃酸定量化，其光学纯度用实施例2所描述的方法确定。
上述的分析结果列于表4中。光学活性的(R)-2-氯扁桃酸产物也得以确定。
表4菌株名 积累量(g/L)光学活性(％)Lactobacillus halotolerans NRIC 1627 1.32 -100肠系膜明串珠菌subsp. 2.07 -17.6cremoris IAM 1087对比实施例液体培养基(pH6.0)包含3克/升酵母提取物、3克/升麦芽提取物、20克/升葡萄糖和5克/升聚蛋白胨，将其等分到各试管中(直径为18毫米)(每只试管中4毫升)，然后在高压灭菌锅中于121℃加热灭菌15分钟。日本专利NO 03146641(JP-A平成6-7179)所描述的假丝酵母(Candida)famata菌株IFO0856用铂环接种入各试管中，然后在30℃振动培养48小时得到。
2毫升所得的培养基经离心处理后收集到微生物的细胞，再将含10毫克2-氯苯酰甲酸和10毫克葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)1毫升加入到上述的微生物的细胞中，这些细胞在30℃振动反应48小时。
经离心分离除去反应溶液中的细胞，所得到的上清液中的2-氯扁桃酸用实施例2的方法定量化。
在上清液中未能检测到2-氯扁桃酸。
实施例6底物3-氯苯酰甲酸的合成在37ml甲苯中加入43.8克(0.1摩尔)3-氯苯甲酰氯，29.1克(0.13摩尔)氰化亚铜(I)，和20ml乙腈，回流3个小时，然后冷却到室温。过滤掉不溶物，然后用甲苯洗涤沉淀物。减压蒸发掉所得的滤液中的溶剂，剩余物蒸馏得到28克的3-氯苯基氧代乙腈(3-chlorophenyloxoacetonitrile)(产率＝68％)。
15克(0.1摩尔)已制备好的3-氯苯基氧代乙腈于室温条件下，在110ml浓盐酸中反应5天，另外，还要加入1100ml水。产物混合物用酯提取，然后减压除去酯层溶剂。沉淀在四氯化碳中重结晶，得到15.1克白色晶体。
此化合物(产率＝90％)经核磁共振氢谱、质谱和红外光谱等波谱分析确认为式(III)所示的3-氯苯酰甲酸。
实施例7细菌的筛选(2)牛肉膏培养基(Bouillon medium)(Nissui制药有限公司)等分(4毫升)到试管中(直径为18毫米)，在高压灭菌锅中以121℃加热灭菌15分钟。表5中列出的每一微生物菌株分别是用铂环接种入各试管中，然后在30℃振动培养48小时得到的。
2毫升所得的液体培养基经离心处理后收集微生物的细胞，再将含10毫克3-氯苯酰甲酸和10毫克葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)1毫升加入到上述的微生物的细胞中，这些细胞在30℃振动反应48小时。
经离心分离除去反应溶液中微生物的细胞，所得到的上清液中的3-氯扁桃酸通过C18反相柱的液相色谱(Wakosil II 5C18HG4.6mm×250mm，Wako纯化学工业有限公司)定量化。用50mM磷酸盐缓冲溶液(pH2.5)∶乙腈＝3∶1作为洗脱液，流动速率为1毫升/分钟，254nm的紫外吸收作为定量指标。
此外，用乙酸乙酯从反应溶液中提取得到3-氯扁桃酸，除掉溶剂，提取出的3-氯扁桃酸的光学纯度通过光学拆分的液相色谱柱来确定。采用Chiralcell OJ-H(CHIRALCEL OJ-H4.6×150mm；Daicel化学工业有限公司)为光学拆分柱。所需的化合物用正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝85∶15∶0.1作洗脱液，流动速率为1.5毫升/分钟，以254nm的紫外吸收来评价光学纯度。
上述的分析结果列于表5中。光学活性的(R)-3-氯扁桃酸产物也得以确定。
表5菌株名 积累量(克/升)光学活性(％)Enterobacter cloacae 1.09 99.0IFO 3320Arthrobacter 3.06 98.8protophormiae IFO 12128实施例8乳酸菌的筛选(2)MRS培养基(乳酸杆菌MRS肉汤；Difco实验室)等分(4毫升)到试管中(直径为18毫米)，在高压灭菌锅中以121℃加热灭菌15分钟。表5中列出的每一微生物菌株分别是用铂环接种入各试管中，然后在30℃振动培养48小时得到的。
2毫升所得的液体培养基经离心处理后收集到微生物的细胞，再将含10毫克3-氯苯酰甲酸和10毫克葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)1毫升加入到上述的微生物的细胞中，这些细胞在30℃振动反应48小时。
经离心分离除去反应溶液中微生物的细胞，所得到的上清液中的3-氯扁桃酸定量化，其光学纯度用实施例7所描述的方法确定。
上述的分析结果列于表6中。光学活性的(R)-3-氯扁桃酸产物也得以确定。
表6菌株名 积累量(克/升) 光学活性(％)
Enterococcus faecalis IFO 12966 6.90 99.0Enterococcus casseliflavus NRIC 0106 5.44 98.8Lactobacillus collinoides NRIC 1049 0.323 98.5Lactobacillus viridescens NRIC 1073 3.00 99.1肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种NRIC 1085 3.11 99.0肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种ATCC 170724.72 99.0Lactobacillushilgardii DSM 20051 0.706 99.1Lactobacillus fructivorans NRIC 0224 0.156 98.9实施例9α-酮酸还原酶的纯化在1.2升MRS培养基(乳酸杆菌(lactobacilli)MRS肉汤，Difco实验室)中培养肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种菌株(ATCC17072)，然后离心获得细胞。所获得的湿的细胞在含0.02％2-巯基乙醇和2mM甲苯磺酰氟(PMSF)的50mL Tris-HCl缓冲溶液(pH8.5)中悬浮，再用bead beater(Biospec产品公司)挤压，然后离心分离细胞残骸，制备得到不含细胞的提取物。将硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate)加入到此不含细胞的提取物中，离心分离此混合物制备无核酸上清液。硫酸铵加入到此上清液中，最终浓度达到30％。此混合物装到苯基琼脂糖凝胶HP上(2.6cm×10cm)，以含30％硫酸铵的标准缓冲溶液(10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH为8.5)，0.01％2-巯基乙醇，10％甘油)进行平衡。用硫酸铵从30％到0％进行浓度梯度洗脱，在梯度洗脱的组分中检测到NADH依赖的2-氯苯酰甲酸还原活性，收集淋洗的峰组分，并用过滤器进行超滤浓缩。
