专利名称：鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明属于生物细胞工程技术领域，特别涉及一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的接触性传染病，是危害养鸡业最严重的传染病之一。鸡大肠杆菌种类繁多，有170多种血清型，但大多数为非致病性，只有极少数是致病菌。其菌毛在致病性大肠杆菌侵入机体，并在机体内定居、增殖、致病的过程中起着重要作用。大肠杆菌菌毛类型很多，且复杂。但对鸡源致病性大肠杆菌来说，目前只发现两种重要菌毛F1和P。两种菌毛均由细菌的染色体编码，其分子量为17KD和18KD，这两种菌毛是鸡致病性大肠杆菌的标志。具有F1菌毛的大肠杆菌可粘附于动物细胞，这种粘附可被D-甘露糖抑制。F1菌毛可与鸡的气管和气囊黏膜的受体结合，构成大肠杆菌入侵的第一步。P菌毛具有红细胞血凝特性，对内脏型和败血型大肠杆菌病起着决定作用。目前国内外对F1和P菌毛进行诸多的研究，但研究受到极大的限制。主要原因是现在研究所用的菌毛抗血清都是多克隆的抗血清，其特异性差，存在着交叉反应，效价低，批次间差异大，制备麻烦，难以推广，不易标准化，不能有效区分F1、P和其他菌毛，满足不了研究的需要。另外大肠杆菌病的防治主要靠疫苗，但目前大肠杆菌疫苗普遍反映效果不理想，归其原因主要是无法筛选优良的制苗菌株，也无法测定其致病性和F1、P菌毛表达的数量。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法。使用该方法所制备的鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体，应具备特异性强，无交叉反应，效价高，批次间差异小，制备方便，容易推广，容易标准化，能够有效区分F1、P和其他菌毛的特点。
本发明包括①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株→②制备免疫原→③免疫BALB/C小鼠→④融合杂交瘤细胞→⑤筛选杂交瘤细胞→⑥筛选阳性杂交瘤细胞→⑦克隆化→⑧再克隆→⑨制备单抗腹水→⑩测定单抗腹水效价十大步骤，各步骤之间依次连接为先后关系；本发明所制备的菌毛F1单抗或菌毛P单抗只与含有F1菌毛(17KD蛋白)或含有P菌毛(18KD蛋白)的鸡大肠杆菌发生反应，而不与其他细菌发生反应，也不与其他大肠杆菌的菌毛发生反应。
所述的步骤①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株，将产F1菌毛和产P菌毛的大肠杆菌在改良TSB培养基上37～40℃静置培养40～48h，然后在改良TSB琼脂上37～40℃培养18～24h，挑选单个菌落与常规单因子血清做玻板凝集，筛选菌毛表达良好的菌落，进行连续传代3次；末代培养物离心后，将沉淀用生理盐水悬浮后经磷钨酸染色，电镜观察；当见细菌体周生菌毛，且视野中细菌的菌毛表达良好，作为试验菌种。
所述的步骤②制备免疫原，将筛选后菌种用改良TSB培养基在37～40℃静置培养40～48h，用分光光度计测定菌体浓度后，用灭菌生理盐水稀释至6×108～2×109个细菌/ml，0.2％甲醛灭活。
所述的步骤③免疫BALB/C小鼠，将灭活抗原与等量弗氏完全佐剂混合，震荡乳化半小时；乳化完全后腹腔注射6～8周龄BALB/C小鼠(0.3ml/只)；2周后用弗氏不完全佐剂同法进行第2次免疫；二免后14天，用灭活抗原腹腔注射免疫鼠(0.2ml/只)，3天后融合。
所述的步骤④融合杂交瘤细胞，分别对免疫鼠、用于饲养细胞的ICR小鼠眼球采血并分离血清，作为筛选单抗时的阳性、阴性血清对照。无菌取免疫鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用50％PEG1000融合。
所述的步骤⑤筛选杂交瘤细胞，融合后用HAT作为选择性培养基，同时加入饲养细胞，分装在96孔和24孔细胞培养板，置37℃、6％CO2培养箱内培养，7～10天进行观察，有生长的细胞就为杂交瘤细胞。
所述的步骤⑥筛选阳性杂交瘤细胞，用全菌包被的间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞；用筛选好的菌毛化程度高的大肠杆菌F1菌毛、P菌毛作包被抗原，包被浓度为8～12×108个细菌/ml，以颗粒性抗原包被法包被酶标板，筛选阳性杂交瘤；对初检阳性的杂交瘤细胞在液氮中保存一份，并同时进行克隆化。
