专利名称：光敏芳香杂环化合物高效快速降解基因组dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用光敏芳香杂环化合物切断剂将大分子核酸非特异性地降解成小片段的方法。
背景技术：
核酸大分子非特异性地降解或分解成合适的片段在许多领域都是非常重要的。这些领域包括1)DNA序列分析；2)DNA足迹技术；3)从细胞中提取蛋白质或酶的分离纯化过程；4)其他需要将大分子核酸降解的领域。
1)DNA序列分析对于大分子核酸如基因组的DNA测序，鉴于每一个测序反应对DNA的长度有限制，一般需要先将大片段的DNA降解成较小的片段。常规方法是用核酸酶处理，或者超声波打段核酸片段之后电泳分离。核酸酶价格昂贵，在测序之前需要彻底去除；而超声波法间歇性高频率打断核酸大分子的操作过程不易控制，因此合适的降解核酸的方法仍值得探索。
2)DNA足迹技术DNA足迹技术主要用于检测和鉴定转录因子对DNA的序列特异性结合能力，如果同时进行DNA化学测序，即可判断出结合区的精确顺序。该技术仍然是目前最常用的研究DNA-蛋白质相互作用的最常用方法。通常，未与蛋白质结合的DNA都是用DNaseI来解降，但是核酸酶往往分子尺寸太大而不能获得高的分辨率(Nature，1988，332(6165)663)，因此研究开发一类小分子DNA切割剂替代大分子核酸酶将十分有意义(Chinese Science Bulletin，2000，45(2)2017-2028)。
3)蛋白质或酶的制备从细胞中提取酶等蛋白质分子过程中，首先要经过细胞破碎。细胞破壁之后，其胞内核酸的存在会增加体系的粘度从而干扰酶的分离纯化，特别是进行超滤操作时该现象更为突出。除了某些生物体自身含有高活性核酸酶，不存在此问题以外，一般情况下核酸必须通过加入沉降剂沉降或加入外源的核酸酶降解。另外，如果纯化的目标是以包含体的形式存在，因包含体在形成过程中会结合核酸，因此其预处理也是需要除核酸。
目前公开使用的有多种更专一的沉淀剂，即一些带正电的可以与带负电的核酸磷酸残基形成复合物的物质。按其效率由大到小的顺序，这些化合物是聚乙烯亚胺，阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵，硫酸链霉素以及硫酸鱼精蛋白。同样地，他们也会与某些酶形成我们所不希望存在的复合物。硫酸铵沉淀法可以很有效地除核酸，但同时也会将一些蛋白质去除，影响目的蛋白质的收率。
有一点十分重要的是用于分解核酸的试剂不能损伤蛋白质，而且可以很容易将他们从纯化步骤中去除。通常人们在分离纯化之前的予处理阶段，用核酸降解酶来除核酸，然后在后面的阶段检测验证这些酶确已被去除。但是，这些酶都非常昂贵。因此，新的降解核酸的方法将十分有前途。
有时，核酸需通过阴离子交换层析(如DEAE-和Q-等阴离子交换剂)高效去除，以保证蛋白质制品特别是用于人体注射目的的蛋白质药物绝对不含核酸。在这种情况下，细胞破碎液中的核酸也需要在上柱前先行降解，以降低粘度，避免核酸分子与分离介质或蛋白质结合从而损害分离纯化的效率。
综上所述，无论是从常规应用的角度或是从分离纯化角度，安全快速高效的核酸去除方法在蛋白质或酶制作过程中是十分重要的。
4)其他在其他需要将大分子核酸降解的领域中，包括便于人体或动物吸收的核酸营养品等。
本发明的目的是提供一种光敏化合物切断剂高效快速降解大分子核酸生成小片段的方法。
发明内容
本发明提供了一种能对光能量具有强烈吸收的光敏芳香杂环化合物作为DNA切断剂，在光照下产生活泼自由基或引发电子转移，高效快速将生物体动、植物或微生物细胞破碎液、质粒DNA或基因组DNA中大分子核酸降解切断成小片段的新方法。
