专利名称：禾谷类植物基因敲除操作平台质粒及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中基因敲除技术，特别是涉及基因敲除平台质粒及其构建方法与应用，尤其是涉及一种用于禾谷类基因敲除的操作平台质粒及其构建方法与应用。
背景技术：
在过去数十年中，科学工作者进行了基因组测序、突变体分析和反义遗传学的研究，而且在众多领域已经有所突破。在植物功能基因组学研究中，综合应用遗传学与分子生物学的研究方法一方面从遗传学入手，通过化学诱变、T-DNA插入、射线诱变等技术，获得突变体植株，进而克隆突变基因，分析基因功能，通过在突变体植物个体中表达突变基因获得性状恢复来确认突变基因的功能；另一方面从分子生物学入手，首先获得基因序列，然后通过反义遗传学的方法，在植物体中转入相应基因的正义和反义cDNA链，分析基因超表达和失去功能后的植物表型，进而分析已知序列基因的功能。
1998年，Fire等人发现向线虫直接注射双链RNA(dsRNA)可以造成具有同源序列的基因沉默(Fire，et al，Nature 1998，391806-811)。这种现象被称之为RNA干涉(RNA interference，或RNAi)。随后的研究结果表明，饲喂含有可转录双链RNA的质粒或直接用双链RNA浸泡线虫，均可导致相似的现象发生(Timmons and Fire，Nature 1998，395854.；Tabara，Grishok and Mello，Science 1998，282430-431)。这种现象说明双链RNA可以导致具有同源序列的基因失去功能，表型显示为强突变体或等位突变。在哺乳动物小鼠中也发现相似的现象(Wianny andZernicka-Goetz，Nature Cell Biol.2000，270-75.Svoboda，et al.，Development2000，1274147-4156)。
2000年，植物学工作者通过农杆菌介导的遗传转化，将可以产生双链RNA产物的双元载体导入拟南芥，获得相应的基因沉默表型(Chuang and Meyerowitz，PNAS，2000，974985-90)，表明RNA干涉现象同样在高等植物中存在，随后也进一步证实在单子叶植物中存在RNA干涉现象(Schweizer，et al.，2000，Plant J.，24(6)895-903；Zentella，et al.，Plant Cell，142289-2301)。
然而至今为止，只有在双子叶植物RNAi构建中可以利用pHANNIBAL(一种由35S启动子驱动的含有双臂预置克隆位点和内含子核心以及OCS终止密码子的双元载体)，基于PCR产物，进行二步法构建(2001，Plant J.，27581-590)，而单子叶植物的RNAi构建都是基于多步的酶切、连接反应。在禾谷类作物的RNAi构建中，研究者首先通过PCR方法得到DNA正义片段，并克隆到PCR-TOPOII载体上，完成第一步连接反应；然后通过BamHI/XbaI双酶切将基因的正义片段切下后，克隆到植物表达载体pGY1上，完成第二步连接反应；通过另外的PCR反应扩增带有SmaI/BamHI的片段，经双酶切后连接到含有正义链的pGY1上，完成第三步连接反应，得到由35S启动子驱动的可以转录出双链RNA的载体。此时的构建中仍然没有内含子序列(Schweizer，et al.，2000，Plant J.，24895-903)。这样，利用2对PCR引物扩增出的产物，经过3次连接反应所获得的构建只是在35S启动子驱动下的不含内含子区域的RNAi构建。
如果要获得更为高效的RNAi构建，至少还需要1次酶切连接(或1次PCR外加1次酶切连接)。这样构建一个基因的RNAi至少需要2对(如果内含子区直接通过剪切其它质粒上的内含子片段或GUS片段)引物，2次PCR，3次酶切，4次连接和筛选试验，最快也需要4周的时间才能将终构建转化到农杆菌中。按照现有技术每构建一个含有可转录双链RNA的构建，就要投入大量时间和消耗大量试剂。
发明创造内容本发明的目的是提供一种用于禾谷类基因敲除的操作平台质粒。
用于禾谷类基因敲除的操作平台质粒，其结构为启动子-多克隆酶切位点1-内含子-多克隆酶切位点2-终止子。
所述启动子优选为玉米Ubi-1启动子；所述内含子为具有SEQ ID №1序列或与SEQ ID №1具有90％同源性的水稻内含子；所述终止子为NOS终止子。
所述多克隆酶切位点1的酶切位点序列优选为BamHI-SmaI-KpnI-XhoI-SalI-BglII-NheI；所述多克隆酶切位点2的酶切位点序列优选为ClaI-SpeI-XbaI-SacI。
优选的质粒结构为玉米Ubi-1启动子-BamHI-SmaI-KpnI-XhoI-SalI-BglII-NheI-水稻内含子-ClaI-SpeI-XbaI-SacI-NOS终止子，命名为pTCK303。
本发明的第二个目的是提供一种有效敲除禾谷类基因的方法。