所述的步骤⑦克隆化，采用稀释法进行克隆化，再按上述的步骤⑥进行检测，阳性克隆细胞在液氮中保存一份，一份进行再克隆。
所述的步骤⑧再克隆，按步骤⑦克隆化进行，对分泌抗体进行特异性鉴定，(详见表1、表2)以建立具有稳定分泌特异性抗体能力的克隆株；再克隆的阳性细胞在液氮中保存一份。
所述的步骤⑨制备单抗腹水，将经降植烷处理的BALB/C小鼠，腹腔内注射鉴定后再克隆的杂交瘤细胞，注射量为5×105个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清备用。
所述的步骤⑩测定单抗腹水效价，(1)ELISA效价包被同步骤⑥，抗原为完全菌毛化的菌株，浓度为8～12×108个/ml，将所获得的Y1、Y2腹水单抗倍比稀释，与包被抗原间接ELISA，测定腹水效价；(2)试管凝集价分别将Y1腹水单抗倍比稀释，与浓度为1.5～3×109个/ml已菌毛化的大肠杆菌做试管凝集反应，测试管凝集价。
使用本发明还涉及到鸡大肠杆菌菌毛培养提纯技术和单克隆抗体的特异性鉴定。
A、鸡大肠杆菌菌毛培养提纯技术1)F1菌毛的提取菌毛的提取是采用Hide等的方法，略加改进。大肠杆菌C600在MD液体培养基上传代2次，经电镜观察菌毛表达充分后扩大培养于5000mlMD液体培养基；37℃培养48小时后，4500r/min离心细菌培养物，将菌体沉淀用200mlPBS悬浮，在60℃水浴锅中轻轻震荡20分钟，然后在磁力搅拌器上快速搅拌15分钟，8000r/Min离心20分钟，吸出上清，加等量饱和硫酸铵沉淀菌毛。4℃过夜后以6000r/min离心20分钟；沉淀用3mlPBS悬浮，-20℃保存备用。
2)P菌毛的提取P菌毛的提取是采用Hide等的方法，加以改进。简述如下大肠杆菌C1976-79在TSB液体培养基上传代2次，经电镜观察苗毛表达充分后扩大培养于5000mlTSB液体培养基；37℃培养48小时后，4500r/min离心细菌培养物20分钟，将菌体沉淀用200ml PBS悬浮，在60℃水浴锅中轻轻震荡20分钟，然后在磁力搅拌器上快速搅拌15分钟，8000r/min离心20分钟，吸出上清，加等量饱和硫酸铵沉淀菌毛。4℃过夜后以6000r/min离心20分钟；沉淀用3ml PBS悬浮，-20℃保存备用。
B、单克隆抗体的特异性鉴定1)F1菌毛单抗的特异性鉴定表1、抗F1菌毛的单抗(Y1)与大肠杆菌、沙门氏菌的凝集排谱反应菌株 血清型 与单抗反应性y1参考菌株C600 O1F1+++++C1214-77 O6K2H1F1a\b++++已知F1+鸡致病性大肠杆菌株1 O103F1++++2 O11F1++++3 O30F1++++4 O115F1++++5 O78F1++++6 O131F1++++猪源致病性大肠杆菌C83901O8K87K88ab-C83907O149K91K88ab-UP001 O8；K87；K88ab-C83539O141K99-C83707O101K30F41-8199 O101F18acH4-107/86O139K12F18acH7-沙门氏菌株S.typhinu -S.newport -S.enteritidis -S.anatum-S.Newington -
S.seftrnberg -S.Aberdeen -2)P菌毛单抗的特异性鉴定表2、抗鸡大肠杆菌P菌毛单抗(Y2)与大肠杆菌的排谱反应与单抗反应性菌株血清型 红细胞凝集反应(HA)Y2标准菌株(1976)79O1K1H，P++ ++++C1214-77O6K2H，F1a、b--C1253-77O18acK5H-F1c--C600O1，fim+--Tk3 O78，fim+，p+++++鸡源致病性大肠杆菌202 O78++++149 O78++++265 O78++++522 O78+++12 O114+ +++CE4 O2++++CE30 O1+++CE39 O1+++CE40 O1++++CE38 O1+++CE73 O1++++猪源致病性大肠杆菌107/86 O139K12F18abH7- -C83707O101K30F141+ -C83901 O8K87、K88ab- -
