专利名称：一种混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法。
背景技术：
限制性内切酶是一种能识别特定核苷酸序列，并在特定位置水解双链DNA的内切酶。按照限制性内切酶在特殊核苷酸序列处进行切割时的切割方式，限制性内切酶可分为平末端限制性内切酶和粘性末端限制性内切酶。其中，平末端限制性内切酶在双链DNA的两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无粘性末端的平口，即平末端；而粘性末端限制性内切酶则是在双链DNA的两条链的特定序列的不同部位切割，形成粘性末端。因为平末端双链DNA进行连接时，其有两个不可回避的问题，其一是连接的非定向性，即DNA片段 可以不同的方向连接，仅从连接形成的片段大小无法区分方向；其二是连接效率低，为了提高连接效率，往往通过提高底物的浓度来实现，但是浓度稍高则极易形成自连和多拷贝重复连接。而粘性末端双链DNA在进行连接时，既可保证DNA片段连接的方向性，连接效率也较平末端高。因此，在基因工程领域，粘性末端限制性内切酶得到了广泛的应用，而平末端限制性内切酶的应用则受到限制。末端转移酶(Terminaltransferase, TdT)是一种无需模板的DNA聚合酶,它能催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。现有技术中，一种构建T载体的方法包括，I)利用Sma I或EcoR V对质粒pUC57进行酶切，产生平末端酶切产物；2)利用末端转移酶和dTTP或ddTTP，在平末端酶切产物两端实现T的添加，从而获得T载体。该方法中，对质粒pUC57的酶切和对酶切产物3’羟基端的加尾是在两个不同的步骤中进行的，中间往往还需要对酶切产物进行纯化，步骤繁杂，实验效率低。另外，而在纯化过程中，因为回收效率的问题，会损失一部分的酶切产物，所以需要较大量的质粒PUC57进行酶切。此外，现有的构建与T载体相类似的载体的方法中，同样存在上述问题。因此需要一种混合酶、酶切修饰试剂盒，利用该混合酶或酶切修饰试剂盒能同时实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，简化实验步骤，提高实验效率，并进一步降低对底物的需求量；还需要一种利用混合酶构建载体的方法，能同时实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，简化实验步骤，提高实验效率，并能进一步降低对底物的需求量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法，旨在解决现有技术中实验步骤繁杂，实验效率低的问题。为了实现发明目的，本发明提供了一种混合酶，包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。其中，所述末端转移酶可为野生型末端转移酶或重组型末端转移酶。优选的，所述重组型末端转移酶为牛截短型末端转移酶，所述牛截短型末端转移酶与牛野生型末端转移酶相比，其N端被截去100至160个氨基酸。上述任一方案中，所述平末端限制性内切酶可为Afe I ,Ale I、Alu I、BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I >CviKI-KDpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HF 、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I ,Msl I、MspAl I、Nae I >Nla IV>Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu II >Pvu II _HF 、Rsa I、Sca I、Sca I -HF 、Sfo I、Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和Zra I中的至少一种。上述任一方案中，所述混合酶还可包括末端转移酶作用因子I。本发明还提供了一种酶切修饰试剂盒，所述试剂盒包括混合酶；所述混合酶包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。其中，所述末端转移酶可为野生型末端转移酶或重组型末端转移酶。优选的，所述重组型末端转移酶为牛截短型末端转移酶，所述牛截短型末端转移酶与牛野生型末端转移酶相比，其N端被截去100至160个氨基酸。上述任一方案中，所述平末端限制性内切酶可为Afe I ,Ale I、Alu I、BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I >CviKI-KDpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HF 、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I ,Msl I、MspAl I、Nae I、NI a IV、Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu II >Pvu II _HF 、Rsa I、Sca I、Sca I -HF 、Sfo I、Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和Zra I中的至少一种。上述任一方案中，所述混合酶还可包括末端转移酶作用因子I。上述任一方案中，所述试剂盒还可包括反应缓冲液，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。上述任一方案中，所述试剂盒还可包括氯化钴溶液。上述任一方案中，所述试剂盒还可包括修饰物，所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。本发明还提供了一种基于上述的任一种混合酶构建载体的方法，包括以下步骤
A.利用混合酶和修饰物，在第一酶切修饰体系中对前体核酸分子进行酶切和修饰，得
到3’端含有突出末端的载体；
所述前体核酸分子为含有至少一个平末端限制性内切酶识别位点的双链核酸分子；所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。其中，所述第一酶切修饰体系包括反应缓冲液，所述反应缓冲液可为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。进一步的，所述第一酶切修饰体系还可包括氯化钴溶液。更进一步的，所述第一酶切修饰体系可为在25°C条件下pH值为7. 9的含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、ImM的二硫苏糖醇、0. 25mM的氯化钴的水溶液。上述任一方案中，步骤A中所述的修饰物与前体核酸分子的摩尔数比大于等于100 :1。上述任一方案中，所述修饰物可为双脱氧核糖核苷酸。进一步的，所述修饰物可为双脱氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。上述任一方案中，所述构建载体的方法还可包括以下步骤