敲除禾谷类基因的方法，包括以下步骤1)制备在需要敲除的目的基因片段的两端分别加载有酶切位点的PCR产物；2)用针对PCR产物一端酶切位点的酶切割PCR产物，得到正义的核苷酸序列；3)用针对PCR产物另一端酶切位点的酶切割PCR产物，得到反义的核苷酸序列；4)将正义片段克隆到操作平台质粒上，然后将反义片段克隆到含有正义片段的质粒上，得到工程质粒；
5)将工程质粒转入需要敲除目的基因的植物中，完成基因敲除。
所述制备在需要敲除的目的基因片段的两端分别加载有酶切位点的PCR产物中的引物对为5’端为酶切位点的带有目的基因片段的寡核苷酸序列。
所述引物优选为17-20个碱基的寡核苷酸序列，其中前14个碱基为具有酶切位点的前导序列，其余为目的基因片段。所述引物对的前导序列选自如下序列对SEQ ID№2，SEQ ID №3；SEQ ID №4，SEQ ID №5；SEQ ID №6，SEQ ID №7；SEQ ID №8，SEQ ID №9；SEQ ID №10，SEQ ID №o11；SEQ ID №12，SEQ ID №13；SEQ ID №14，SEQ ID №15；SEQ ID №16，SEQ ID №17SEQ ID №18，SEQ ID №19；SEQ ID №20，SEQ ID №21；SEQ ID №22，SEQ ID №23；SEQ ID №24，SEQ ID №25或SEQ ID №26，SEQ ID №27。上述引物对的特征如表1所示。
表1推荐使用的内切酶及相应PCR引物序列
注KpnIGGGGTACC；BglIIGAAGATCT；BamHICGGGATCC；SacICCGAGCTC；SpeIGGACTAGT；NheICTAGCTAGC；XbaIGCTCTAGA下划线部分代表各自内切酶位点的序列，序列中前面非划线的2～3个碱基为推荐的保护碱基；N代表来源于目的基因的核酸序列。
本发明所构建的基于酶切连接的操作平台质粒，可以适合于绝大多数目的基因的RNAi构建，使用上非常简便。通过一步的PCR获得相应的DNA片段，然后通过2次酶切连接反应将需要敲除的目的基因片段连接在操作平台质粒上，构建每一个用于目的基因敲除的工程质粒只需要一对PCR引物，节省消耗，两次酶切连接反应，最快可以10天内完成，节省时间。该质粒含有玉米泛素蛋白启动子，并且在该启动子下游连接有一个水稻内含子和两个多克隆位点，在该结构中，BamHI和BglII互为同尾酶，SpeI、NheI和XbaI互为同尾酶，这样使得引物设计有更多的选择性(如表1所示)。
本发明平台质粒适合于水稻，小麦、玉米等农作物在功能基因组研究过程中，进行大规模高效快速的基因敲除。因此，本发明对于农业的发展具有重要理论和现实意义。
图1平台质粒pTCK303的结构2平台质粒pTCK303的核心结构3平台质粒pTCK303进行基因敲除的流程4平台质粒的工作原理示意5平台构建的流程图具体实施方式
实施例1、平台质粒pTCK303的构建一、水稻1号染色体上内含子序列克隆选用携带SalI酶切位点的引物15’GCG TCG ACA GAT CTG CTA GCG GTA AGTTAC TAC AAA CC3’和携带ClaI酶切位点的引物25’CCA TCG ATC TGA AAA TCT CGAAAC AGC CGT GTC ATA G3’(注意在这里设计引物时考虑到内含子的剪切序列，所以在携带ClaI酶切位点引物设计时，在内含子序列和酶切位点序列之间加有碱基C，以达到在PCR产物的3’端形成CAG的内含子剪切位点)，以日本晴Oryza sativa cv.Japonica基因组DNA为模板，按照下列条件进行PCR扩增，50微升PCR反应体系中含有5微升10XPCR缓冲液，5微升2.5毫摩尔dNTPs，5微升2毫摩尔引物1，5微升2毫摩尔引物2，1微升模板DNA2微升重蒸水混匀。
按下列程序进行PCR扩增94℃4分钟，暂停于94℃，加上0.5微升TAKARA公司的LaTAQ，继续执行35循环94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，72℃下5分钟后，转入4℃保存。
电泳纯化PCR产物，通过序列测定，验证所要水稻内含子序列(SEQ ID №1)准确无误后，将此内含子序列的PCR产物通过SalI/ClaI双酶切后电泳，胶回收纯化，得到内含子的插入片段，-20℃保存备用。
二、核心结构的构建将合成的引物I(5’CCT CGA GGT CGA CAG ATC TGC TAG CAT CGA TAC TAG TTCTAG AGA GCT)和引物II(5’CTC TAG AAC TAG TAT CGA TGC TAG CAG ATC TGT CGACCT CGA GGG TAC)各取1微升(100pmol)，加入1微升常规10XTaq酶缓冲液和1微升10X连接酶缓冲液，16微升双蒸水。混匀后，94℃变性5分钟，37℃退火10分钟，得到含有KpnI-XhoI-SalI-BglII-NheI-ClaI-SpeI-XbaI-SacI酶切位点的引物接头5’CCTCGAGGTCGACAGATCTGCTAGCATCGATACTAGTTCTAGAGAGCT 3’3’CATGGGAGCTCCAGCTGTCTAGACGATCGTAGCTATGATCAAGATCTC 5’用KpnI和SacI完全消化pBluescriptII SK质粒DNA，电泳分离，回收载体片段(即不含多克隆位点的线性化pBluescriptII SK)。取该片段5微升(约1微克)，与1微升(约10pmol)的引物接头混合后，在16℃下进行过夜连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选得到所需克隆含有“KpnI-XhoI-SalI-BglII-NheI-ClaI-SpeI-XbaI-SacI”酶切位点的新质粒，命名为pTCK302。