C83539 O141K99- -C83916 O20987p - -使用本发明所制备的鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体，与常规菌毛抗血清相比有很多优点，详见表3表3菌毛单抗与常规菌毛抗血清的区别 DA直接凝集反应；ELISA酶联免疫吸附试验；利用本发明制备的鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体可以直接鉴定鸡致病性大肠杆菌；测定菌毛的表达程度；筛选鸡大肠杆菌制苗菌株；用于鸡大肠杆菌致病机理的研究；具有广泛的研究和商业使用价值。F1和P菌毛单抗的生物学特性，详见表4
表4 F1和P菌毛单抗的生物学特性 DA直接凝集反应；ELISA酶联免疫吸附试验；
图1是本发明实施例单抗体的制备过程2是本发明实施例的工艺方法流程图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例进行说明图1描述了本发明实施例单抗体的制备过程。由图中可看出用预定的抗原免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞(SP2/0)融合，形成具有双亲特征的杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞既像脾淋巴细胞那样能合成和分泌针对预定抗原的抗体，又像骨髓瘤细胞那样在体外培养中永生不死。通过克隆化可得到来自单个细胞的杂交瘤细胞系，它所分泌的抗体是针对同一抗原决定簇的，在分子上是同质的抗体，即所谓的单克隆抗体(Monoclonal antibody)，简称单抗。
因为单抗是针对单个抗原决定簇的在分子上完全同质的抗体，所以单抗的特异性是多抗不能比拟的。用单抗可以对抗原物质作多抗无法进行的精细分析和测试。单抗可用体内或体外方法无限量生产，且比多抗易于提纯，因此作为试剂更容易标准化。
参考附图1、2，本发明实施例包括①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株→②制备免疫原→③免疫BALB/C小鼠→④融合杂交瘤细胞→⑤筛选杂交瘤细胞→⑥筛选阳性杂交瘤细胞→⑦克隆化→⑧再克隆→⑨制备单抗腹水→⑩测定单抗腹水效价十大步骤，各步骤之间依次连接为先后关系；本发明所制备的菌毛F1单抗或菌毛P单抗只与含有F1菌毛(17KD蛋白)或含有P菌毛(18KD蛋白)的鸡大肠杆菌发生反应，而不与其他细菌发生反应，也不与其他大肠杆菌的菌毛发生反应。
所述的步骤①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株，将产F1菌毛大肠杆菌C600和产P菌毛的大肠杆菌C1976-79分别在改良TSB培养基上37～40℃静置培养48h，然后分别在改良TSB琼脂上37～40℃培养24h，分别挑选单个菌落与常规单因子血清做玻板凝集，分别筛选菌毛表达良好的菌落，分别进行连续传代3次；末代培养物分别离心后，分别将沉淀用生理盐水悬浮后经磷钨酸染色，电镜观察；当分别见细菌体周生菌毛，且视野中细菌的菌毛表达良好，分别作为试验菌种。
所述的步骤②制备免疫原，分别将筛选后菌种用改良TSB培养基在37-40℃静置培养48h，分别用分光光度计测定菌体浓度后，分别用灭菌生理盐水稀释至6×108～2×109个细菌/ml，0.2％甲醛灭活。
所述的步骤③免疫BALB/C小鼠，分别将灭活抗原与等量弗氏完全佐剂混合，震荡乳化半小时；分别乳化完全后腹腔注射8周龄BALB/c小鼠(0.3ml/只)；2周后分别用弗氏不完全佐剂同法进行第2次免疫；二免后14天，分别用灭活抗原腹腔注射免疫鼠(0.2ml/只)，3天后融合。
所述的步骤④融合杂交瘤细胞，分别对免疫鼠、用于饲养细胞的ICR小鼠眼球采血并分离血清，作为筛选单抗时的阳性、阴性对照。分别无菌取免疫鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用50％PEG1000融合。
所述的步骤⑤筛选杂交瘤细胞，融合后分别用HAT作为选择性培养基，同时加入饲养细胞，分装在96孔和24孔细胞培养板，置37℃、6％CO2培养箱内培养，7～10天进行观察，有生长的细胞就为杂交瘤细胞。
