专利名称：重组sars冠状病毒m蛋白的表达和纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，特别涉及到重组SARS冠状病毒M蛋白的表达和纯化。
背景技术：
严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是新发现的传染病[Poutanen SM，Low DE，Henry B et al.Identificationof severe acute respiratory syndrome in Canada，N Engl J Med，www.nejm.org，March 31，2003，10.1056/NEMoa 030634；Lee N，Hui D，Wu A，Chan P，Cameron P，Joynt GM，Ahuja A，et al.A major outbreakof severe acute respiratory syndrome in Hong Kong，N Engl J Med，www.nejm.org，April 7，2003，10.1056/NEJMoa 030685]。SARS冠状病毒为导致该病的病原体[Peiris J，Lai S，Poon L，Guan Y，Yam LY，LimW，Nicholls J，et al.Coronavirus as a possible cause of severe acuterespiratory syndrome，Lancet，2003，3611319-1325；Ksiazek TG，Erdman D，Goldsmith CS，Zaki SR，Peret T，Emery S，Tong S，et al.Anovel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，NEngl J Med，www.nejm.org，April 10，2003，10.1056/NEJMoa 020781]。其基因组测序已经完成[Rota PA，Oberste MS，Stephan S，Monroe SS，Nix WA，Campagnoli R，Icenogle JP et al.Characterizationof a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，Sciencexpress/www.scienceexpress.org/l May 2003/Page1/10.1126/science.1085952；Marra MA，Jones SJM，Astell CR，Holt RA，Brooks-Wilson A，Butterfield YSN，Khattra J et al.The genome sequenceof the SARS-associated coronavirus，Sciencexpress/www.sciencexpress.org/l May 2003/Page1/10.1126/science.1085953]。
通过对已知冠状病毒的基因组比较，SARS病毒的M蛋白(Membrane glycoprotein)基因得到确认。M蛋白是冠状病毒基质糖蛋白，由221个氨基酸构成。分析显示M蛋白存在三个跨膜螺旋，大致定位于15-37，50-72和77-99氨基酸。M蛋白在病毒颗粒内部有一个121个氨基酸的亲水区，被认为是与核蛋白体相互作用的区域[7]。对已知的冠状病毒的研究已经证明，M蛋白在冠状病毒的组装和出芽中起了关键的作用，M蛋白与S蛋白的结合对病毒包膜的构成是必不可少的。M蛋白还与病毒引起的细胞凋亡密切相关，在没有其它病毒组分的情况下，单独的M蛋白就可以引起Hela细胞和BHK细胞的凋亡。M蛋白在病毒侵染的早期抑制寄主细胞的基因转录。
重组M蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗[Kopecky SA，Lyles DS Constrasting effects of matrix proteinon apoptosis in Hela and BHK cells infected with vesicularstomatitis virus are due to inhibition of host gene expression，J Virol，2003，77(8)465 8-69；Wang LF，Gould AR，Selleck PW et alExpression of equine morbillivirus(EMV)matrix and fusionproteins and their evaluation as diagnostic reagents，Arch Virol 19971422269-2279]。但是表达M蛋白有一定难度，目前为止只有Caninecoronavirus中的M蛋白用pQE30得到了表达，且表达量很低〔Wang LF，Gould AR，Selleck PW.Expression of equine morbillivirus(EMV)matrix and fusion proteins and their evaluation as diagnostic reagents，Arch Virol，1997，1422269-2279〕。因此，高效表达和纯化重组SARS病毒M蛋白是诊治SARS的一个重要基础，同时也是研究SARS病毒蛋白结构的必需环节。
因此，本领域迫切需要开发高效表达和纯化重组SARS病毒M蛋白的方法，以便能够大量生产供科学研究和制备疫苗的重组SARS病毒M蛋白。
发明内容
本发明的目的就是提供重组SARS冠状病毒M蛋白的表达和纯化的方法，以获得大量的重组SARS病毒M蛋白。