SalI和ClaI完全消化pTCK302，电泳分离，胶回收纯化载体片段。取该片段5微升(约1微克)，与5微升实施例1制备的水稻内含子插入片段，在16℃水浴中过夜连接。连接产物转化大肠杆菌，筛选鉴定得到含有结构“KpnI-XhoI-SalI-BglII-NheI-水稻内含子-ClaI-SpeI-XbaI-SacI”的新质粒pTCK302-1(参考核心结构构建流程图，图5)。
通过限制性内切酶KpnI和SacI自质粒pTCK302-1切得序列“KpnI-XhoI-SalI-BglII-NheI-水稻内含子-ClaI-SpeI-XbaI-SacI”，并克隆到质粒pUN1301(为本实验室基于pCAMBIA1301构建的含有玉米Ubi-1启动子和NOS终止子的双元表达载体，参见专利受理号02130751.2)的KpnI和SacI位点之间，该质粒被命名为pTCK303，即为本发明的RNAi酶切连接的操作平台质粒，其结构如图1所示，核心结构如图2所示，其构建流程如图3所示。
实施例2.敲除转GFP2基因的转基因水稻中的GFP2设计分别含有KpnI和SpeI酶切位点的上游引物GFP2F以及含有BamHI和SacI酶切位点的下游引物GFP2R，序列如下GFP2F 5’GGGGTACCACTAGTTGGTGATGTTAATGGGCACAA 3
GFP2R 5’GGGGATCCGAGCTCGCCATCGCCAATTGGAGT 3’为以后构建方便，PCR反应在50微升体系中进行。体系10XPCR缓冲液5微升，2.5毫摩尔的dNTPs 5微升，2毫摩尔的引物各5微升，0.5微升Taq酶，1微升模板DNA，29.5微升的蒸馏水。通过下面的程序进行PCR94℃2分钟，94℃20秒，54℃30秒，72℃30秒，35循环，72℃10分钟。得到PCR产物，序列是SEQ ID №2810微升PCR产物通过SpeI/SacI双酶切，获得正义的GFP2片段；另取10微升PCR产物通过BamHI/KpnI双酶切，获得反义的GFP2片段。
先将正义的GFP2片段连接到pTCK303的右侧多克隆位点SpeI/SacI之间，具体步骤为用SpeI/SacI彻底消化pTCK303，回收载体片段，与正义的GFP2片段连接后转化大肠杆菌，经筛选得到含有内含子和GFP2正义片段的阳性克隆。提取阳性克隆的DNA，再通过BamHl/KpnI双酶切、回收作为载体，与GFP2反义片段连接，使GFP2反义片段连接到pTCK303的左侧多克隆位点。经转化、筛选获得正确的RNAi工程质粒，提取质粒DNA并转入农杆菌。
借助常规的农杆菌介导的遗传转化，将RNAi工程质粒导入GFP2阳性的转基因水稻，阳性的荧光消失。证明GFP2基因已被有效敲除。
序列表<160>28<210>1<211>478<212>DNA<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1ggtaagttac tacaaacctt tttgtactta tgttccagtg acaattattt gtgttctcat 60gttccacgta tcactttaat gttcatggtt gatcattgta ccgcctcatc tcttttagag 120gatcaagagt atatgcctgt cttaactttt tctttctctg gtccagtctt tccgctgata 180ttaagatgaa ttttacaaca aaaaatgtgc tgcctgtgta tgaaggttca gaggcatagt 240tcataatttt accctgttct caattaggaa atgtattttg caaggtcata aagtcttgac 300attgatgatc aaatattttc tagagctaaa atttcataat caaatatgac agttccacgg 360cagtagataa agagtaccca ctgtatatat tagtatgaag attaacactt gaaaaaacct 420ttgattgttc ctataacacc taatgattga ctatgacacg gctgtttcga gattttca478<210>2<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggggtaccac tagt 14<210>3<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cgggatccga gctc14<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ggactagtgg tacc14<210>5<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ccgagctcag atct14<210>6<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6ggactagtag atct14<210>7<211>14