B.将3’端含有突出末端的靶核酸片段与步骤A的产物连接，得到含有靶核酸片段的重组载体； 所述靶核酸片段的3’端的突出末端与步骤A得到的双链核酸分子的3’端的突出末端互补。其中，步骤B所述靶核酸片段的3’突出末端可为脱氧腺嘌呤核糖核苷酸。优选的，步骤B所述靶核酸片段是基于特异性引物，利用Taq酶扩增得到的。上述任一方案中，所述前体核酸分子可为pUC57、pUC19、pUC18、pBR322、pBluescript II KS (-)、pBluescript II KS (+)、pBluescript II SK (-)、pBluescriptII SK ( + )、pTZ57R、pACYC184、pTZ19R 中的任一种。本发明还提供了另一种基于上述任一种混合酶构建载体的方法，包括以下步骤
A.利用混合酶和修饰物，在第二酶切修饰体系中对目标片段进行酶切和修饰，得到3’端含单碱基突出末端的酶切产物；
B.将3’端含有单碱基突出末端的酶切产物与3’端含有单碱基突出末端的载体连接环化，得到含有目标片段的载体；
所述目标片段为含有至少一个平末端限制性内切酶识别位点的双链DNA分子；
所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。优选的，所述修饰物为双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸，所述3’端含有单碱基突出末端的载体为T载体。上述任一方案中，所述第二酶切修饰体系包括反应缓冲液，所述反应缓冲液可为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。进一步的，所述第二酶切修饰体系还可包括氯化钴溶液。更进一步的，所述第二酶切修饰体系可为在25°C条件下pH值为7. 9的含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、ImM的二硫苏糖醇、0. 25mM的氯化钴的水溶液。上述任一方案中，步骤A中所述的修饰物与前体核酸分子的摩尔数比大于等于100 :1。由上可知，本发明的混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法能通过一步反应实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，简化实验步骤，提高实验效率，并能进一步解决因分步反应导致的损失问题，降低对底物的需求量，本发明的混合酶还大大扩大了平末端限制性内切酶在实际应用中的使用范围。
图I是本发明第一具体实施例中各实验组的反应终产物在15%的PAGE胶上的电泳图。图2本发明第二具体实施例中实验组和对照组的反应终产物在0. 8%的琼脂糖凝胶上的电泳图。图3是本发明第三具体实施例中I至4号白斑的菌落PCR产物和I至4号白斑扩大培养后的质粒抽提产物在0. 8%的琼脂糖凝胶上的电泳图。 图4是本发明第四具体实施例中5至8号白斑的菌落PCR产物和5至8号白斑扩大培养后的质粒抽提产物在0. 8%的琼脂糖凝胶上的电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明提出第一典型实施例，一种混合酶，包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。针对本典型实施例，需要说明的有以下几点。所述平末端限制性内切酶是能在双链DNA的两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无粘性末端的平口的限制性内切酶。所述末端转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶，能催化脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物结合到DNA分子的3’羟基端。所述平末端限制性内切酶和末端转移酶均可从市场上直接购买获得，如NEB，Invitrogen、Sigma-Aldrich、Promega、Roche等，也可利用常规的蛋白质表达技术,通过克隆构建、蛋白诱导、纯化等步骤自行制备。本方案的混合酶能够在一步反应中同时实现对底物(双链DNA分子)的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，将现有技术中的至少两步反应(酶切、延伸)简化成一步反应，简化了实验步骤，提闻了实验效率。此外，经本方案的混合酶处理的底物，含有粘性末端，具有与粘性末端限制性内切酶处理同样的技术效果，防止了处理后的底物自连现象的发生，提高了连接效率。因此，本方案打破了平末端限制性内切酶在基因工程领域的应用限制，可被广泛的应用。此外，现有技术中，为了保证延伸步骤的效果，往往在酶切步骤后需要增加一个纯化步骤，而纯化步骤必然造成目标物的损失，目前的各种核酸纯化方法，其纯化回收率一般在50%-90%之间。因此，本方案还能进一步的降低对底物的需要量。基于第一典型实施例，所述末端转移酶可为野生型末端转移酶或重组型末端转移酶。所述末端转移酶可为人末端转移酶、牛末端转移酶、鼠末端转移酶、猪末端转移酶或兔末端转移酶。优选的，所述重组型末端转移酶为牛截短型末端转移酶。所述牛截短型末端转移酶，其氨基酸序列是牛野生型末端转移酶氨基酸序列中的某一段或多段被截去，使得其活性相对于牛野生型末端转移酶得到提高。更优选的，所述牛截短型末端转移酶与牛野生型末端转移酶相比，其N端被截去100至160个氨基酸。更优选的，所述牛截短型末端转移酶与牛野生型末端转移酶相比，其N端被截去138个氨基酸。N端被截去100至160个氨基酸，或138个氨基酸的牛截短型末端转移酶，在含有Co2+离子的溶液中，其活性是野生型的20至30倍，相关实验详见US20040043396，在此不再赘述。上述任任一方案中，所述平末端限制性内切酶可为Afe I ,Ale I、Alu I ,BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I >CviKI-KDpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HF 、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I ,Msl I、MspAl I、Nae I >Nla IV>Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu II >Pvu II _HF 、Rsa I、Sca I、Sca I -HF 、Sfo I、Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和Zra I中的至少一种。