本方法用来作为DNA切断剂的光敏芳香杂环化合物有萘酰亚胺，氧或硫杂蒽，蒽醌，呫吨，罗丹明，菁染料，金属酞菁，联苯，联萘，芘，苝，苝酰亚胺或香豆素衍生物。
本方法所用的生物体细胞有动物细胞是软体动物或脊椎动物细胞；植物细胞是裸子植物或双子叶植物细胞；微生物细胞是细菌或病毒。
本方法是将上述光敏芳香杂环化合物直接加到生物体细胞破碎液、质粒DNA或基因组DNA中，至其终浓度为10μM-1.0M，同时在UV300-600nm光照下反应0.5-10小时，将大分子核酸切断降解成小片段。
本方法应用于DNA序列分析、DNA足迹技术，从细胞中提取蛋白质或酶的分离纯化过程核酸的降解以及其它需要将大分子核酸降解的领域。
本发明提供的光敏芳香杂环化合物降解核酸的方法具有以下特点(1)在工作浓度时的化合物对蛋白质没有损伤作用；(2)其在光照条件下能够产生自由基或引发电子转移；(3)反应不需要引入可能造成污染的金属离子；(4)该方法灵敏快捷，操作简单。
图1为1％琼脂糖凝胶电泳分析合成物对基因组DNA的降解效率栏1-栏9，分别加入合成物N-丁基苯并硫杂蒽-1，3-酰亚胺(R-1)，N-二甲胺基乙基苯并硫杂蒽-1，3-酰亚胺(R-2)，N-哌嗪基乙基苯并硫杂蒽-1，3-酰亚胺(R-3)，N-Z甲胺基丙基苯并硫杂蒽-1，3-酰亚胺(R-4)，N-(间氟对氯苯酰氧基)硫代萘酰亚胺(C-I)，N-(呋喃酰氧基)硫代萘酰亚胺(C-II)，N-(间二甲氧基苯酰氧基)硫代萘酰亚胺(C-III)，N-(邻氯间吡啶酰氧基)硫代萘酰亚胺(C-IV)，N-丁基萘酰亚胺并噻二唑(S)后，质粒pBR322DNA的降解情况；栏10，pBR322DNA空白对照。
图2为合成物存在下大肠杆菌DNA的降解情况栏1，加入合成物N-二甲胺基乙基苯并硫杂蒽-1，3-酰亚胺(R-2)；栏2，基因组NDA空白对照；栏3，加入合成物N-二甲胺基丙基苯并硫杂蒽-1，3-酰亚胺(R-4)；栏4，加入合成物N-丁基萘酰亚胺并噻二唑(S)。
图3为合成物N-丁基萘酰亚胺并噻二唑(S)对植物基因组DNA的损伤作用栏1，大豆基因组不加入合成物，空白对照；栏2，玉米基因组不加入合成物，空白对照；栏3，大豆基因组加入合成物；栏4，玉米基因组加入合成物。
具体实施例方式
实施例1 大肠杆菌细胞的破碎及其基因组DNA的提取超净工作台中挑取单菌落，接种于10ml的LB液体培养基(Amp+)中，30℃， 180rpm下振荡活化培养过夜(12-14h)。次日接种2％菌体于250ml新鲜培养液中，37℃，180rpm培养，至OD600吸收值为0.6，加入异丙基-β-D-巯基半乳糖至终浓度1mM，继续诱导表达3小时，离心(6,500rpm，10min)收集菌体。按湿重1∶5(W/V)加入冰冷缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH8.0)，悬浮5分种，之后加入5g溶菌酶(Amresco公司)，获得细胞破碎液。取1000ml菌液在4500-5000rpm下离心5min。弃上清，保留沉淀。向沉淀中加入溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8.0，10mM乙二胺基四乙酸EDTA)100ml，轻轻震荡，然后再向其中加入溶液II(0.2M NaOH，1％十二烷基磺酸钠SDS)20ml，轻轻混匀，这时溶液中出现絮状物。向其中加入溶液III(5M乙酸钠，60.0ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)20ml，冻存20-30min。10000rpm离心20min。取上清，用纱布过滤。滤液与等体积(或0.6倍体积)异丙醇混匀，放置10min。4℃下，10000rpm离心10min。弃上清，然后加入70％乙醇摇动，使沉淀重新溶解。4℃下，10000rpm离心10min。沉淀在自然的条件下干燥保存。