浓缩的酶溶液对标准缓冲溶液透析。溶液装入Mono Q柱(0.5cm×0.5cm)，并用同样的缓冲溶液进行平衡。然后用浓度为0M-0.5M的氯化钠进行浓度梯度洗脱。收集淋洗的活性组分，浓缩的酶溶液用过滤器超滤进行制备。
浓缩的酶溶液从含0.01％2-巯基乙醇和10％甘油的磷酸钾缓冲溶液5mM(pH为8.0)中渗析出来。然后此溶液装入羟基磷灰石柱(0.5cm×10cm)并用相同的缓冲溶液平衡，用浓度从5mM到350mM的磷酸钾缓冲溶液(pH为8.0)梯度洗脱。洗脱的活性组分中表现出最高特异活性的组分用SDS-PAGE分析，检出了单独的一条带(图1)。
纯化酶的特异活性为3810U/mg。表7显示出了纯化的概况。
表7提纯概述提纯步骤 蛋白质酶活比活(mg) 性(U) (U/mg)不含细胞的提取物 1950 5330 2.7不含核酸上清液973 4290 4.4用苯基琼脂糖凝胶 63.0 4125 65.7柱纯化的溶液用Mono Q柱纯化7.22 2046 284的溶液用羟基磷灰石柱纯 0.108412 3810化的溶液实施例10α-酮酸还原酶分子量的确定实施例9中所得到的酶的这一亚基的分子量通过SDS-PAGE确定大约为35000道尔顿。另一方面，用Superdex G200凝胶过滤柱确定的该分子量约为63000道尔顿。
实施例11α-酮酸还原酶的最佳pH值通过使用磷酸钾缓冲溶液、醋酸钠缓冲溶液和Britten-Robinson广泛缓冲溶液改变pH值，实施例9中所得到的酶在不同的pH值条件下对2-氯苯酰甲酸的还原活性得到了确定。该活性如图2所示，以最大活性为100来定义相对活性。该反应的最佳pH值为5.0到5.5。
实施例12α-酮酸还原酶的最佳温度在标准的反应条件下，实施例9中所得到的酶在不同的温度条件下对2-氯苯酰甲酸的还原活性得到了确定。该活性如图3所示，以最大活性为100来定义相对活性。在45℃到55℃，活性为总活性的80％或更高。
实施例13α-酮酸还原酶的pH值稳定性在25℃将实施例9所得到的酶在Britten-Robinson广泛缓冲溶液中培养30分钟，测量了剩余的2-氯苯酰甲酸还原活性。所述的剩余活性如图4所示。以未处理过的样品的活性为100进行定义。在pH5到10.5，剩余活性为80％或更高。
实施例14α-酮酸还原酶的热稳定性在不同的温度下，将实施例9所得到的酶在磷酸钾缓冲溶液(pH值为8.0)中培养10分钟，确定了剩余的2-氯苯酰甲酸还原活性。所述的剩余活性如图5所示，以未处理过的样品的活性为100进行定义。在温度为50℃或更低，剩余活性为80％或更高。
实施例15α-酮酸还原酶的底物特异性将实施例9所得到的酶与不同的α-酮酸、酮。酮醇一起培育。其还原活性显示于表8中，以2-氯苯酰甲酸的还原活性为100来定义相对活性。
表8-酮酸还原酶的底物特异性底物 辅酶浓度(mM) 相对活性(％)2-氯苯酰甲酸 NADH 1 100.02-氯苯酰甲酸 NADPH 1 0.4丙酮酸 NADH 1 0.0α-酮丁酸 NADH 1 0.4α-酮戊酸 NADH 1 3.1α-酮己酸 NADH 1 4.3酮泛解酸 NADH 5 3.1α-酮异戊酸NADH 1 19.3α-酮异己酸NADH 1 14.7三甲基丙酮酸 NADH 1 0.1苯酰甲酸 NADH 1 12.9β-苯基丙酮酸 NADH 1 0.3
α-酮-4-苯基丙酮酸NADH1 0.13-氯苯酰甲酸 NADH1 4.5(R，S)-2-氯扁桃酸 NAD+1 0.022(R)-2-氯扁桃酸NAD+1 0.045实施例16使用α-酮酸还原酶合成(R)-2-氯扁桃酸将含有200mM磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)、100mM NADH、1Uα-酮酸还原酶和50mM 2-氯苯酰甲酸的溶液于25℃整夜培育。采用实施例2所述的工序，定量所得到的2-扁桃酸并确定了其光学纯度。结果显示，本发明生产的2-氯扁桃酸的R异构体纯度为99％ee，反应产率为100％。
实施例17α-酮酸还原酶的部分氨基酸序列采用蛋白质测序仪测定了实施例9所得到的酶的N端氨基酸的序列。氨基酸序列显示于SEQ ID NO3中。切下一段含α-酮酸还原酶的SDS-PAGE胶。经过两次洗涤，在35℃用赖氨酸肽链内切酶对其进行胶内彻夜消化。经消化的肽用反相HPLC(TSK胶PDS-80-Ts，2.0mm×250mm；Tosoh公司)分离处理得到肽，以乙腈的0.1％三氟乙酸溶液梯度洗脱。
两个分离的肽的峰级分分别命名为“lep_71”和“lep_72”，也用蛋白质测序仪(惠普公司G1005A蛋白质测序仪系统)分析它们的氨基酸序列。lep_71和lep_72的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO4和5中。
SEQ ID NO3/N-端氨基酸序列Met-Lys-Ile-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Arg-LeuSEQ ID NO4/lep_71Leu-Gly-Val-Met-Leu-Gln-Ala-Gly-Gly-HisSEQ ID NO5/lep_72Thr-Glu-Tle-Asp-Phe-Leu-Asn-Gly-Try-Phe实施例18从肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种中纯化染色体DNA在MRS培养基中培养肠系膜明串珠菌菌株(ATCC17072)，然后得到细胞。用J.Dairy Sci.，75，1186-1191(1992)所描述的方法纯化细胞的染色体DNA。
