一种定量谷类生物残留dna的标准操作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于谷类作物的重组蛋白质中残留DNA的定量方法，其特征在于,包括以重组蛋白质产品中残留DNA为模板，以SYBR?Green染料或TaqMan探针采用qPCR方法的定量分析方法。
【专利说明】一种定量谷类生物残留DNA的标准操作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种定量谷类生物残留DNA的标准操作方法。
【背景技术】
[0002]近年来，分子农业用于生产重组药用蛋白质得到快速发展[1]。从可扩展性、安全性和成本效益方面而言，植物为重组药物蛋白的生产提供了具有前途的平台，可能是传统的如细菌，酵母，哺乳动物细胞培养等发酵系统以外的另一替代性生产平台。谷类作物的种子，如水稻、大麦和玉米，都可能有希望成为理想的寄主[2]。最近，水稻种子已成功地表达了多种重组蛋白，如人类α-抗胰蛋白酶，T细胞表位肽，霍乱毒素B亚基(CTB)，鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)免疫原VP2，并大规模生产了人血清白蛋白[3_7]。其中一些蛋白质已进入临床研究阶段[8’9]。
[0003]作为临床用途，生物药物的生产必须牢记的是产自细胞基质的产品所含寄主残留DNA水平应当尽可能低。目前的监管指引建议，最终产品中寄主残留DNA的剂量应少每剂lOOpg，对某些寄主而言是每剂10ng[1°’n]。因此，严格控制药用级别的重组蛋白质药物中的残留DNA含量是非常重要的，因为它直接关系到人类的安全。定量药物中残留DNA的传统方法包括PicoGreen法,杂交检测法,阈值技术(threshold technology)和qPCR[n4]。这些检测方法中，由于其灵敏度，准确度，精密度和省时等特点，qPCR分析方法被认为是最实用的残留DNA定量方法。其已成功地开发并用于定量大肠杆菌、NSO (小鼠骨髓瘤细胞)和CHO (中国仓鼠卵巢细胞)细胞的残留DNA。
[0004]然而，至今仍没有关于植物类寄主残留DNA的定量分析方法。随着使用植物细胞，如稻米[3_9]，作为寄主的分子农业的迅速发展，开发一种灵敏的分析方法来定量稻米源性药物的残留DNA非常有必要。在qPCR分析方法中，已知在较短的时间内，目标DNA序列的初始拷贝数量与达到阈值信号是成比例的。因此，为了达到这个目的，尽可能选择基因组中拷贝数多的内参DNA序列是有利的。通常用于残留DNA分析的多拷贝元件有如LINE-1LINE-2, BI, B2和LTRtl5]。同时，由于核糖体DNA的多拷贝数和高度保守，也经常被用于评估残留DNA基因来进行残留DNA分析[16]。尽管还有其他的现有技术[17]，大部分研究人员还是依赖于TaqMan探针或SYBR绿色染料进行qPCR分析。本发明致力于开发一种定量分子农业产品，如水稻重组人血清白蛋白(OsrHSA)的残留DNA的qPCR分析方法。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种用于重组蛋白质中残留DNA的定量方法，包括以重组蛋白质产品中残留DNA为模板，以SYBR Green染料或TaqMan探针采用qPCR方法的定量分析方法。进一步地，所述重组蛋白质是谷类作物的重组蛋白质。
[0006]进一步地，所述qPCR反应包括使用以下引物:
[0007]正向引物5 ’ -CGGATGTAACATTTTCTGTA-3 ’ ；[0008]反向引物5 ’ -CGGGTGTCATTTCTTAAAATAG-3 ’。
[0009]所述TaqMan探针的序列为:
[0010]FAM-5，-TTGCCTGATTCCGAGTCCGT-3，-BHQl。
[0011]所述正向引物的浓度为4-10 μ M，反向引物的浓度为4-10 μ M ;其中所述正向引物的浓度优选为10 μ Μ，反向引物的浓度优选为4 μ Μ。
[0012]更进一步地，本发明所述使用SYBR Green染料的qPCR方法的反应过程为:
[0013]95 0C，10 分钟，I 个循环；93-96 °C 15-30 秒，55-60 °C 25-35 秒，30-40 个循环；93-96°C 15-25 秒，55-60。。20-30 秒，I 个循环，以 0.7V /s 上升熔化。