本发明的第一方面，提供了一种表达纯化重组SARS病毒M蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)提供SARS病毒M蛋白基因；(2)将上述M蛋白基因插入表达载体；(3)用步骤(2)的表达载体转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；(4)在表达条件下，培养宿主细胞，使表达重组SARS病毒M蛋白；
(5)分离纯化步骤(4)所述的重组SARS病毒M蛋白。
在一优选例中，步骤(1)所述基因采用反转录PCR法扩增。较佳的，所述PCR扩增引物为SEQ NO3，SEQ NO4。
在另一优选例中，步骤(2)所述表达载体选自pMAL-cRI。
在另一优选例中，步骤(4)所述表达条件是在丰富培养基中培养菌体至OD值为0.6±0.2。较佳的，当菌体的OD值为0.6±0.2时，在37±2℃下，用0.5±0.2mM IPTG诱导培养2±0.5小时。
在另一优选例中，步骤(4)所述宿主细胞为大肠杆菌。
在另一优选例中，步骤(5)所述分离纯化包括用亲和层析进行纯化。
本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为按本发明所述方法获得的融合重组表达产物。
在一优选例中，所述融合蛋白为与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白。
在另一优选例中，所述融合蛋白另一端融合了MxeGyrA inteinCBD。
本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，含有安全有效量的本发明上述的SARS病毒M蛋白及药学上可接受的载体。
在一优选例中，本发明所述药物组合物为疫苗组合物。所述疫苗组合物含有免疫有效量的本发明上述的SARS病毒M蛋白及药学上可接受的载体。较佳的，所述疫苗组合物还含有佐剂。
本发明的第四方面，提供了一种疫苗组合物，其特征在于，含有免疫有效量的本发明上述的融合蛋白及药学上可接受的载体。较佳的，所述疫苗组合物还含有佐剂。
图1.SDS-PAGE检测大肠杆菌JM109(DE3)中重组表达的M蛋白1，JM109(DE3)/pMALMD，沉淀2，JM109(DE3)/pMALMD，上清3，Marker(97kD，66.2kD，43kD，31kD)4，JM109(DE3)/pMALMD，全细胞裂解液5，JM109(DE3)/pMAL-cRI，全细胞裂解液图2.用抗CBD的抗体Western印迹检测重组表达的M蛋白1，蛋白Marker(New England Biolab #B7709S)2，JM109(DE3)/pMALMD沉淀，未诱导，3，JM109(DE3)/pMALMD上清，未诱导4，JM109(DE3)/pMALMD沉淀，用0.5mMIPTG诱导5，JM109(DE3)/pMALMD上清，用0.5mMIPTG诱导6，JM109(DE3)/pTXB1全细胞，用0.5mMIPTG诱导图3.SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白1-5，依次为从Amylose Resin上洗脱的图2中2-6组分；6，Marker(97kD，66kD，43kD，31kD).
图4.重组表达的M蛋白的质谱图具体实施方式
为了表达M蛋白，本发明人尝试了pQE30以及pET24a、pET32b、pGEX2T、pGEX4T、pKK233-2、pT7ZZa、pThioHisA、pTYB12等许多原核表达载体和pPIC9、pPIC3.5K、pAS2等真核表达载体，但用SDS-PAGE都没能检测到M蛋白的表达。最终采用pMAL-cRI构建表达质粒才获得了表达产物。
在本发明中，除表达载体的选择，培养和表达条件外，其它工艺条件均可采用本领域常规条件。
SARS病毒M蛋白与S蛋白构成了病毒最外层的结构，因此本发明所表达的SARS病毒M蛋白可用于SARS疾病诊治，疫苗制备和结构生物学研究。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料(Material)1.质粒、菌株与培养基大肠杆菌表达质粒pMAL-cRI和pTXB1购自New EnglandBiolabs公司。质粒pBluescriptSK(+)，大肠杆菌宿主细胞JM109(DE3)为市售的。
培养E.coli时用LB培养基(Tryptone，10g/L；Yeast Extract，5g/L；NaCl，10g/L.pH7.0)，以表达蛋白为目的时用丰富培养基(Tryptone，10g/L，Yeast Extract，5g/L，NaCl，5g/L，Glucose 2g/L)。
2.试剂PCR引物由赛百盛合成，限制性内切酶，PyrobestTMDNA聚合酶，dNTP购自Takara公司。Anti-Chintin Binding Serum和AmyloseResin购自New England Biolabs公司。二抗购自Promega公司。其它试剂均为进口分装或国产分析纯。
实施例1 SARS病毒M蛋白基因的扩增收集SARS-CoV BJ-01(可从北京军事医学科学院获得)感染VeroE6细胞后的培养上清液，用Trizol试剂(Gibco)抽提病毒RNA。以随机引物为第一链DNA的起始引物进行反转录反应(20ul)。最后以M基因的特异引物扩增M基因，引物序列为引物1M15’-GGGGGATCCACCATGGCAGACAACGGTACTA-3’引物2M663r5’-GGGCTGCAGCTGTACTAGCAAAGCAATA-3’PCR产物经BamHI和PstI酶切后，插入pBluescriptSK(+)的相应位点得到pBM，经测序与已发表序列吻合。
将pBM用XbaI和EcoRI酶切，得到的片断插入pcDNA3.1(-)mychisA的相应位点得到pXM。