实施例19α-酮酸还原酶核心区域的克隆以lep_71，lep_72和N端氨基酸序列为基础合成正义引物(sense primer)和反义引物(antisense primer)。引物的核苷酸序列分别记录于SEQ ID NO6(LmKAR-N4)，SEQ ID NO7(LmKAR-71B)，SEQ ID NO8(LmKAR-71D)，SEQ ID NO9(LmKAR-72D)，SEQ ID NO 10(LmKAR-72B)。
SEQ ID NO6/LmKAR-N4CTGAAGCTTATGAARATHGCHATHGCNGGSEQ ID NO7/LmKAR-71BCAGAAGCTTTGDCCDCCDGCYTGYARCATNACSEQ ID NO8/LmKAR-71DCTGAAGCTTGGYGTHATGYTDCARGCHGGNGGSEQ ID NO9/LmKAR-72BGTCAAGCTTTADCCRTTYARRAARTCDATYTCSEQ ID NO10/LmKAR-72DCTGAAGCTTACHGARATYGAYTTYYTDAAYGG五个引物组合成为四对LmKAR-N4和LmKAR-71B、LmKAR-N4和LmKAR-72B、LmKAR-71D和LmKAR-72B、LmKAR-72D和LmKAR-71B。对反应溶液进行PCR处理，反应溶液中含有每一对引物(每一个引物为50pmol)、10nmol dNTP、50ng从明串珠菌属肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种中制得的染色体DNA、Ex-Taq缓冲溶液(TaKaRa Shuzo有限公司)和Ex-Taq 2U(TaKaRa Shuzo有限公司)，PCR的条件如下94℃进行30个循环的变性30秒，50℃退火30秒，70℃延长40秒。
等分PCR反应溶液，用琼脂糖凝胶电泳进行分析。检测到一条相应于引物对LmKAR-N4和LmKAR-71B、LmKAR-71B和LmKAR-72D的大约800bp的特异带。用苯酚/氯仿提取出这两个DNA片断，再用乙醇沉淀收集并用限制酶HindIII进行消化。然后，用Sephaglas BandPrep试剂盒纯化(Pharmacia公司)对从胶上获得的带进行琼脂糖凝胶电泳操作。
用TaKaRa绑扎试剂盒将所得到的DNA片断与pUC18(TaKaRa Shuzo有限公司)进行绑扎，pUC18已预先用HindIII消化。已绑扎的DNA转入大肠杆菌(E coli)菌株JM109中。
转化体在含有氨苄青霉素(ampicillin)(50μg/mL)的LB培养基板(1％ bacto-胰化蛋白胨、0.5％bacto-酵母菌提取物、1％氯化钠，简写为LB培养基)。用蓝/白选择法选择多个白色菌落，将其在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中培养。用Flexi-Prep(Pharmacia公司)纯化质粒。通过与LmKAR-N4和LmKAR-72B连接含有DNA片断的质粒被放大，将其标记为“pLMK1”，而通过与LmKAR-71D和LmKAR-72B连接被放大的含有DNA片断的质粒标记为“pLMK2”。
用纯化的质粒分析插入的DNA的核苷酸序列。通过PCR方法，采用BigDye终止子循环测序FS反应试剂盒(Perkin Elmer)在DNA测序仪ABIPRISMTM310(Perkin Elmer)上分析核苷酸序列。核心区域的核苷酸序列确定为如SEQ ID NO11所示。
实施例20侧接α-酮酸还原酶基因核心区域的核苷酸序列的分析用限制酶PstI和HaeII消化从肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种得到的染色体DNA，每一段消化了的片断在16℃用T4连接酶自我连接整夜循环。在50微升含有LA-Taq缓冲溶液(TaKaRa Shuzo有限公司)和LA-Taq 2U缓冲溶液(TaKaRa Shuzo有限公司)的反应溶液中，用GeneAmp PCR系统2400(Perkin Elmer)进行PCR操作，使用如下引物LMK-IPU(SEQ ID NO12)和LMK-IPD(SEQ ID NO13)(每一个100pmol)和25ng已经循环了的DNA。PCR的条件是循环30次，94℃变性30秒，55℃退火30秒72℃延长10分钟。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR的等分溶液。用PstI和HaeII消化模板DNA得到大约2500bp和4000bp的DNA片断。DNA片断用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia公司)纯化，用LMK-IPU和LMK-IPD分析核苷酸序列。如此确定α-酮酸还原酶的开放读框(ORF)。确定的DNA序列显示于SEQ ID NO1中，同时推断的氨基酸序列显示于SEQ ID NO2中。用Genetyx-win软件(软件发展有限公司)搜索ORF。
SEQ ID NO12/LMK-IPUTCACTTGCCGGCATAACTGGSEQ ID NO13/LMK-IPDGTCACAAGGCATTAAAGTTGACG
实施例21α-酮酸还原酶的克隆为克隆一段仅包含来自α-酮酸还原酶的结构基因序列的ORF的片断，合成了引物LmKAR-N5(SEQ ID NO14)和LmKAR-C(SEQ ID NO15)。使用GeneAmp PCR系统2400(Perkin Elmer)，在50μL反应溶液中进行PCR操作，该反应溶液包含一组引物(每一个50pmol)、10nmol dNTP、50ng得自肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种的染色体DNA、Pfu Turbo-DNA聚合酶缓冲溶液(STRATAGENE公司)和3.75U Pfu Turbo-DNA聚合酶(STRATAGENE)。PCR的条件为循环30次，95℃变性2分30秒，55℃退火1分钟，72℃延长1分钟。
