一种青稞的紫外胁迫相关基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种青稞的紫外胁迫相关基因及其应用。
背景技术：
：青稞英文名：hullessbarley，是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称裸大麦、元麦、米大麦。主要产自中国西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要粮食。青稞在青藏高原上种植约有3500年的历史，从物质文化之中延伸到精神文化领域，在青藏高原上形成了内涵丰富、极富民族特色的青稞文化。有着广泛的药用以及营养价值，已推出了青稞挂面、青稞馒头、青稞营养粉等青稞产品。臭氧层变薄导致的到达地面的紫外辐射增强对植物的影响已经引起了全社会的广泛关注,是当今学术领域研究的主要课题。紫外胁迫会严重影响青稞的生长发育，对最终的产量造成较大的影响。然而，目前在检测青稞是否受到紫外辐射方面，却未见有效的手段。技术实现要素：本发明提供了一种与青稞的紫外胁迫相关的基因及其克隆方法，该基因可用于检测青稞是否受到紫外胁迫。本发明提供了青稞的紫外胁迫相关基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明提供了一种青稞的紫外胁迫相关蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明提供了一种克隆前述青稞的紫外胁迫相关基因的方法，步骤如下：1)取青稞，提取RNA；2)以SEQIDNO.3～SEQIDNO.4所示引物对为引物进行反转录，纯化，即可。步骤2)中，反转录的体系和条件如下：反转录反应体系：反转录反应条件：步骤2)中，纯化的方法是：纯化的方法是琼脂糖凝胶电泳中回收目标DNA片段的方法。本发明提供了一种检测青稞受紫外辐射胁迫的试剂盒，包括任选的用于检测前述基因表达水平或者前述蛋白含量的试剂。其中，所述试剂是PCR方法用试剂。其中，所述试剂包含SEQIDNO.5～SEQIDNO.6所示引物对。其中，所述试剂还包括如下试剂：5×RTReactionMix、Oligo(dT)、TUREscriptH-RTase/RIMix以及RNaseFreedH2O，它们的体积比为4:1.4:1:8.6。本发明发现了青稞紫外辐射胁迫相关的基因(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，本发明基因的表达水平与青稞是否受青紫外辐射胁迫相关，受到紫外辐射胁迫后，青稞的本发明基因的表达水平会显著提升，通过检测本发明基因的表达水平或者蛋白的含量可以判断青稞是否受过紫外辐射胁迫，为青稞生长后续生长条件的控制提供理论支持，具有良好的市场应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图128a-本发明基因的酶切验证图图2表达结果图图3GAPDH检测扩增曲线(绿色为对照组,红色为紫外处理组)图4GAPDH检测溶解曲线(绿色为对照组,红色为紫外处理组)图5本发明基因检测扩增曲线(绿色为对照组,红色为紫外处理组)图6本发明基因检测溶解曲线(绿色为对照组,红色为紫外处理组)图7对照组与本发明实验组的2^-△△Ct结果具体实施方式实施例1本发明基因的克隆与表达一：基因克隆(一)RNA抽提及反转录1.用青稞320及喜8种子发芽成长成苗。2.采取新鲜叶片用植物提取试剂盒抽提RNA并检测。3.提取步骤如下：3.1仪器与试剂主要仪器：SCILOGEXD3024R离心机、analytikjena-Easycycler；Scientz-48高通量组织研磨仪；主要试剂：反转录试剂盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)(艾德来,货号PC1802，)；2×预混液(德国DBIpcrMix)。3.2实验方法与步骤3.2.1组织样本中RNA的提取RNA提取试剂盒采用jenainnuPREPRNAMiniKit。3.2.2cDNA的合成(反转录)采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)进行反转录操作，采用20uL反应体系(各反应500ul体系用于后续PCR)：反转录反应条件如下：反应结束后，得到cDNA，-20℃保存。本发明基因引物信息如下：(二)PCR产物电泳及编辑1仪器与试剂主要仪器：电源、电泳仪、成像系统。主要试剂：琼脂糖、500ml1XTAE、marker、Goldview。2实验方法与步骤：2.1制备1％琼脂糖凝胶:称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中,加入50ml1×TAE.电磁炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0％琼脂糖凝胶液.2.2胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固(30min),垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。