[0014]优选地，所述使用SYBR Green染料的qPCR方法的反应过程为:
[0015]95°C, 10 分钟，I 个循环；95°C 15-30 秒，60°C 25-35 秒，30-40 个循环；95°C 15-25秒，60°C 20-30秒，I个循环，以0.7°C /s上升熔化。
[0016]本发明所述使用所述TaqMan探针的qPCR方法的反应过程为:
[0017]50-530C 1.5-2.5 分钟，I 个循环；93-96°C 15-25 秒，55-60°C 25-35 秒，30-40 个循环。
[0018]优选地,所述使用所述TaqMan探针的qPCR方法的反应过程为:
[0019]50。。1.5-2.5 分钟，I 个循环；95°C 15-25 秒，60°C 25-35 秒，30-40 个循环。
[0020]本发明还提供了所述qPCR方法优选的反应体系，包括:
[0021]
【权利要求】
1.一种用于重组蛋白质中残留DNA的定量方法，其特征在于，包括以重组蛋白质产品中残留DNA为模板，以SYBR Green染料或TaqMan探针采用qPCR方法的定量分析方法。
2.如权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述重组蛋白质是谷类作物的重组蛋白质。
3.如权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR反应包括使用以下引物: 正向引物 5’ -CGGATGTAACATTTTCTGTA-3’ ； 反向引物 5’ -CGGGTGTCAITTCTTAAAATAG-3’。
4.如权利要求1或2所述的定量方法，其中所述TaqMan探针的序列为:
FAM-5’ -TTGCCTGATTCCGAGTCCGT-3’ -BHQl。
5.如权利要求2所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的浓度为4-10μ M，反向引物的浓度为4-10 μ Μ。
6.如权利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的浓度为ΙΟμΜ，反向引物的浓度为4 μ Μ。
7.如权利要求1所述的定量方法，其特征在于，使用SYBRGreen染料的qPCR方法的反应过程为: 95 °C,10 分钟，I 个循环；93-96 °C 15-30 秒，55-60 °C 25-35 秒，30-40 个循环；93-96 °C 15-25 秒，55-60 °C 20-30 秒，I 个循环，以 0.7。。/s 上升熔化。
8.如权利要求7所述的定量方法，其特征在于，使用SYBRGreen染料的qPCR方法的反应过程为: 95°C, 10 分钟，I 个循环；95°C 15-30 秒，60°C 25-35 秒，30-40 个循环；95°C 15-25 秒，60 0C 20-30秒，I个循环，以0.7°C /s上升熔化。
9.如权利要求1所述的定量方法，其特征在于，使用所述TaqMan探针的qPCR方法的反应过程为: 50-530C 1.5-2.5 分钟，I 个循环；93~96V 15-25 秒，55-60。。25-35 秒，30-40 个循环。
10.如权利要求9所述的定量方法，其特征在于，使用所述TaqMan探针的qPCR方法的反应过程为: 50V 1.5-2.5 分钟，I 个循环；95°C 15-25 秒，60°C 25-35 秒，30-40 个循环。
11.如权利要求3所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR方法的反应体系包括:
12.如权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR方法的反应体系包括:
13.如权利要求2所述的定量方法，其特征在于，所述谷类作物为选自水稻、小麦和大麦。
14.如权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述重组蛋白质为重组人血清白蛋白。
【文档编号】C12Q1/68GK103757099SQ201310686660
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】杨代常, 陈镇 申请人:武汉大学