SEQ ID NO14/LmKAR-N5GTCGAATTCTATCATGAAAATTGCAATTGCAGGATTTGGTGCACSEQ ID NO15/LmKAR-CGATAAGCTTACTAGTATTAAATTTCAAAGTTTTCTTGCTGTTTTGCTAATTTAACACG扩增的DNA片断用苯酚/氯仿提取用乙醇沉淀收集。然后，收集到的DNA片断用限制酶EcoRI和HindIII两次消化。用琼脂糖凝胶电泳检测胶上的带，用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia公司)纯化。
通过用被EcoRI和HindIII两次消化了的用TaKaRa绑扎试剂盒将纯化的DNA片断绑扎到pSE420D。pSE420D是一种质粒，它通过修饰多克隆位点的质粒带菌体pSE420D(Invitrogen；JP-A2000-189170)制备。得到的质粒转入大肠杆菌(Ecoli)菌株JM109中。
转化体在含有氨苄青霉素(ampicillin)的LB培养基板上生长。插入的核苷酸序列得到确定。所需的编码α-酮酸还原酶基因的质粒标记为pSE-LMK1。质粒构建的方法如图6所示。
实施例22用大肠杆菌(E coli)制备α-酮酸还原酶用可以表达α-还原酶的质粒pSE-LMK1转染的大肠杆菌(E coli)菌株JM109在含氨苄青霉素(ampicillin)的液体LB培养基20毫升中于30℃彻夜培养。然后加入0.1mM异丙基-1-硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)，这些细胞进一步培养4小时。
细菌的细胞通过离心分离获得，并在含有0.02％2-巯基乙醇、2mM PMSF和10％甘油的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH为8.5)中悬浮。细胞用Bioruptor UCD-200TM(Cosmo Bio公司)进行超声波降解持续3分钟。离心分离降解的细菌的细胞，收集得到的上清液作为细菌提取物。含有质粒pSE420D(对照组)不含α-酮酸还原酶基因的大肠杆菌(E coli)也在LB培养基中彻夜培养。加入IPTG后，进一步培养细胞4个小时。用上文描述的方法挤压这些细胞，然后将其用于分析2-氯苯酰甲酸的还原活性。结果如表9所示。
表9质粒的效果质粒 2-氯苯酰甲酸还原活性(U/mg蛋白质)pSE420D(对照组)0pSE-LMK1 383实施例23用于与α-酮酸还原酶和分支杆菌属(mycobacterium)产生的甲酸脱氢酶基因共表达的质粒pSF-LMK1的构建表达分支杆菌属(mycobacterium)产生的甲酸脱氢酶基因的质粒pSFR426(EP 1211316)用限制酶NcoI和EcoRI两次消化来制备含有分支杆菌属(mycobacterium)产生的甲酸脱氢酶基因的DNA片断。用TaKaRa连接试剂盒将制备的DNA片断与已经用NcoI和EcoRI两次消化的pSE420D连接，得到的质粒转入大肠杆菌(E coli)菌株JM109中。转化体在含有氨卡青霉素的液体LB培养基中培养。质粒用Qiagen Tip-500(QIAGEN公司)纯化。将含有分支杆菌属(mycobacterium)产生的甲酸脱氢酶基因的DNA片断的质粒标记为“pSE-MF26”，质粒构建的方法见图7。
pSE-MF26用两种限制酶EcoRI和HindIII两次消化，然后用TaKaRa公司的连接试剂盒将其连接到一个含有α-酮酸还原酶基因的DNA片断上，该基因是用相同的酶消化pSE-LMK1得到的。得到甲酸脱氢酶和α-酮酸还原酶共表达的质粒标记为“pSF-LMK1”。质粒的构建方法如图8所示。
实施例24
大肠杆菌中的α-酮酸还原酶和甲酸脱氢酶的共表达pSF-LMK1转化的大肠杆菌(E coli)菌株JM109在含氨苄青霉素的液体LB培养基中于30℃培养。加入IPTG然后再培育。
细菌的细胞通过离心分离获得，并在含有0.02％2-巯基乙醇、2mM PMSF和10％甘油的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH为8.5)中悬浮。细胞用Bioruptor UCD-200TM(Cosmo Bio公司)进行超声波降解持续3分钟。离心分离降解的细菌的细胞，收集得到的上清液作为细菌提取物。分析化验这种提取物对于还原2-氯苯酰甲酸和甲酸脱氢的活性。对甲酸脱氢活性的分析是于30℃在含有100mM磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)、2.5Mm NAD+、100mM甲酸和酶的反应溶液中进行的。在上述的反应条件下在1分钟内催化生成1μmol NADH的酶量定义为1U。从大肠杆菌中产生的液体粗制酶具有620U/mg蛋白质的2-氯苯酰甲酸还原活性和0.240U/mg蛋白质的甲酸盐脱氢酶活性。
实施例25用通过pSF-LMK1转染的大肠杆菌菌株HB101制备(R)-2-氯扁桃酸用pSF-LMK1转染的大肠杆菌菌株HB101在含氨苄青霉素的液体LB培养基20毫升中于30℃彻夜培养。然后加入0.1mM IPTG，这些细胞进一步培养4小时。
细菌的细胞通过离心分离获得，并在含有270mM 2-氯苯酰甲酸和540mM甲酸钠的10毫升500mM磷酸钾缓冲溶液(pH为6.5)中悬浮。悬浮液在30℃彻夜振荡反应。反应后，溶液中产生的2-氯扁桃酸的光学纯度、2-氯扁桃酸和2-氯苯酰甲酸的量经鉴定都与实施例2中所述的方法接近。产生的(R)-2-氯扁桃酸的光学纯度高于99％ee，反应产率为100％。
实施例26从枯草芽孢杆菌制得的α-酮酸还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因共表达的质粒pSG-LMK1的构建含有从枯草芽孢杆菌制得的葡萄糖脱氢基因的质粒pSE-BSG3(JP-A2000-3745931)用两种限制酶EcoRI和HindIII消化两次，用TaKaRa连接试剂盒将其与一段含有α-酮酸还原酶基因的DNA片断连接，该基因是用相同的酶消化pSE-LMK1制得的。这样就得到了α-酮酸还原酶基因和葡萄糖脱氢基因共表达的质粒，将其标记为“pSG-LMK1”。质粒的构建方法如图9所示。
实施例27大肠杆菌(E coli)中α-酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的共表达用pSG-LMK1转染大肠杆菌菌株JM109，并在含氨苄青霉素的液体LB培养基20毫升中于30℃彻夜培养。然后加入0.1mM IPTG，这些细胞进一步培养4小时。