实施例2 表达载体的构建1.表达载体pMALM的构建表达载体选用pMAL-cRI，该载体为Tac启动子，重组表达的产物为N端融合了麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein(MBP)，约42kD)的蛋白。
用引物1和引物2以pXM为模板高保真扩增M基因，回收PCR产物，与EcoRV酶切后的pBluescriptSK(+)连接，得到pSKM，再用BamHI和SalI酶切pSKM，将得到的660bp的片段与BamHI+SalI酶切后的pMAL-cRI连接，得到pMALM。
引物35’-GTGGATCC(BamHI)ATGGCAGACAACGGTACT-3’引物45’-GCTCTAGATTACTGTACTAGCAAAGC-3’2.表达载体pTXBM的构建表达载体选用pTXB1，该载体为T7启动子，重组表达的产物为C端融合了MxeGyrA intein CBD(约26kD)的蛋白。
用引物3和引物4以质粒pBM为模板PCR扩增M基因，NdeI和XhoI酶切PCR产物，与NdeI+XhoI酶切后的pTXB1连接，得到pTXBM。
引物55’-GGAATTCCATATG(NdeI)GCAGACAACGGTACT-3’引物65’-AGACCTCGAG(XhoI)CTGATACTAGCAAAGCAATA-3’3.表达载体pMALMD的构建用引物5和引物6以pTXBM为模板，PCR扩增得到C端融合了Mxe intein CBD蛋白基因的M基因，用XbaI和PstI分别酶切PCR产物和质粒pMAL-cRI，连接，得到pMALMD。
引物75’-AAACTGCAG(PstI)TCATTGAAGCTGCCACAAGGCAG-3’引物85’-TGCTCTAGA(XbaI)ATGGCAGACAACGGTACTATTAC-3’实施例3 M蛋白的表达当含表达载体的菌体的OD值为0.6时，用0.5mM IPTG诱导，37℃培养2小时。离心收集菌体，悬浮于适量的细胞破碎液(20mMTris-HCl，200mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)，并用超声波破碎细胞。细胞粗提液通过SDS-PAGE及Gel Scan 4.0软件扫描分析。
讨论1.pMALM在大肠杆菌中的表达和M蛋白的溶菌现象将含有M蛋白基因的质粒pMALM转入宿主细胞JM109(DE3)进行诱导表达。有趣的是，含pMALM的表达细胞在加入IPTG诱导后细胞被裂解(OD600降低到0.3以下)，而不加入IPTG时细胞正常生长，这暗示溶菌现象可能与IPTG诱导的蛋白表达相关。将溶菌后的上清取3ul加入到另一个新鲜培养的大肠杆菌菌液中，菌能正常生长。因为噬菌体能在菌中自我繁殖，微量的噬菌体会在菌中大量繁殖，使菌体裂解，而M蛋白不能自我繁殖，当其被转移到新的培养液中时量不会增加，极微量的M蛋白不能引起菌体裂解。这说明溶菌的原因不是噬菌体，而可能是表达的M蛋白。
M蛋白引起大肠杆菌细胞死亡的原因目前还不清楚，也许它像其它冠状病毒中的M蛋白一样，具有出芽功能，在出芽的过程中引起大肠杆菌细胞膜的裂解，从而引起细胞死亡；或者它可以抑制大肠杆菌的基因转录，使细胞发生凋亡。
2.pTXBM的表达由于质粒pMAL-cRI的多克隆位点之前有一段42kD的融合蛋白，因此含pMALM的表达细胞经诱导后产生的蛋白应该是N端融合了该蛋白的M蛋白，溶菌现象表明此时M蛋白可能依然有出芽功能。因此如果融合蛋白在M蛋白的C端，也许可以改变蛋白的折叠情况，使M蛋白不再具有出芽功能，菌体就不会被裂解，使M蛋白有可能得到高表达。因此构建了pTXBM。
然而，实验表明pTXBM不能在大肠杆菌中得到高表达。这说明M蛋白的成功表达不仅依赖于融合蛋白，还与所用的表达载体的特性有关。
3.pMALMD的表达由于pMALM表达时有溶菌现象，而pTXBM又不能在大肠杆菌中高表达，因此构建了，希望通过在M蛋白的N端和C端都融合蛋白，抑制M蛋白的溶菌现象，从而使M得到高表达。
含pMALMD的表达细胞经IPTG诱导后，在约93kD处获得一新蛋白(图1)，该蛋白大小与估算的重组表达的M蛋白分子量相当。
实施例4 M蛋白的纯化和免疫印迹检测pMALMD的表达产物根据New England Biolabs公司的蛋白纯化手册，用Amylose Resin进行纯化。
免疫印迹检测根据Promega公司的《The Source for Discovery》第三版中提供的方法操作。重组表达的蛋白用抗融合蛋白Mxe inteinCBD的抗体Anti-CBD serum进行了Western检测(图2)。
含pMALMD的表达细胞粗抽提液可溶性部分经Amylose Resin得到初步纯化(图3)。重组蛋白纯化后伴随着一条约48kD左右的条带，这是因为大肠杆菌自身的MBP也可以与Amylose Resin结合。丰富培养基中的葡萄糖可以在一定程度上抑制大肠杆菌自身MBP的表达，从而降低纯化蛋白中MBP的比例。表达量占菌体蛋白的26％。
实施例5 M蛋白的质谱鉴定重组表达的蛋白经中科院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心进行质谱测定，结果表明表达的重组蛋白确实是M蛋白。测试主要参数如下检测方式为正离子，进样方式为Normal spray，毛细管温度为200度，Column为8mm×150mm(RP-18)，扫描范围为400-2000KDAL。实验结果见图4。