2.3加样:用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内(2ul),每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。2.4电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压130V,13min,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。2.5观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。二：回收PCR产物测序亚克隆并诱导表达重组表达菌株的构建1.基因鉴定1.1目的DNA片段的回收用10g/L琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，凝胶回收试剂盒回收目的片段。(1)切取含目的片段的琼脂糖后捣碎，按重量/体积比1:3(琼脂糖重量：NE结合液的体积)加入NE结合液。如200mg琼脂糖加600mLNE结合液；(2)50～60℃水浴3～5min，胶完全融化即可，其间可上下颠倒2～3次；(3)将溶液转入中，静置5min使DNA充分与硅胶膜结合，13000r/min离心10～20秒，倒掉收集管中的废液；(4)加入500μl的80％乙醇于离心纯化柱中，13000r/min离心10～20秒，倒掉收集管中的废液；(5)重复步骤(4)；(6)13000r/min再次离心1min，尽量除去残余乙醇；(7)将离心纯化柱置于新的离心管中，开盖放置2～3min，使乙醇挥发完；(8)将无菌TE溶液50℃预热，向离心纯化柱中加入40～50μl，静置3～5min，使洗脱液充分将硅胶膜浸透；(9)13000r/min离心1min，管底溶液即为所需的DNA。1.2制备感受态细胞BL21(DE3)(1)从37℃培养16～20h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有100mLLB培养基的中，于37℃剧烈振荡培养2h后，每隔30min测OD600至0.5左右；(2)将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的50mL聚丙烯管中，使培养物冷却至0℃；(3)于4℃以4000r/min离心10min，以回收细胞；(4)倒出培养液，将管倒置1min，以使最后的痕量培养液流尽；(5)每50mL初始培养液用20mL，0.1mol/LCaCl2和10mL，0.1mol/LMgCl2在冰上放置30min，溶液重悬每份沉淀，置冰水混合物中10min；(6)于4℃以4000r/min离心10min，以回收细胞；(7)倒出上清液，将管倒置1min，以使最后的痕量上清液流尽；(8)每50mL初始培养液用2mL用冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬每份细胞沉淀。细胞在4℃保存12～24h，以提高转化效率。以上操作均在无菌条件下进行。本发明目的基因片段的核苷酸序列(SEQIDNO.1)如下：ATGGTGCACGCTGCGACGGCCGAGTGCTTCAGCAGCGTGTTCGCCTCATTCGACCACGACGCCGACGGCAGGATCTCGGCGGCGAAGCTGCGGCTGTGCATGAAGGCGACGCTAGGCGAGGACGTGTCGGCGGAGGACGCCGAGGCGCTCTTGGCGTCGGCCAACGCCGACGGATACCAGCTGCTGGACGAGCAGGAGTTCCTCCGGCTGGTGGCGCGGCCGGAGACGGAGGAGGAGGAGGAGCGGTGCAGGGGGCTGAGGGAGGCATTCGCGATGTACGAGGTGAAGGGCGAAGGGTGCATCACGCCGTCGAGCCTGATGCGGATGCTCGCCAGGCTGGGGTCCGAACAGGGCATCGAGGAGTGCCGCGCCATGATCCGCATGTTTGATTTGAATGAAGACGGACTGGTTTGCTACGACGAGTTCAAGGTTATGATGGATGCGTAG1.3本发明基因基因PCR产物纯化回收及表达质粒pET28a(+)的提取、酶切与回收将含有质粒pet128-质粒与pET28a(+)的菌株培养后，抽提质粒，并用BamHI和XhoI双酶切，将本发明基因片段PCR纯化回收产物(本发明基因片段可以按照前述方法制备，也可以直接合成)用BamHI和XhoI双酶切，酶切体系见下表，37℃作用2h，凝胶回收试剂盒回收目的DNA。质粒酶切反应体系：1.4酶切回收产物pET28a(+)与本发明基因片段的连接取0.2mL灭菌Eppendorf管一个，按表4-2加入各成分后16℃连接过夜。连接反应体系：pET28a-本发明基因的酶切图如图1所示，说明得到了含有本发明基因的重组pET28a质粒。1.5诱导表达1.5.1重组表达质粒pET28a-本发明基因转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞。同时将提取的空载体pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)作阳性对照；BL21(DE3)感受态细胞不转化组作阴性对照。