优选的，所述平末端限制性内切酶为Afe I、Ale I、Alu I、BmgB I、BsrB I、BstZ17 I、Cac8 I ,CviKI-UDpn I ,Dra I、Eco53K I ,EcoR V ,EcoRV-HF ,Fsp I ,Hae IILHinc II、Hpa I、HpyCH4 V >Mly I、Msc I、Msl I、MspAl I、Nae I、NlaIV、Nru I、Pme I、Pml I ,PshA I ,Psi I、Pvu II、Pvu II -HF 、Rsa I ,Sca I、Sca I -HF , Sfo I ,Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和 Zra I 中的至少一种。因为上述平末端限制性内切酶的最适反应温度为37°C或25°C，与末端转移酶的最适反应温度相同或更低，能保证混合酶中的两种酶在进行反应时，均能在各自的最佳反应温度下进行，而不影响另一种酶的活性。例如，当所述平末端限制性内切酶的最适反应温度与末端转移酶相同时，它们可在同一温度进行反应，简化了实验条件；当所述平末端限制性内切酶的最适反应温度为25°C时，可先在25°C条件下进行酶切，然后再将温度提高至37 °C进行延伸加尾反应。优选的，所述平末端限制性内切酶为Afe I ,Ale I、Alu I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I、CviKI-U Dpn I , Dra I、Eco53K I、EcoRV-HF , Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V >Mly I、Msc I、Msl I、MspAl I、Nae I、Nla IV、Pme I、PshA I ,Psi I、Pvu IKPvu II -HF 、Rsa I ,Sca I、Sca I -HF , Sfo I ,Sma I ,SnaB I、Ssp I -HF、Stu I、Xmn I 和 Zra I 中的至少一种。因为经本发明人实验证明，上述平末端限制性内切酶和末端转移酶均能在特定反应缓冲液(该反应缓冲液为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液)中具[Cl]，相关实验证明参见第一具体实施例。上述任一方案中，所述混合酶还包括末端转移酶作用因子I (TdT interactingfactor I, TdIFD0因为，TdIFl能与TdT直接结合，并将TdT的活性提高4倍，相关证明实验详见 Terminal deoxynuc Ieot idyl transferase directly interacts with a novelnuclear protein that is homologous to p65, Nobuyuki Yamashita et al, Genes toCells, 2011, 6，641-652，在此不再赘述。本发明提出第二典型实施例，一种酶切修饰试剂盒，包括混合酶，所述混合酶包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。针对本典型实施例，需要说明的有以下几点。本方案中的混合酶可采用[c2]第一典型实施例中的任一种混合酶。本方案的酶切修饰试剂盒能够在一步反应中同时实现对底物(双链DNA分子)的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，将现有技术中的至少两步反应(酶切、延伸)简化成一步反应，简化了实验步骤，提高了实验效率。现有技术中，将多种酶进行混合时，往往是根据酶的活性单位进行混合的。在本发明中，不同来源的平末端限制性内切酶或末端转移酶的活性单位定义可能不同，平末端限制性内切酶和末端转移酶的活性单位定义也可能不同。市场上购买的末端转移酶的活性单位定义通常是在一定温度条件下(例如37°C ),—定时间内(例如lh), —定的反应体系中，将单位修饰物(例如=Inmol dATP)添加至某一特定底物上所需的酶的量。例如，NEB的TdT的活性单位定义是在ImL反应体系中，在37°C条件下，在Ih内能将lnmol dATP添加至引物d (八)18的3，端所需的TdT的量；所述反应体系为d(A)18,0. 2mM dATP，和I u Ci [3H]-dATP每50 y L总反应体积。而市场上购买的平末端限制性内切酶的活性单位定义通常是在一定的温度条件下(例如37°C)，一定时间内(例如lh)，一定的反应体系中，将一定量的底物(例如1 y g)完全酶切所需的酶的量。例如NEB的Pvu II的活性单位定义就是在37°C条件下，在50 L总反应体积中将Iug入DNA完全酶切所需的酶的量；该反应体系为IXNEBuffer 2。上述的例子显示，末端转移酶的活性单位是在一定时间、温度和反应条件下，基于 特定底物，根据所需的修饰物的物质的量来定义的；而平末端限制性内切酶是在一定时间、温度和反应条件下，根据对一定量的底物(以质量计算)进行处理所需的酶的量来定义的。因此，本发明的混合酶中的平末端限制性内切酶或末端转移酶在进行混合时，如果要达到最佳的使用效果，并不能简单的根据活性单位的定义进行混合，往往是需根据具体的作用底物进行相应的调整。总的原则是根据具体的作用底物的摩尔数，计算出对该摩尔数的底物进行酶切所需的平末端限制性内切酶的酶量(以活性单位定义)，和对该摩尔数的底物被酶切后进行修饰所需的末端转移酶的酶量(以活性单位定义)，然后根据计算结果，按比例配置混合酶。当然，以其他比例配置的混合酶也还是能够在一步反应中实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，只是在效果和/或成本上未实现最佳配置。基于第二典型实施例，优选的，所述平末端限制性内切酶和末端转移酶均为从市场上购买所得。更优选的，所述平末端限制性内切酶和末端转移酶购自同一生产商。因为不同生产商生产的同一种酶可能在活性和最适反应条件上有些微的差异。更优选的，所述平末端限制性内切酶和末端转移酶均购自NEB。当将多种不同的酶置于同一反应步骤中进行反应时，最重要的是找到所述多种不同的酶均能发挥活性的反应条件，尤其是反应体系。这些反应条件或反应体系对于所述多种不同的酶来说，可能都不是最佳的反应条件，也可能只是其中一种酶的最佳反应条件。基于第二典型实施例，所述试剂盒还可包括反应缓冲液。所述反应缓冲液用于提供混合酶中两种酶发挥酶活性所需的离子浓度和PH值。所述反应缓冲液所含的离子浓度可以是混合酶中两种酶发挥酶活性所需的离子浓度的2倍、5倍、10倍、20倍或更多，以利于后续配置酶切反应体系时计算所需的反应缓冲液，并能够以合适的体积进行取用，以减少误差。