所述的步骤⑥筛选阳性杂交瘤细胞，分别用全菌包被的间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞；分别用筛选好的菌毛化程度高的大肠杆菌C1214-77(F1菌毛)、EB(P菌毛)作包被抗原，包被浓度为8～12×108个细菌/ml，以颗粒性抗原包被法包被酶标板，筛选阳性杂交瘤；分别对初检阳性的杂交瘤细胞在液氮中保存一份，并同时进行克隆化。
所述的步骤⑦克隆化，分别采用稀释法进行克隆化，再分别按上述的步骤⑥进行检测，阳性克隆细胞在液氮中保存一份，一份进行再克隆；所述的步骤⑧再克隆，分别按步骤⑦克隆化进行，对分泌抗体进行特异性鉴定，(详见表1、表2)以建立具有稳定分泌特异性抗体能力的克隆株；再克隆的阳性细胞分别在液氮中保存一份。
所述的步骤⑨制备单抗腹水，分别将经降植烷处理的BALB/C小鼠，腹腔内注射鉴定后再克隆的杂交瘤细胞，注射量为5×105个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后分别抽取腹水，离心后取上清备用。
所述的步骤⑩测定单抗腹水效价，(1)ELISA效价包被同步骤⑥，抗原为完全菌毛化的C600和C1976-79菌株，浓度为8～12×108个/ml，将所获得的Y1、Y2腹水单抗倍比稀释，与包被抗原间接ELISA，测定腹水效价；(2)试管凝集价分别将Y1腹水单抗倍比稀释，与浓度为1.5～3×109个/ml已菌毛化的大肠杆菌C600、C1976-79做试管凝集反应，测试管凝集价。
使用产F1菌毛大肠杆菌C600进行制备的结果如下(1)杂交瘤细胞的筛选用间接ELISA筛选后获得1株阳性克隆株，经克隆后命名为Y1。
(2)腹水效价的测定Y1单抗腹水经PBS稀释后与大肠杆菌C600所做的ELISA效价为231g2；试管凝集价为12lg2。
(3)Y1单抗的特异性鉴定将鸡源致病性大肠杆菌、猪源大肠杆菌以及部分沙门氏菌经3次传代后，分别与Y1单克隆抗体做玻板凝集反应，以验证单抗的特异性，详见表4。
(4)凝集排谱反应抗鸡大肠杆菌F1菌毛的单抗(Y1)与大肠杆菌、沙门氏菌的凝集排谱反应同表1。
使用产P菌毛的大肠杆菌C1976-79进行制备的结果如下(1)杂交瘤细胞的筛选用间接ELISA筛选后获得1株阳性克隆株，经克隆后命名为Y2。
(2)腹水效价的测定Y2单抗腹水经PBS稀释后与大肠杆菌C1976-79所做的ELISA效价为181g2；试管凝集价为8lg2。
(3)Y2单抗的特异性鉴定将鸡源致病性大肠杆菌、猪源大肠杆菌以及部分沙门氏菌经3次传代后，分别与Y2单克隆抗体做玻板凝集反应，以验证单抗的特异性，详见表4。
(4)凝集排谱反应抗鸡大肠杆菌P菌毛的单抗(Y2)与大肠杆菌的排谱反应同表2在本发明实施例中，产F1菌毛的大肠杆菌C600由中国科学院上海植物生理研究所提供；大肠杆菌C1976-79(表达P菌毛)由国际卫生组织丹麦大肠杆菌与克雷伯氏菌菌种中心提供；其余大肠杆菌及沙门氏菌由扬州大学兽医生物教研室保存。BALB/C小鼠、ICR小鼠由中国农科院上海实验动物中心提供；SP2/O骨髓瘤细胞系由本研究室保存。
权利要求
1.一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法包括①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株→②制备免疫原→③免疫BALB/C小鼠→④融合杂交瘤细胞→⑤筛选杂交瘤细胞→⑥筛选阳性杂交瘤细胞→⑦克隆化→⑧再克隆→⑨制备单抗腹水→⑩测定单抗腹水效价十大步骤，各步骤之间依次连接为先后关系；该方法所制备的菌毛F1单抗或菌毛P单抗只与含有F1菌毛(17KD蛋白)或含有P菌毛(18KD蛋白)的鸡大肠杆菌发生反应，而不与其他细菌发生反应，也不与其他大肠杆菌的菌毛发生反应。
2.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株，将产F1菌毛和产P菌毛的大肠杆菌在改良TSB培养基上37～40℃静置培养40～48h，然后在改良TSB琼脂上37～40℃培养18～24h，挑选单个菌落与常规单因子血清做玻板凝集，筛选菌毛表达良好的菌落，进行连续传代
3次；末代培养物离心后，将沉淀用生理盐水悬浮后经磷钨酸染色，电镜观察；当见细菌体周生菌毛，且视野中细菌的菌毛表达良好，作为试验菌种。
3.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤②制备免疫原，将筛选后菌种用改良TSB培养基在37～40℃静置培养40～48h，用分光光度计测定菌体浓度后，用灭菌生理盐水稀释至6×108～2×109个细菌/ml，0.2％甲醛灭活。