1.5.2重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化1.5.3重组表达菌株的培养及表达挑取LB固体培养基(含Kan100ug/mL)上生长的已转化入pET28a-本发明基因的BL21(DE3)菌落接种于5mLLB液体培养基(含Kan100ug/mL)；37℃振荡培养至OD600约为0.5时，取1mL按1:100比例接种于含Kan的LB液体培养基中；将培养的100mL培养液分为2份，其中一份加IPTG诱导表达，另一份不加IPTG作为对照。加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养改变IPTG浓度、诱导温度和培养时间获得最佳诱导表达条件。取IPTG诱导后菌液1mL，离心，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤后，加入100ul生理盐水及5×SDS上样缓冲液25ul，100℃煮沸10min，离心，取上清进行SDS-PAGE。对未诱导菌液做同样处理，观察表达情况。同时将LB液体培养未转化及空载体pET28a(+)转化的BL21作为对照。1.5.4重组表达质粒SDS-PAGE电泳检测(1)按说明装好垂直电泳槽，保证封口胶条对槽口的密封。根据目的蛋白的大小及电泳槽规格确定分离胶及浓缩胶的浓度及体积；(2)配置所需浓度的分离胶，速将其注入凝胶装置，留出灌注浓缩胶所需空间，用吸管小心在分离胶面上覆盖一层水，将凝胶垂直放置于室温下；(3)分离胶聚合完全后，凝胶和水之间出现一条明显的交界线，倾出覆盖层液体，用滤纸吸干残留液体；(4)配制所需浓度的浓缩胶，在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，并将梳子插入浓缩胶中，应避免产生气泡，将凝胶垂直放置于室温下，聚合45min左右；(5)浓缩胶聚合完全后，小心取出梳子。将凝胶固定于电泳槽上，上下槽中均灌注Tris-甘氨酸电泳缓冲液；(6)按预定顺序加样，打开电源，恒压电泳。先以60V低电压电泳，当染料前沿进入分离胶后，把电压调至120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部；(7)电泳完毕后取出凝胶，用去离子水漂洗净胶上的电泳缓冲液，将凝胶放入固定液中固定15min，以考马斯亮蓝染液染色，于65℃染色15～20min,然后以脱色液平缓摇动脱色3～5h，观察蛋白条带。如图2所示，本发明表达得到了目标蛋白。本发明基因表达得到的目标蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO.2)如下：MVHAATAECFSSVFASFDHDADGRISAAKLRLCMKATLGEDVSAEDAEALLASANADGYQLLDEQEFLRLVARPETEEEEERCRGLREAFAMYEVKGEGCITPSSLMRMLARLGSEQGIEECRAMIRMFDLNEDGLVCYDEFKVMMDA实施例2本发明基因与青稞受到紫外辐射胁迫的相关性1.材料已提供的青稞2个幼苗，样品信息如下：2.仪器与试剂2.1主要仪器analytikjena-qTOWER2.2型荧光定量PCR仪(德国)、SCILOGEXD3024R离心机(美国)、普通PCR仪analytikjena-Easycycler(德国)；超微量核酸蛋白测定仪scandrop100(德国)；移液器(美国bio-rad)，DNA电泳图谱观察仪(君仪)，电泳仪(君仪)。2.2主要试剂耗材反转录试剂盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)(艾德来(是品牌)货号PC1802，)；2×Green预混液(德国DBI)。10ul枪头(美国GCS)，200ul枪头(美国GCS)，1ml枪头(美国GCS),200ul无RNA酶PCR反应管(AXGEN)；1.5Ml无RNA酶EP管(GCS)。3.实验方法与步骤3.1组织样本中RNA的提取(1)在已加入trizal试剂的样品离心管中加入200ul的氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，室温放置3min。(2)4℃，12000×g，离心15分钟，收集上清约600uL，转移至新1.5mL的EP管中。(3)加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀，室温下静置10min。(4)4℃，12000×g离心10分钟，弃上清。(5)加入1ml75％的乙醇，充分颠倒混匀，4℃，7500×g离心5分钟。(6)倒掉酒精，晾干，加入50ulDEPC水溶解RNA，立即检测浓度。(13)4℃，12000×g离心2分钟，离心管中溶液即为RNA样品。3.2RNA提取结果3.2.1紫外分光光度计检测结果3.3cDNA的合成(反转录)采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)进行反转录操作，采用40uL反应体系：反转录反应条件如下：反应结束后，得到cDNA，-20℃保存。