优选的，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值为7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。更优选的，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值为7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸钾、IOmM醋酸镁、ImM 二硫苏糖醇的水溶液。本方案的反应缓冲液在使用过程中是作为IOX缓冲液，用于配置成含IX缓冲液的反应体系。在此反应体系中，混合酶中的平末端限制性内切酶和末端转移酶的稳定性和反应活性均处于较佳状态。针对用于配置酶切反应体系的反应缓冲液，本发明将通过第一具体实施例来进一步说明其对混合酶作用的影响。以完全互补的双链核苷酸A (其中一条链的序列如SEQ ID NO: I所示)为底物，所述双链核苷酸A大小为lOObp，其在序列中间含有Pvu II和Pvu II -HF 酶的酶切识别位点(CAGCTG)。以 Pvu II -HF (NEB, Cat# R3151S, 20U/ u L)和 TdT (NEB, Cat# M0315L, 20U/ u L)作为混合酶的原材料，Pvu II -HF 与TdT的体积比为3 :2，得到的混合酶中的Sma I和TdT的活性浓度分别为12U/ii L、8U/y L。以dATP作为修饰物。配置以下一系列的IOX反应缓冲液。A. pH值为7. 0 (25°C)，含有30mM的Tris-醋酸、45mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁的
水溶液。B. pH值为7. 6 (25°C)，含有21mM的Tris-醋酸、38mM的醋酸钾、18mM的醋酸镁的水溶液。C. pH值为7. 8 (25°C)，含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、ImM的二硫苏糖醇、0. 4mM氯化钴的水溶液。D.pH值为7. I (25°C)，含有30mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁的
水溶液。E. pH值为7. 4 (25°C)，含有27mM的Tris-醋酸、30mM的醋酸钾、15mM的醋酸镁的水溶液。F. pH值为7. 5 (25°C )，含有23mM的Tris-醋酸、40mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、
0.IOmM氯化钴的水溶液。G. pH值为7. 9 (25°C )，含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、ImM的二硫苏糖醇、0. 25mM氯化钴的水溶液。按下述配比配置酶切修饰反应体系双链核苷酸A，l. g ;混合酶，I. 25UL ；IOX 反应缓冲液，5 i! L ; IOmM ddATP，0. 5 y L ;ddH20，加至 50 y L。反应条件37°C反应 4h，80°C 灭活 20min。将上述几组反应的终产物在15%的含尿素的PAGE胶中进行电泳，结果如图I所示。其中，泳道“对”的点样样品是双链核苷酸A ;泳道I对应A系列的反应缓冲液组的反应终产物；泳道2对应B系列的反应缓冲液组的反应终产物；泳道3对应C系列的反应缓冲液组的反应终产物；泳道4对应D系列的反应缓冲液组的反应终产物；泳道5对应E系列的反应缓冲液组的反应终产物；泳道6对应F系列的反应缓冲液组的反应终产物；泳道7对应G系列的反应缓冲液组的反应终产物。如果各组酶切反应体系中的酶的活性越高，所得的酶切修饰产物的分子量就越大，酶切修饰产物的量也越多，而酶切产物的量就越少；反映在电泳图中，即为酶切修饰产物的条带更粗、更亮，而酶切产物的条带更细、更淡。如图I显示，各泳道的酶切修饰效果由好到差依次排列为3、7、6、2、5、1、4。即，用于配置酶切反应体系的反应缓冲液优选为在、25°C条件下pH值为7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液；更优选为在25°C条件下pH值为7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸钾、IOmM醋酸镁、ImM 二硫苏糖醇的水溶液。更优选的，所述反应缓冲液为 在25°C条件下pH值为7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸钾、IOmM醋酸镁、ImM 二硫苏糖醇的水溶液应当说明的是，本具体实施例仅是针对反应缓冲液的不同，来判断对混合酶酶切和修饰效果影响的一个具体实施例，并不用于限制本发明，且当相应的更换混合酶作用底物、混合酶等时，其实验结果与本具体实施例基本—致。上述任一方案中，所述试剂盒还可包括氯化钴溶液。优选的，所述氯化钴溶液为浓度为2. 5mM的氯化钴水溶液。因为TdT在含有钴离子的溶液中的活性比在只含有镁离子、锰离子或锌离子的溶液中的活性更高。钴离子的终浓度可选择的范围较大,至少从0. OlmM至IOmM之间均可以使 TdT 达到较高的活性，例如0. 05mM、0. lmM、0. 2mM、0. 3mM、0. 7mM、lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、8mM。优选的，钴离子的终浓度为0. 25mM。上述任一方案中，所述试剂盒还可包括修饰物。需要说明的是，所述修饰物是能够在TdT的作用下，结合至DNA分子的3’羟基端的核苷酸。优选的，所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。其中，上述的三种带标记的核苷酸所携带的标记可有多种形式，包括但不限于生物素标记、荧光标记、链霉亲和素标记、亲和素标记、抗原标记、抗体标记或大基团标记(用于酶切修饰后的分离纯化或使得在底物的3’羟基端只能延伸一个碱基，可具体采用的大基团可参考CN201010155269. 9，在此不再进行赘述)。这些标记可有多种作用，包括但不限于使得被混合酶处理后带上标记物的底物更容易提纯；使得底物被混合酶酶切后能够延伸的核苷酸数为1，形成含有单碱基突出末端的底物。上述的6种修饰物中，除第I种外，其余5种修饰物均可能使底物在被混合酶处理后形成含有单碱基突出末端的底物；尤其是双脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸类似物。更优选的，所述修饰物为双脱氧核苷酸或带生物素标记的双脱氧核苷酸。本发明还提出第三典型实施例，一种构建载体的方法，包括以下步骤