4.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤③免疫BALB/C小鼠，将灭活抗原与等量弗氏完全佐剂混合，震荡乳化半小时；乳化完全后腹腔注射6～8周龄BALB/C小鼠(0.3ml/只)2周后用弗氏不完全佐剂同法进行第2次免疫；二免后14天，用灭活抗原腹腔注射免疫鼠(0.2ml/只)，3天后融合。
5.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤④融合杂交瘤细胞，分别对免疫鼠、用于饲养细胞的ICR小鼠眼球采血并分离血清，作为筛选单抗时的阳性、阴性血清对照。无菌取免疫鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用50％PEG1000融合。
6.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤⑤筛选杂交瘤细胞，融合后用HAT作为选择性培养基，同时加入饲养细胞，分装在96孔和24孔细胞培养板，置37℃、5～10％CO2培养箱内培养，7～10天进行观察，有生长的细胞就为杂交瘤细胞。
7.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤⑥筛选阳性杂交瘤细胞，用全菌包被的间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞；用筛选好的菌毛化程度高的大肠杆菌F1菌毛、P菌毛作包被抗原，包被浓度为8～12×108个细菌/ml，以颗粒性抗原包被法包被酶标板，筛选阳性杂交瘤；对初检阳性的杂交瘤细胞在液氮中保存一份，并同时进行克隆化。
8.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤⑦克隆化，采用稀释法进行克隆化，再按上述的步骤⑥进行检测，阳性克隆细胞在液氮中保存一份，一份进行再克隆；所述的步骤⑧再克隆，按步骤⑦克隆化进行，对分泌抗体进行特异性鉴定，(详见表1、表2)以建立具有稳定分泌特异性抗体能力的克隆株；再克隆的阳性细胞在液氮中保存一份。
9.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤⑨制备单抗腹水，将经降植烷处理的BALB/C小鼠，腹腔内注射鉴定后再克隆的杂交瘤细胞，注射量为5×105个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清备用。
10.根据权利要求1所述的一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤⑩测定单抗腹水效价，(1)ELISA效价包被同步骤⑥，抗原为完全菌毛化的菌株，浓度为8～12×108个/ml，将所获得的Y1、Y2腹水单抗倍比稀释，与包被抗原间接ELISA，测定腹水效价；(2)试管凝集价分别将Y1腹水单抗倍比稀释，与浓度为1.5～3×109个/ml已菌毛化的大肠杆菌做试管凝集反应，测试管凝集价。
全文摘要
一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，主要包括①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株→②制备免疫原→③免疫BALB/C小鼠→④融合杂交瘤细胞→⑤筛选杂交瘤细胞→⑥筛选阳性杂交瘤细胞→⑦克隆化→⑧再克隆→⑨制备单抗腹水→⑩测定单抗腹水效价十大步骤。本发明制备的鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体具备特异性强，无交叉反应，效价高，批次间差异小，制备方便，容易推广，容易标准化，能够有效区分F1、P和其他菌毛的特点。可以直接鉴定鸡致病性大肠杆菌；测定菌毛的表达程度；筛选鸡大肠杆菌制苗菌株；用于鸡大肠杆菌致病机理的研究；具有广泛的研究和商业使用价值。
文档编号C12N1/20GK1485433SQ03178589
公开日2004年3月31日 申请日期2003年7月22日 优先权日2003年7月22日
发明者杜元钊, 董国雄, 范根成 申请人:青岛易邦生物工程有限公司