引物信息如下：3.4引物信息3.5Real-timePCR反应条件的优化反应条件体系：Step1-95℃-3MinStep2-95℃-10sStep3-TM℃-30s+platereadStep5-Gotostep2,39cyclesStep6-Meltcurveanalysis(60℃～95℃，+1℃/cycle，holdingtime4s)。qPCR反应液成分：4实验结果4.1所有基因引物Tm值扩增实验将所有基因的特异性引物按上述qPCR反应体系配置，在PCR板离心机上4℃6000rpm离心30s。再置于定量PCR仪按上述程序进行扩增。GADPH与本发明基因的扩增曲线如图3～图6所示。4.2试验样品检测根据各个基因特异性引物的退火温度(Tm值)，分别对每个样品进行上样检测，设置2个副孔。各个样品中目的基因相对表达量的计算由仪器软件qPCRsoft3.0自动执行，采用Pfafflmethod，公式如下：4.3试验结果以GADPH做基因内参,计算2^-△△Ct结果如图7和下表所示：2^-△△Ct对照组(1#)1实验组(2#)34.7756试验结果说明，本发明基因的表达水平与青稞受到紫外辐射胁迫呈正相关，通过检测本发明基因的表达水平，可以测定青稞时候受到紫外辐射胁迫。综上，本发明发现了青稞紫外辐射胁迫相关的基因(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)的表达水平与青稞是否受青紫外辐射胁迫相关，通过检测本发明基因的表达水平可以判断青稞是否受过紫外辐射胁迫，为青稞生长后续生长条件的控制提供理论支持，具有良好的应用前景。SEQUENCELISTING<110>西藏自治区农牧科学院农业研究所成都生命基线科技有限公司<120>一种青稞的紫外胁迫相关基因及其应用<130>GY462-16P1477<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>447<212>DNA<213>本发明基因的核苷酸序列<400>1atggtgcacgctgcgacggccgagtgcttcagcagcgtgttcgcctcattcgaccacgac60gccgacggcaggatctcggcggcgaagctgcggctgtgcatgaaggcgacgctaggcgag120gacgtgtcggcggaggacgccgaggcgctcttggcgtcggccaacgccgacggataccag180ctgctggacgagcaggagttcctccggctggtggcgcggccggagacggaggaggaggag240gagcggtgcagggggctgagggaggcattcgcgatgtacgaggtgaagggcgaagggtgc300atcacgccgtcgagcctgatgcggatgctcgccaggctggggtccgaacagggcatcgag360gagtgccgcgccatgatccgcatgtttgatttgaatgaagacggactggtttgctacgac420gagttcaaggttatgatggatgcgtag447<210>2<211>148<212>PRT<213>本发明基因表达的蛋白的氨基酸序列<400>2MetValHisAlaAlaThrAlaGluCysPheSerSerValPheAlaSer151015PheAspHisAspAlaAspGlyArgIleSerAlaAlaLysLeuArgLeu202530CysMetLysAlaThrLeuGlyGluAspValSerAlaGluAspAlaGlu354045AlaLeuLeuAlaSerAlaAsnAlaAspGlyTyrGlnLeuLeuAspGlu505560GlnGluPheLeuArgLeuValAlaArgProGluThrGluGluGluGlu65707580GluArgCysArgGlyLeuArgGluAlaPheAlaMetTyrGluValLys859095GlyGluGlyCysIleThrProSerSerLeuMetArgMetLeuAlaArg100105110LeuGlySerGluGlnGlyIleGluGluCysArgAlaMetIleArgMet115120125PheAspLeuAsnGluAspGlyLeuValCysTyrAspGluPheLysVal130135140MetMetAspAla145<210>3<211>29<212>DNA<213>本发明基因的引物-F<400>3attgcgggatccatggtgcacgctgcgac29<210>4<211>31<212>DNA<213>本发明基因的引物-R<400>4attgccctcgagctacgcatccatcataacc31<210>5<211>17<212>DNA<213>本发明基因的引物-S<400>5ggtccgaacagggcatc17<210>6<211>20<212>DNA<213>本发明基因的引物-A<400>6accttgaactcgtcgtagca20<210>7<211>19<212>DNA<213>GAPDH-S<400>7ccaagccagccacctatga19<210>8<211>20<212>DNA<213>GAPDH-A<400>8tggaaacaaggtcctcatcg20当前第1页1 2 3