细菌的细胞通过离心分离获得，并在含有0.5M氯化钠、0.02％2-氯巯基乙醇、2mM PMSF和10％甘油的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH为6.5)中悬浮。细胞用Bioruptor UCD-200TM(Cosmo Bio公司)进行超声波降解持续3分钟。离心分离降解的细菌的细胞，收集得到的上清液作为细菌提取物。分析化验这种提取物对于还原2-氯苯酰甲酸和葡萄糖脱氢的活性。对葡萄糖脱氢活性的分析是于30℃在含有100mM磷酸钾缓冲溶液(pH6.5)、2.5mMNAD+、100mM葡萄糖和酶的反应溶液中进行的。在上述的反应条件下在1分钟内催化生成1μmol NADH的酶量定义为1U。从大肠杆菌(E coli)中产生的液体粗制酶具有800U/mg蛋白质的2-氯苯酰甲酸还原活性和5.87U/mg蛋白质的葡萄糖脱氢酶活性。
实施例28用通过pSG-LMK1转染的大肠杆菌菌株HB101制备(R)-2-氯扁桃酸用pSG-LMK1转染的大肠杆菌菌株HB101在含氨苄青霉素的液体LB培养基20毫升中于30℃彻夜培养。然后加入0.1mM IPTG，这些细胞进一步培养4小时。
细菌的细胞通过离心分离获得，并在含有270mM2-氯苯酰甲酸和324mM葡萄糖的10毫升500mM磷酸钾缓冲溶液(pH为7.5)中悬浮。悬浮液在30℃彻夜振荡反应。反应后，溶液中产生的2-氯扁桃酸的光学纯度、2-氯扁桃酸和2-氯苯酰甲酸的量经鉴定都与实施例2中所述的方法接近。产生的(R)-2-氯扁桃酸的光学纯度高于99％ee，反应产率为70％。
虽然对本发明作了具体的描述也涉及到它的具体细节，但是很显然本领域普通技术人员可以在不偏离本发明的精神和范围的条件下进行多样的变化和修改。
序列表<110>大赛璐化学工业株式会社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD)<120>α-酮酸还原酶及其制备方法，以及使用此酶制备光学活性的α-羟基酸的方法<130>D1-A0202<140>
<141>
<160>15<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>954<212>DNA<213>肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)<220>
<221>CDS<222>(1)..(954)<400>1atg aaa ata gct att gca gga ttt ggt gca ctt ggt gca cga tta ggt 48Met Lys Ile Ala Ile Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ala Arg Leu Gly1 5 10 15gtc atg ctc cag gct ggt ggc cat gag gtt acc ggg att gat ggt tgg 96Val Met Leu Gln Ala Gly Gly His Glu Val Thr Gly Ile Asp Gly Trp20 25 30ccg gca cat att gct gct att aat aca aaa ggt tta aca gtc gtt aaa 144Pro Ala His Ile Ala Ala Ile Asn Thr Lys Gly Leu Thr Val Val Lys35 40 45gat aat gat gca cca caa aag tat ttt gta cca gtt atg ccg gca agt 192Asp Asn Asp Ala Pro Gln Lys Tyr Phe Val Pro Val Met Pro Ala Ser50 55 60gaa gtg aca ggc aca ttt gat tta att att tta ctc act aaa aca cca 240Glu Val Thr Gly Thr Phe Asp Leu Ile Ile Leu Leu Thr Lys Thr Pro65 70 75 80caa cta gac cgc atg tta aca gat att cag cct att ata acg gat act 288Gln Leu Asp Arg Met Leu Thr Asp Ile Gln Pro Ile Ile Thr Asp Thr85 90 95aca aaa tta ttg gta tta tca aac ggt ttg ggt aat att gaa gtg atg 336Thr Lys Leu Leu Val Leu Ser Asn Gly Leu Gly Asn Ile Glu Val Met
100 105 110gca aag cac gtg tca cgc cat caa att ttg gct ggt gtc aca tta tgg384Ala Lys His Val Ser Arg His Gln Ile Leu Ala Gly Val Thr Leu Trp115 120 125aca tcg tca cta ata aag cca ggt gaa ata cat gtt act ggt agt ggc432Thr Ser Ser Leu Ile Lys Pro Gly Glu Ile His Val Thr Gly Ser Gly130 135 140tct att aaa tta caa gca att ggc gat gct gat gtc caa agt ata gcg480Ser Ile Lys Leu Gln Ala Ile Gly Asp Ala Asp Val Gln Ser Ile Ala145 150 155 160gat gct ttg aat cag gct ggc tta aac gcc gaa att acc cca gat gtg528Asp Ala Leu Asn Gln Ala Gly Leu Asn Ala Glu Ile Thr Pro Asp Val165 170 175atg aca gca att tgg cat aag gca ggt atc aac gcg gtg ctc aat cct576Met Thr Ala Ile Trp His Lys Ala Gly Ile Asn Ala Val Leu Asn