SI.利用混合酶和修饰物，在第一酶切修饰体系中对前体核酸分子进行酶切和修饰，得到3’端含有突出末端的载体。所述前体核酸分子为含有至少一个平末端限制性内切酶识别位点的双链核酸分子。所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。所述混合酶包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。所述第一酶切修饰体系是对前体核酸分子进行酶切和修饰的反应体系。针对本典型实施例，应当说明的有以下几点。
所述混合酶可采用前述的任一种混合酶。本方案能够在一步反应中同时实现对底物(双链DNA分子)的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，将现有技术中的至少两步反应(酶切、延伸)简化成一步反应，简化了实验步骤，提闻了实验效率。基于第三典型实施例，所述第一酶切修饰体系可包括反应缓冲液。所述反应缓冲液用于提供混合酶中两种酶发挥酶活性所需的离子浓度和pH值。所述反应缓冲液所含的离子浓度可以是混合酶中两种酶发挥酶活性所需的离子浓度的2倍、5倍、10倍、20倍或更多，以利于后续配置酶切反应体系时计算所需的反应缓冲液，并能够以合适的体积进行取用，以减少误差。优选的，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有TriS-醋酸、 醋酸钾、醋酸镁的水溶液。在此条件下，混合酶中的购于NEB的平末端限制性内切酶和末端转移酶均具有较高的活性。更优选的，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值为7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸钾、IOmM醋酸镁、ImM 二硫苏糖醇的水溶液。上述任一方案中，所述修饰物为双脱氧核糖核苷酸。本方案中，所述修饰物使得经步骤SI得到的产物均为3’端含单碱基突出末端的载体，保证了步骤SI产物的同一性，有利于其在基因工程领域的进一步应用。需要说明的是，当修饰物为带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物，且上述的四种修饰物的3’羟基端均因为相关标记或修饰(相关标记或修饰可在3’羟基上或不在3’羟基上)的缘故不能进一步延伸时，也可实现类似双脱氧核苷酸的功能。更优选的，所述修饰物为双脱氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。在本方案中，步骤SI的产物3’端含有单碱基突出末端的载体为T载体。本方案作为一种制备T载体的方法，其较现有技术中的制备T载体的方法步骤更简单，实验效率更高，并能进一步降低对底物的需求量。同样的，所述修饰物分别为双脱氧胞嘧啶核糖核苷酸、双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸、双脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸时，步骤SI的产物3’端含有单碱基突出末端的载体分别为C载体、A载体、G载体，即它们的3’含有的单碱基突出末端分别为C、A、G0上述任一方案中，所述构建载体的方法还可包括以下步骤
S2.将3’端含有突出末端的靶核酸片段与步骤SI的产物连接，得到含有靶核酸片段的重组载体。所述靶核酸片段的3’端的突出末端与步骤SI得到的双链核酸分子的3’端的突出末端互补。优选的，所述步骤S2中的靶核酸片段的3’突出末端为脱氧腺嘌呤核糖核苷酸。与之相对应的是，步骤SI中的修饰物为双脱氧胸腺嘧啶脱氧核糖核酸。针对本方案，应当说明的有以下几点。3’突出末端为单碱基(A)突出末端的靶核酸片段的形成方式有多种。包括但不限于
I)利用末端转移酶，以双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸为修饰物，在平末端的靶核酸片段的两个3’羟基端分别加上一个双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸，从而获得3’突出末端为单碱基(A)突出末端的靶核酸片段；
2)通过特异性引物，利用Taq酶对含靶核酸片段的模板进行扩增，最终得到3’突出末端为单碱基(A)突出末端的靶核酸片段。同理，当所述步骤S2中的靶核酸片段的3’突出末端为脱氧胸腺嘧啶核糖核苷酸时，与之相对应的是，步骤SI中的修饰物为双脱氧腺嘌呤脱氧核糖核酸；当所述步骤S2中的靶核酸片段的3’突出末端为脱氧胞嘧啶核糖核苷酸时，与之相对应的是，步骤SI中的修饰物为双脱氧鸟嘌呤脱氧核糖核酸；当所述步骤S2中的靶核酸片段的3’突出末端为脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸时，与之相对应的是，步骤SI中的修饰物为双脱氧胞嘧啶脱氧核糖核 酸。本方案所得到的重组载体，在靶核酸片段与步骤SI的产物发生连接的地方，会形成两个切口，当将该重组载体转化入细菌后，这两个切口可被修复。因此，通过对转化后的细菌进行质粒抽提，可得到无切口的重组载体。上述任一方案中，所述前体核酸分子优选为pUC57、pUC19、pUC18、pBR322、pBluescript II KS (-)、pBluescript II KS (+)、pBluescript II SK (-)、pBluescriptII SK ( + )、pTZ57R、pACYC184、pTZ19R中的任一种。上述11种前体核酸分子均可从市场上直接购买获得，如Fermentas、Sigma-Aldrich、Promega、NEB等。本方案中，各前体核酸分子上均含有平末端限制性内切酶的酶切位点，在含有相应的平末端限制性内切酶和末端转移酶的混合酶的作用下，可将它们转变成所需的载体，例如T载体。本发明还提出第四典型实施例，一种构建载体方法，包括以下步骤
SI，.利用混合酶和修饰物，在第二酶切修饰体系中对目标片段进行酶切和修饰，得到3’端含单碱基突出末端的酶切产物；
S2’ .将3’端含有单碱基突出末端的酶切产物与3’端含有单碱基突出末端的载体连接环化，得到含有目标片段的载体。所述目标片段为含有至少一个平末端限制性内切酶识别位点的双链核酸分子。所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。所述第二酶切修饰体系是对目标片段进行酶切和修饰的反应体系。针对本典型实施例，应当说明的有以下几点。所述混合酶可采用第一实施例中的任一种混合酶。本方案能够在一步反应中同时实现对底物(双链DNA分子)的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，将现有技术中的至少两步反应(酶切、延伸)简化成一步反应，简化了实验步骤，提闻了实验效率。本方案与第三典型实施例相比，不同点主要在于被混合酶处理的底物的不同。虽然，在第三典型实施例中的前体核酸分子和本方案中的目标片段一样，都是含有至少一个平末端限制性内切酶识别位点的双链核酸分子。但是，在第三典型实施例中的前体核酸分子是形成重组载体的骨干结构，其须适用于各种大小的靶核酸片段。