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7ccgagctcgg atcc14<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8ggactagtag atct14<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>9ccgagctcag atct14<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10ggggtacctc taga14<210>11<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11cgggatccga gctc14<210>12<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12ggggtacctc taga14<210>13<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13cgggatccac tagt14
<210>14<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14ggggtacctc taga14<210>15<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15cgggatccgc tagc14<210>16<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16ggggtaccgc tagc14<210>17<211>14<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17cgggatccga gctc14<210>18<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>18ccgagctcgg tacc14<210>19<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>19ccgagctcag atct14<210>20<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>20
gctctagagg tacc14<210>21<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>21ggactagtag atct14<210>22<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>22gaagatcttc taga14<210>23<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>23cgggatccga gctc14<210>24<211>14
<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>24gctctagaag atct14<210>25<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>25ggactagtgg atcc14<210>26<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>26gaagatctgc tagc14<210>27<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>27cgggatccac tagt 14<210>28<211>335<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>28ggggtaccac tagttggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa60ggtgatgcaa catacggaaa acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaagcttcct120gttccttggc caacacttgt cactactctt acttatggtg ttcaatgctt ttcaagatac180ccagatcata tgaagcggca cgacttcttc aagagcgcca tgcctgaggg atacgtgcag240gagaggacca tcttcttcaa ggacgacggg aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt300gagggagaca ccctcgtcaa caggatcgag cttaagggaa tcgatttcaa ggaggacgga360aacatcctcg gccacaagtt ggaatacaac tacaactccc acaacgtata catcatggca420gacaaacaaa agaatggaat caaagttaac ttcaaaatta gacacaacat tgaagatgga480agcgttcaac tagcagacca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg cgagctcgga540tcccc54权利要求
1.用于禾谷类基因敲除的操作平台质粒，其结构为启动子-多克隆酶切位点1-内含子-多克隆酶切位点2-终止子。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于所述启动子为玉米Ubi-1启动子；所述内含子为具有SEQ ID №1序列或与SEQ ID №1具有90％同源性的水稻内含子；所述终止子为NOS终止子。
3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于所述内含子为具有SEQ ID №1序列的水稻内含子。
4.根据权利要求1或2或3所述的质粒，其特征在于所述多克隆酶切位点1的酶切位点序列为BamHI-SmaI-KpnI-XhoI-SalI-BglII-NheI；所述多克隆酶切位点2的酶切位点序列为ClaI-SpeI-XbaI-SacI。
5.敲除禾谷类基因的方法，包括以下步骤1)制备在需要敲除的目的基因片段的两端分别加载有酶切位点的PCR产物；2)用针对PCR产物一端酶切位点的酶切割PCR产物，得到正义的核苷酸序列；3)用针对PCR产物另一端酶切位点的酶切割PCR产物，得到反义的核苷酸序列；4)将正义片段克隆到操作平台质粒上，然后将反义片段克隆到含有正义片段的质粒上，得到工程质粒；5)将工程质粒转入需要敲除目的基因的植物中，完成基因敲除。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述制备在需要敲除的目的基因片段的两端分别加载有酶切位点的PCR产物中的引物对为5’端为酶切位点的带有目的基因片段的寡核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述引物为17-20个碱基的寡核苷酸序列，其中前14个碱基为具有酶切位点的前导序列，其余为目的基因片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述引物对的前导序列选自如下序列对SEQ ID №2，SEQ ID №3；SEQ ID №4，SEQ ID №5；SEQ ID №6，SEQ ID №7；SEQ ID №8，SEQ ID №9；SEQ ID №10，SEQ ID №11；SEQ ID №12，SEQ ID №13；SEQ ID №14，SEQ ID №15；SEQ ID №16，SEQ ID №17；SEQ ID №18，SEQ ID №19；SEQ ID №20，SEQ ID №21；SEQ ID №22，SEQ ID №23；SEQ ID №24，SEQ ID №25或SEQ ID №26，SEQ ID №27。
9.权利要求1-4所述的质粒在禾谷类植物基因敲除中的应用。
10.权利要求5-8所述的方法在禾谷类植物基因敲除中的应用。
全文摘要
本发明公开了禾谷类植物基因敲除操作平台质粒及其构建方法与应用。本发明用于禾谷类基因敲除的操作平台质粒，其结构为启动子－多克隆酶切位点1－内含子－多克隆酶切位点2－终止子。通过一步的PCR获得相应的DNA片段，然后通过2次酶切连接反应将需要敲除的目的基因片段连接在操作平台质粒上。这样不仅节省化学药品的消耗，而且缩短质粒制备时间。本发明平台质粒适合于水稻，小麦、玉米等农作物在功能基因组研究过程中，进行大规模高效快速的基因敲除，对于农业的发展具有重要理论和现实意义。
文档编号C12N15/29GK1600863SQ0316009
公开日2005年3月30日 申请日期2003年9月27日 优先权日2003年9月27日
发明者种康, 陈昌斌, 韩晔, 许智宏, 谭克辉 申请人:中国科学院植物研究所