Pro180 185 190tta tcc gtg ttg tta aat gca aat att gct gaa ttt ggc aca gct ggc624Leu Ser Val Leu Leu Asn Ala Asn Ile Ala Glu Phe Gly Thr Ala Gly195 200 205aat gcc atg gat cta gca ttg aat att cta gat gag atg aag caa gtt672Asn Ala Met Asp Leu Ala Leu Asn Ile Leu Asp Glu Met Lys Gln Val210 215 220ggt gcg tca caa ggc att aaa gtt gac gtt agt ggt att atg acg gac720Gly Ala Ser Gln Gly Ile Lys Val Asp Val Ser Gly Ile Met Thr Asp225 230 235 240ttg agt cag tta ctt aaa cca gaa aat gca ggt aat cat ttt ccg tca768Leu Ser Gln Leu Leu Lys Pro Glu Asn Ala Gly Asn His Phe Pro Ser245 250 255atg tac caa gat att caa aat ggt aaa cgt act gaa att gat ttc ttg816Met Tyr Gln Asp Ile Gln Asn Gly Lys Arg Thr Glu Ile Asp Phe Leu260 265 270aat ggt tac ttt gcc aag ata gga cac gaa tct ggc att ccg acc cct864Asn Gly Tyr Phe Ala Lys Ile Gly His Glu Ser Gly Ile Pro Thr Pro275 280 285ttc aat gcc tta gtg aca cgg tta att cat gct aag gaa gat att gaa912Phe Asn Ala Leu Val Thr Arg Leu Ile His Ala Lys Glu Asp Ile Glu290 295 300cgt gtt aaa tta gca aaa cag caa gaa aac ttt gaa att tga954Arg Val Lys Leu Ala Lys Gln Gln Glu Asn Phe Glu Ile
305 310 315<210>2<211>317<212>PRT<213>肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)<400>2Met Lys Ile Ala Ile Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ala Arg Leu Gly1 5 10 15Val Met Leu Gln Ala Gly Gly His Glu Val Thr Gly Ile Asp Gly Trp20 25 30Pro Ala His Ile Ala Ala Ile Asn Thr Lys Gly Leu Thr Val Val Lys35 40 45Asp Asn Asp Ala Pro Gln Lys Tyr Phe Val Pro Val Met Pro Ala Ser50 55 60Glu Val Thr Gly Thr Phe Asp Leu Ile Ile Leu Leu Thr Lys Thr Pro65 70 75 80Gln Leu Asp Arg Met Leu Thr Asp Ile Gln Pro Ile Ile Thr Asp Thr85 90 95Thr Lys Leu Leu Val Leu Ser Asn Gly Leu Gly Asn Ile Glu Val Met100 105 110Ala Lys His Val Ser Arg His Gln Ile Leu Ala Gly Val Thr Leu Trp115 120 125Thr Ser Ser Leu Ile Lys Pro Gly Glu Ile His Val Thr Gly Ser Gly130 135 140Ser Ile Lys Leu Gln Ala Ile Gly Asp Ala Asp Val Gln Ser Ile Ala145 150 155 160Asp Ala Leu Asn Gln Ala Gly Leu Asn Ala Glu Ile Thr Pro Asp Val165 170 175Met Thr Ala Ile Trp His Lys Ala Gly Ile Asn Ala Val Leu Asn Pro180 185 190Leu Ser Val Leu Leu Asn Ala Asn Ile Ala Glu Phe Gly Thr Ala Gly195 200 205Asn Ala Met Asp Leu Ala Leu Asn Ile Leu Asp Glu Met Lys Gln Val210 215 220Gly Ala Ser Gln Gly Ile Lys Val Asp Val Ser Gly Ile Met Thr Asp225 230 235 240Leu Ser Gln Leu Leu Lys Pro Glu Asn Ala Gly Asn His Phe Pro Ser245 250 255Met Tyr Gln Asp Ile Gln Asn Gly Lys Arg Thr Glu Ile Asp Phe Leu260 265 270Asn Gly Tyr Phe Ala Lys Ile Gly His Glu Ser Gly Ile Pro Thr Pro275 280 285Phe Asn Ala Leu Val Thr Arg Leu Ile His Ala Lys Glu Asp Ile Glu290 295 300Arg Val Lys Leu Ala Lys Gln Gln Glu Asn Phe Glu Ile305 310 315