而为了保证重组载体(重组载体为双链环状核酸分子)的形成，即，前体核酸分子与靶核酸片段连接成环，前体核酸分子应大于等于150bp。优选的，前体核酸分子大于等于400bp。而本方案中的目标片段的大小无具体的限制，其大小的变动范围较大，可根据需研究的目标片段进行任意的选择。例如，当目标片段为某个基因或某个基因的某一特定外显子时，其大小可能在几十bp至数十kb之间。综上，若把基于第三典型实施例形成的重组载体类比为本方案的最终产物，含有目标片段的载体，那么，重组载体中的前体核酸分子就好比是本方案步骤B中的3’端含有单碱基突出末端的载体，而重组载体中的靶核酸片段就好比是本方案步骤A中的目标片段。基于第四典型实施例，所述第二酶切修饰体系可包括反应缓冲液。所述反应缓冲液用于提供混合酶中两种酶发挥酶活性所需的离子浓度和PH值。所述反应缓冲液所含的离子浓度可以是混合酶中两种酶发挥酶活性所需的离子浓度的2倍、5倍、10倍、20倍或更多，以利于后续配置酶切反应体系时计算所需的反应缓冲液，并能够以合适的体积进行取用，以减少误差。优选的，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。在此条件下，混合酶中的购于NEB的平末端限制性内切酶和末端 转移酶均具有较高的活性。更优选的，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值为7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸钾、IOmM醋酸镁、ImM 二硫苏糖醇的水溶液。上述任一方案中，所述修饰物为双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸，所述3’端含有单碱基突出末端的载体为T载体。本方案中，所述修饰物使得经步骤SI’得到的产物均为3’端含A突出末端的酶切产物，该产物能与市场上最常见的单碱基突出末段载体——T载体进行高效的连接反应，从而得到含有目标片段的载体。需要说明的是，当修饰物为带标记的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、带标记的双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸类似物或双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸类似物，且上述的四种修饰物的3’羟基端均因为相关标记或修饰(相关标记或修饰可在3’羟基上或不在3’羟基上)的缘故不能进一步延伸时，也可像双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸一样使用。下面将通过第二具体实施例对利用本发明的混合酶构建T载体的方法进行进一步的说明。以从GenScript购买的pUC57 plasmid DNA (SD1176)为前体核酸分子，构建T载体。以 Sma I (NEB, Cat# R0141S，20U/y L)和 TdT (NEB, Cat# M0315L，20U/y L)作为混合酶的原材料，Sma I与TdT的体积比为9 :1，得到的混合酶中的Sma I和TdT的活性浓度分别为 18 U/ u L>2 U/ u L0以ddATP作为修饰物。配置IOX反应缓冲液，该缓冲液在25°C条件下pH值为7. 9，是含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、ImM的二硫苏糖醇、0. 25mM的氯化钴的水溶液。一、实验组。按下述配比配置酶切修饰反应体系pUC57 plasmid DNA, 2 U g ;混合酶，I. IluL ；IOX 反应缓冲液，5 ii L ;IOmM ddATP，0. 11 y L ;ddH20，加至 50 y L。反应条件25°C反应 4h，37°C反应 0. 5h，70°C灭活 15min。二、对照组。
I. Sma I 酶切。按下述配比配置酶切反应体系pUC57plasmid DNA,2. 5u g ；Sma I (20U/u L),
I.25u L ；10X NEBuf fer4, 5u L ；ddH20,加至 50 y L。反应条件25 °C 反应 4h，65 °C 灭活20mino2.纯化回收。利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Cat# A9281)回收步骤I的产物，产物溶于25 ii L的ddH20中，并在Nanodrop 2000上测定回收产物浓度，回收产物浓度为92. lng/u L0相关操作详见操作说明书，在此不再赘述。 3.加 A 尾。在TdT酶的作用下，对步骤2回收的产物加A尾。按下述配比配置反应体系步骤 2 产物，22 ii L (约 I. 3pmol) ;TdT (20U/u L),0. 13u L ；10mM ddATP，0. 13 y L ;ddH20，力口至50ii L。反应条件37°C反应0. 5h，70°C灭活lOmin。将实验组和对照组的反应终产物在0. 8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，结果如图2所示。其中，泳道“PUC57”的点样样品是pUC57 plasmid DNA，泳道“实”的点样样品是实验组的终产物，泳道“对”的点样样品是对照组的终产物。因为在同样分子大小的情况下，环状核酸分子的电泳速度较线状核酸分子的电泳速度快，因此，如图2所示，实验组和对照组均能对pUC57 plasmid DNA彻底的酶切。综上，利用混合酶能够简化T载体的构建步骤，提高实验效率，并因为省去了回收的步骤，降低了对起始材料的需求量。针对本具体实施例，需要说明的是，本具体实施例所使用的混合酶并不限于本实施例所述的这种，换用其它的限制性内切酶，例如EcoR V ;或采用其他的比例混合限制性内切酶和末端转移酶；或更换前体核酸分子，例如pTZ57R、pUC19、pUC18、pBluescriptII KS (-)、pBluescript II KS ( + )、pBluescript II SK (-)、pBluescript II SK ( + )、pACYC184、pTZ19R ;或同时更换前体核酸分子和混合酶，例如采用pBR322作为前体核酸分子，混合酶包括Pvu II和末端转移酶，或者包括Pvu II -HF 和末端转移酶；或采用其它的反应缓冲液，例如含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、ImM的二硫苏糖醇的水溶液；以上替换，均能像上述具体实施例一样，实现T载体的成功构建。为了进一步证明第二具体实施例构建的T载体能够被具体应用(构建含有硫氧还蛋白基因的重组T载体)，本发明提出第三具体实施例。一、大肠杆菌DH5 a基因组DNA的抽提。米用基因组DNA提取试剂盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit,Promega,Cat# A1120)抽提大肠杆菌DH5a的基因组DNA，相关操作详见说明书，在此不再赘述。二、靶核酸片段的扩增。以Fl (SEQ ID NO: 2)和Rl (SEQ ID NO: 3)作为引物，步骤一的产物，基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下F1 (10uM),2u L ；R1 (10 y M)，2 y L ;基因组 DNA，100ng ;10XEx Taq Buffer,5u L ；Ex Taq (5U/u L), I U L ；dNTP (各 2. 5mM)，4 ii L ;ddH20,加至 50 u L0PCR反应条件如下