实施例2 合成物对质粒DNA，基因组DNA以及细胞破碎液中核酸杂质的降解1)对质的降解考察溶于缓冲液10mM Tris/HCl，20mM NaCl，pH7.5，终浓度为50μM不同化合物R-1，R2，R3，S，R-4；C-I，C-II，C-III，C-IV，在UV400nm光照下，反应体系为10μl，上样量1μl，1％琼脂糖电泳跟踪分析对于pBR322(500ng/μl)切断的情况，发现均表现出极高的DNA切断活性(图1)。化合物R-1将I型质粒pBR322降解成小片段；化合物R-2将质粒pBR322由I型转化为II型，最后转化为III型DNA；化合物R-3将质粒pBR322由I型转化为II型，最后降解成小片段；化合物R-4主要将质粒pBR322由I型转化为II型，最后转化为III型DNA；化合物S将质粒pBR322由I型转化为II型和III型DNA；化合物C-系列均具有将I型质粒pBR322降解成小片段的功能。
2)对大肠杆菌基因组DNA的降解将R系列化合物直接加入到大肠杆菌基因组DNA(5.2×106bp)中至其终浓度为50μM，同时在UV400nm光照反应2hr，观察降解效果(图2)。
3)合成物对植物细胞破碎液中基因组DNA的降解将合成物R-4直接加入到玉米基因组DNA(1×1011bp)和大豆基因组DNA(1.7×109bp)中至其终浓度为0.0005M，同时光照2hr，观察降解效果(图3)。
权利要求
1.一种用有机化合物降解核酸的方法，其特征在于本方法用来作为核酸切断剂的有机合成物为光敏芳香杂环化合物是萘酰亚胺，氧或硫杂蒽，蒽醌，呫吨，罗丹明，菁染料，金属酞菁，联苯，联萘，芘，苝，苝酰亚胺或香豆素衍生物；该方法是将上述光敏芳香杂环化合物直接加到生物体细胞破碎液、质粒DNA或基因组DNA中，至其终浓度为10μM-1.0M，同时在UV300-600nm光照下反应0.5-10小时，将大分子核酸切断降解成小片段。
2.按照权利要求1所述降解核酸的方法，其特征在于本方法所用的生物体细胞有动物细胞是软体动物或脊椎动物细胞；植物细胞是裸子植物或双子叶植物细胞；微生物细胞是细菌或病毒。
3.按照权利要求1所述降解核酸方法的用途，其特征是应用在除DNA足迹技术外的DNA序列分析、从细胞中提取蛋白质或酶的分离纯化过程核酸的降解以及其它需要将大分子核酸降解的领域。
全文摘要
本发明提供了一种利用光敏芳香杂环化合物作为DNA切断剂，在光照下产生活泼自由基或引发电子转移，高效快速将生物体动、植物或微生物细胞破碎液、质粒DNA或基因组DNA中的大分子核酸降解切割成小片段的新方法。该方法具有在工作浓度的化合物对蛋白质没有损伤作用；化合物在光照条件下能够产生自由基或引发电子转移；反应不需引入可能造成污染的金属离子；该反应灵敏快捷，操作简单等特点；可用于DNA序列分析、DNA足迹技术、从细胞中提取蛋白质或酶的分离纯化过程核酸的降解以及其它需要将大分子核酸降解的领域。
文档编号C12Q1/68GK1491954SQ0315953
公开日2004年4月28日 申请日期2003年9月17日 优先权日2003年9月17日
发明者杨青, 钱旭红, 许建强, 杨 青 申请人:大连理工大学