<210>3<211>15<212>PRT<213>肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)<400>3Met Lys Ile Ala Ile Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ala Arg Leu1 5 10 15<210>4<211>10<212>PRT<213>肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)<400>4Leu Gly Val Met Leu Gln Ala Gly Gly His1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)<400>5Thr Glu Ile Asp Phe Leu Asn Gly Tyr Phe1 5 10<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(27)<223>n是a，t，c，和g中的任一个<400>6ctgaagctta tgaarathgc hathgcngg 29<210>7
<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(30)<223>n是a，t，c，和g中的任一个<400>7cagaagcttt gdccdccdgc ytgyarcatn ac 32<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(30)<223>n是a，t，c，和g中的任一个<400>8ctgaagcttg gygthatgyt dcargchggn gg 32<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>9gtcaagcttt adccrttyar raartcdaty tc 32<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列
<400>10ctgaagctta chgaratyga yttyytdaay gg 32<210>11<211>785<212>DNA<213>肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)<400>11ggatttggtg cacttggtgc acgattaggt gtcatgctcc aggctggtgg ccatgaggtt 60accgggattg atggttggcc ggcacatatt gctgctatta atacaaaagg tttaacagtc 120gttaaagata atgatgcacc acaaaagtat tttgtaccag ttatgccggc aagtgaagtg 180acaggcacat ttgatttaat tattttactc actaaaacac cacaactaga ccgcatgtta 240acagatattc agcctattat aacggatact acaaaattat tggtattatc aaacggtttg 300ggtaatattg aagtgatggc aaagcacgtg tcacgccatc aaattttggc tggtgtcaca 360ttatggacat cgtcactaat aaagccaggt gaaatacatg ttactggtag tggctctatt 420aaattacaag caattggcga tgctgatgtc caaagtatag cggatgcttt gaatcaggct 480ggcttaaacg ccgaaattac cccagatgtg atgacagcaa tttggcataa ggcaggtatc 540aacgcggtgc tcaatccttt atccgtgttg ttaaatgcaa atattgctga atttggcaca 600gctggcaatg ccatggatct agcattgaat attctagatg agatgaagca agttggtgcg 660tcacaaggca ttaaagttga cgttagtggt attatgacgg acttgagtca gttacttaaa 720ccagaaaatg caggtaatca ttttccgtca atgtaccaag atattcaaaa tggtaaacgt 780actga 785<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>12tcacttgccg gcataactgg 20<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>13gtcacaaggc attaaagttg acg 23
<210>14<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>14gtcgaattct atcatgaaaa ttgcaattgc aggatttggt gcac 44<210>15<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>15gataagctta ctagtattaa atttcaaagt tttcttgctg ttttgctaat ttaacacg 58
权利要求
1.一种α-酮酸还原酶，它具有如下物理化学性质(i)功能用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶还原α-酮酸为(R)-α-羟基酸；及(ii)底物特异性(a)在还原反应(i)中用还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶；(b)还原2-氯苯酰甲酸为(R)-2-氯扁桃酸；及(c)可还原2-氯苯酰甲酸，但基本上不能使2-氯扁桃酸的两个光学异构体中的任一个脱氢。
2.根据权利要求1所述的α-酮酸还原酶，进一步具有如下物理化学性质(iii)最佳pHpH5.0-5.5；(iv)最佳温度45-55℃；及(v)分子量为约35,000道尔顿和约63,000道尔顿，分别由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤测定。