95 °C 3min ；
94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ;重复 30 个循环；72 °C 7min。对反应产物进行纯化回收，得扩增产物。三、靶核酸片段和T载体的连接。分别以第二具体实施例中实验组和对照组构建的终产物作为T载体，反应体系如下步骤二得到的扩增产物，200ng ；T载体(实验组或对照组)，500ng ；10XT4 LigationBuffer,2u L ；T4 DNA ligase (400U/y L，NEB，Cat#M0202L)，2 y L ;ddH20，加至 20 y L。反应条件16°C反应过夜。四、将步骤三的产物分别转化至感受态大肠杆菌DH 5a (天根生化科技(北京)有限公司CB101-01)中，并将转化后的大肠杆菌DH 5a涂布至氨苄 抗性的LB平板上，进行蓝白斑筛选。相关操作详见说明书，在此不再赘述。五、菌落PCR验证。通过菌落PCR验证硫氧还蛋白基因(Thioredoxin)是否克隆成功，以F2 (SEQ IDNO: 4)和R2 (SEQ ID NO: 5)作为引物，以步骤四中的平板上的白斑作为模板。另外，对进行菌落PCR的白斑进行放大培养，并抽提质粒。将菌落PCR的产物和相应的抽提实验得到的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。其中，泳道1、2的样品分别是第二具体实施例中实验组构建的T载体与本发明的第三具体实施例中步骤I的产物进行连接，转化和蓝白斑筛选得到的第1、2号白斑的菌落PCR产物；泳道3、4的样品分别是第二具体实施例中对照组构建的T载体与本发明的第三具体实施例中步骤I的产物进行连接，转化和蓝白斑筛选得到的第3、4号白斑的菌落PCR产物；泳道5、6的样品则分别是第1、2号白斑放大培养后抽提得到的质粒；泳道7、8的样品则分别是第3、4号白斑放大培养后抽提得到的质粒。结果显示，泳道I至8中的条带均符合预期，即1、2、3、4号白斑均为成功构建的含有硫氧还蛋白基因的T载体克隆。将1、2、3、4号白斑的PCR产物及步骤二的扩增产物送生工生物工程(上海)有限公司分别进行双向全测序，对测序结果进行分析可知，步骤二的扩增产物测序结果为SEQ IDNO: 6，I号白斑的PCR产物测序结果为SEQ ID NO: 6，2、3、4号白斑的PCR产物的测序结果与I号白斑完全相同。经比对，发现SEQ ID NO: 5能够与SEQ ID NO: 7中的序列100%比对上，进一步证明了第二具体实施例中的实验组和对照组的T载体均能用于成功构建实现含有硫氧还蛋白基因的T载体克隆。下面将通过第四具体实施例对利用本发明的另一种利用混合酶构建T载体的方法进行进一步的说明(构建含有硫氧还蛋白基因的重组T载体)。HpGEM-T Easy Vector(Promega, Cat# A1360)作为 T 载体。以 EcoR V -HF (NEB, Cat# R3195L，20U/y L)和 TdT(NEB, Cat# M0315L, 20U/u L)作为混合酶的原材料，EcoR V -HF 与TdT的体积比为I : I，得到的混合酶中的EcoR V -HF 和TdT的活性浓度分别为10 U/u LUO U/u L0以ddATP作为修饰物。配置IOX反应缓冲液，该缓冲液在25°C条件下pH值为7. 9，是含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸钾、IOmM的醋酸镁、ImM的二硫苏糖醇的水溶液。一、目标片段的获得。利用第三具体实施例步骤I中抽提得到的基因组DNA为模板，以F3 (SEQ ID NO:8)和R3 (SEQ ID NO: 9)为进行PCR扩增，引物F3和R3上均含有EcoR V -HF 的酶切识别位点。PCR 反应体系如下F3 (10uM),2u L ；R3 (10 y M)，2 y L ;基因组 DNA，IOOng ;PfuDNA Polymerase 10 XBuffer with MgSO4, 5 u L ;dNTP(各 IOmM), I u L ;Pfu DNA Polymerase(Promega, Cat# M7741), 0. 5 y L ；ddH20,加至 50 u L。PCR反应条件如下
95 °C 3min ；
94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ;重复 30 个循环；
72 °C 7min。对反应产物进行纯化回收，得目标片段。 二、目标片段的酶切修饰。I.实验组。按下述配比配置酶切修饰反应体系目标片段，I U g ;混合酶，IuL5IOX反应缓冲液，5iiL;10mM ddATP，0. L ;ddH20，加至 50ii L。反应条件37 °C 反应 4h，80°C 灭活20mino2.对照组。I) EcoR V -HF 酶切。按下述配比配置酶切反应体系目标片段，1.5iig;EC0R V -HF (20U/uL),
0.75u L ；10X NEBuf fer4, 5u L ；ddH20,加至 50 y L。反应条件37 °C 反应 4h，80 °C 灭活20mino2).纯化回收。利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Cat# A9281)回收步骤I的产物，产物溶于25 ii L的ddH20中，并在Nanodrop 2000上测定回收产物浓度，回收产物浓度为55. 8ng/u L0相关操作详见操作说明书，在此不再赘述。3).加 A 尾。在TdT酶的作用下，对步骤2)回收的产物加A尾。按下述配比配置反应体系步骤 2)产物，17. L (约 4. 3pmol) ;TdT (20U/u L), 0. 5 u L ；10mM ddATP，0. 5 y L ;ddH20，力口至50ii L。反应条件37°C反应0. 5h，80°C灭活20min。三、目标片段酶切修饰产物与T载体的连接。