因为M蛋白的活性难以检测，因此需用质谱对表达产物进行确证。质谱鉴定出重组蛋白中含EITVTSRE、CDIKDLPK以及VGTDSGFAAYNR等3条肽段，搜索数据库表明，这3条肽段都是M蛋白(putativeprotein M)中的片段，占该蛋白分子量的12.09％，氨基酸组成的12.67％，因此鉴定为putative protein M中的片段。这说明重组融合蛋白中确实含有M蛋白。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>重组SARS冠状病毒M蛋白的表达和纯化<130>030829<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>663<212>DNA<213>SARS病毒<400>1atggcagaca acggtactat taccgttgag gagcttaaac aactcctgga acaatggaac60ctagtaatag gtttcctatt cctagcctgg attatgttac tacaatttgc ctattctaat120cggaacaggt ttttgtacat aataaagctt gttttcctct ggctcttgtg gccagtaaca180cttgcttgtt ttgtgcttgc tgctgtctac agaattaatt gggtgactgg cgggattgcg240
attgcaatgg cttgtattgt aggcttgatg tggcttagct acttcgttgc ttccttcagg300ctgtttgctc gtacccgctc aatgtggtca ttcaacccag aaacaaacat tcttctcaat360gtgcctctcc gggggacaat tgtgaccaga ccgctcatgg aaagtgaact tgtcattggt420gctgtgatca ttcgtggtca cttgcgaatg gccggacact ccctagggcg ctgtgacatt480aaggacctgc caaaagagat cactgtggct acatcacgaa cgctttctta ttacaaatta540ggagcgtcgc agcgtgtagg cactgattca ggttttgctg catacaaccg ctaccgtatt600ggaaactata aattaaatac agaccacgcc ggtagcaacg acaatattgc tttgctagta660cag 663<210>2<211>221<212>PRT<213>SARS病毒<400>2Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu15 10 15Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met20 25 30
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<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物<400>8tgctctagaa tggcagacaa cggtactatt ac3权利要求
1.一种表达纯化重组SARS病毒M蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)提供SARS病毒M蛋白基因；(2)将上述M蛋白基因插入表达载体；(3)用步骤(2)的表达载体转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；(4)在表达条件下，培养步骤(3)所述宿主细胞，使表达重组SARS病毒M蛋白；(5)分离纯化步骤(4)所述的重组SARS病毒M蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述表达载体选自pMAL-cRI载体。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述表达条件是在丰富培养基中培养菌体至OD值为0.6±0.2。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述表达条件是当菌体的OD值为0.6±0.2时，在37±2℃下，用0.5±0.2mMIPTG诱导培养2±0.5小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述宿主细胞为大肠杆菌。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述分离纯化包括用亲和层析进行纯化。
7.一种融合蛋白，其特征在于，按权利要求1所述方法获得的融合重组表达产物。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为SARS病毒M蛋白与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白另一端融合了MxeGyrA intein CBD。
10.一种药物组合物，其特征在于，含有安全有效量的权利要求1所述的SARS病毒M蛋白及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了重组SARS冠状病毒M蛋白的表达和纯化方法。本发明人将SARS冠状病毒M基因克隆到不同的菌体表达载体中表达。结果，M蛋白在大肠杆菌中得到高度表达，经亲和层析纯化得到重组SARS冠状病毒M蛋白，所表达的蛋白占菌体总量的26％。本发明表达的重组SARS冠状病毒M蛋白可用于SARS诊治、结构生物学研究和疫苗制备等。
文档编号C12N15/63GK1597964SQ03159428
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月17日 优先权日2003年9月17日
发明者姜卫红, 张晓丽, 王晶茹, 谢幼华, 汪垣, 杨晟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院