3.根据权利要求1所述的α-酮酸还原酶，它是由属于明串珠菌属的微生物产生的。
4.根据权利要求3所述的α-酮酸还原酶，其中属于明串珠菌属的微生物是肠系膜明串珠菌。
5.根据权利要求4所述的α-酮酸还原酶，其中属于肠系膜明串珠菌的微生物是肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种。
6.一种编码蛋白质的多核苷酸，其中所述的蛋白质为可催化α-酮酸还原的酶，并且其中所述的多核苷酸选自包含以下的组(a)含有核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸；(b)编码含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸；(c)编码含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的多核苷酸，其中SEQ IDNO2的一个或多个氨基酸被替代、删去、插入，和/或增加；(d)可与含有核苷酸序列SEQ ID NO1的DNA在严格的条件下杂交的多核苷酸；和(e)编码与氨基酸序列SEQ ID NO2具有50％或更高的同源性的氨基酸序列的多核苷酸。
7.一种由权利要求6所述的多核苷酸编码的蛋白质。
8.一种重组载体，其中插入了权利要求6所述的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其中进一步插入了编码脱氢酶的多核苷酸，该脱氢酶用β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶催化氧化-还原反应。
10.根据权利要求9所述的载体，其中的脱氢酶为甲酸脱氢酶。
11.根据权利要求10所述的载体，其中的甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌。
12.根据权利要求9所述的载体，其中的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶。
13.根据权利要求12所述的重组载体，其中的葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌。
14.一种转化体，它含有可表达的权利要求6所述的多核苷酸或权利要求8所述的重组载体。
15.一种制备权利要求7所述的蛋白质的方法，其中所述的方法包含培养权利要求14的所述转化体和收集表达产物的步骤。
16.一种制备权利要求1所述的酶或权利要求7所述的蛋白质的方法，其中所述方法包含培养可产生权利要求1所述的酶或权利要求7所述的蛋白质的属于明串珠菌属的微生物的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中的属于明串珠菌属的微生物是肠系膜明串珠菌。
18.根据权利要求17所述的方法，其中的属于肠系膜明串珠菌的微生物是肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种。
19.一种制备光学活性的α-羟基酸的方法，其中所述方法包含如下顺序的步骤(i)α-酮酸与(a)权利要求1或2所述的α-酮酸还原酶；(b)权利要求7所述的蛋白质；(c)产生所述α-酮酸还原酶或所述蛋白质的微生物；或(d)这种微生物的加工产物；反应；及(ii)收集由步骤(i)产生的光学活性的α-羟基酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中α-酮酸是具有式(I)的苯酰甲酸衍生物 式(I)其中X是氢原子，碱金属，或碱土金属；及R表示在邻，间，或对位上的一个或多个取代基团，该取代基团选自卤原子，羟基，C1-3烷基，C1-3烷氧基，C1-3硫烷基，氨基，硝基，巯基，苯基，苯氧基，并且其中所述的方法包含收集具有式(II)的光学活性的扁桃酸的步骤 式(II)其中X和R如式(I)中定义。
21.根据权利要求20所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的邻位被取代。
22.根据权利要求21所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的邻位被卤原子取代。
23.根据权利要求20所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的间位被取代。
24.根据权利要求23所述的方法，其中苯酰甲酸衍生物的间位被卤原子取代。
25.根据权利要求19所述的方法，其中α-酮酸是2-氯苯酰甲酸，光学活性的α-羟基酸是(R)-2-氯扁桃酸。
26.根据权利要求19所述的方法，其中的微生物是权利要求14所述的转化体。
27.根据权利要求19所述的方法，其中所述的方法还包含转化氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的步骤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中通过辅酶为氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的催化脱氢酶的作用，使氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
29.根据权利要求28所述的方法，其中辅酶为氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的催化脱氢酶为甲酸脱氢酶和/或葡萄糖脱氢酶。
全文摘要
本发明提供了一种从肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroi des subsp.Dextranicum中分离得到的α－酮酸还原酶和编码此酶的DNA。在NADH存在下，此酶和它的同源物可还原α－酮酸为光学活性的α－羟基酸。本发明所述的α－羟基酸包括具有式II的光学活性的扁桃酸衍生物。依据本发明得到的光学活性的扁桃酸衍生物是合成医药和农药的有用的中间体。
文档编号C12P7/42GK1497046SQ03164929
公开日2004年5月19日 申请日期2003年7月16日 优先权日2002年7月16日
发明者木本训弘, 山本浩明, 明 申请人:大赛璐化学工业株式会社