分别以步骤二中实验组和对照组得到的目标片段酶切修饰产物与T载体连接，反应体系如下目标片段酶切修饰产物(实验组或对照组)，95ng;pGEMz -T Easy Vector,200ng ；10XT4 Ligation Buffer,2u L ；T4 DNA ligase (400U/uL, NEB, Cat#M0202L),2iiL;ddH20，WM20iiL。反应条件16°C反应过夜。四、将步骤三的产物分别转化至感受态大肠杆菌DH5a (天根生化科技(北京)有限公司CB101-01)中，并将转化后的大肠杆菌DH 5a涂布至氨苄抗性的LB平板上，进行蓝白斑筛选。相关操作详见说明书，在此不再赘述。五、菌落PCR验证。通过菌落PCR验证硫氧还蛋白基因(Thioredoxin)是否克隆成功，以F4 (SEQ IDNO: 10)和R4 (SEQ ID NO: 11)作为引物，以步骤四中的平板上的白斑作为模板。另外，对进行菌落PCR的白斑进行放大培养，并抽提质粒。将菌落PCR的产物和相应的抽提实验得到的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。其中，图4A中的泳道1、2的样品分别是第四具体实施例中实验组蓝白斑筛选得到的第5、6号白斑的菌落PCR产物；图4B中的泳道1、2的样品则分别是第5、6号白斑放大培养后抽提得到的质粒；图4八中的泳道3、4的样品分别是第四具体实施例中对照组蓝白斑筛选得到的第7、8号白斑的菌落PCR产物；图4B中的泳道3、4的样品则分别是第7、8号白斑放大培养后抽提得到的质粒。结果显示，各泳道的条带均符合预期，即5、6、7、8号白斑均为成功构建的含有硫氧还蛋白基因的T载体克隆。将5、6、7、8号白斑的PCR产物及步骤一的产物目标片段送生工生物工程(上海)有限公司分别进行双向全测序，对测序结果进行分析可知，步骤一的产物目标片段的测序结果为SEQ ID NO: 12，5号白斑的PCR产物测序结果为SEQ ID NO: 13，6、7、8号白斑的PCR产物的测序结果与5号白斑完全相同。经比对，发现SEQ ID NO: 11能够与SEQ ID NO: 12中的序列100%比对上，进一步证明了第三具体实施例中的实验组和对照组均能用于成功 构建实现含有硫氧还蛋白基因的T载体克隆。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种混合酶，其特征在于，包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。
2.根据权利要求I所述的混合酶，其特征在于，所述末端转移酶为野生型末端转移酶或重组型末端转移酶。
3.根据权利要求2所述的混合酶，其特征在于，所述重组型末端转移酶为牛截短型末端转移酶；所述牛截短型末端转移酶与牛野生型末端转移酶相比，其N端被截去100至160个氨基酸。
4.根据权利要求I所述的混合酶，其特征在于，所述平末端限制性内切酶为AfeI、Ale I、Alu I、BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I > CviKI-I > Dpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HFTM、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I > Msl I、MspAl I、Nae I > Nla IV> Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu IKPvu II -HFTM、Rsa I、Sca I、Sca I _HFTM、Sfo I、Sma I ,SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和 Zra I 中的至少一种。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的混合酶，其特征在于，还包括末端转移酶作用因子I。
6.一种酶切修饰试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括混合酶；所述混合酶包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。
7.根据权利要求6所述的酶切修饰试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。
8.根据权利要求6所述的酶切修饰试剂盒，其特征在于，所述混合酶还包括末端转移酶作用因子I。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的酶切修饰试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括氯化钴溶液。
10.根据权利要求6至8中任一项所述的酶切修饰试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括修饰物，所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。
11.一种构建载体的方法，其特征在于，包括以下步骤 A.利用混合酶和修饰物，在第一酶切修饰体系中对前体核酸分子进行酶切和修饰，得到3’端含有突出末端的载体； 所述前体核酸分子为含有至少一个平末端限制性内切酶识别位点的双链核酸分子； 所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物； 所述混合酶包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。
12.根据权利要求11所述的构建载体的方法，其特征在于，所述第一酶切修饰体系包括反应缓冲液，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。
13.根据权利要求11所述的构建载体的方法，其特征在于，所述修饰物为双脱氧核糖核苷酸。
14.根据权利要求13所述的构建载体的方法，其特征在于，所述修饰物为双脱氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的构建载体的方法，其特征在于，还包括以下步骤 B.将3’端含有突出末端的靶核酸片段与步骤A的产物连接，得到含有靶核酸片段的重组载体； 所述靶核酸片段的3’端的突出末端与步骤A的产物的3’端的突出末端互补。
16.根据权利要求15所述的构建载体的方法，其特征在于，步骤B所述靶核酸片段的3’突出末端为脱氧腺嘌呤核糖核苷酸。
17.根据权利要求11至14中任一项所述的混合酶构建载体的方法，其特征在于，所述前体核酸分子为 pUC57、pUC19、pUC18、pBR322、pBluescript II KS (-)、pBluescript IIKS ( + )、pBluescript II SK (-)、pBluescript II SK ( + )、pTZ57R、pACYC184、pTZ19R 中的任ー种。
18.一种构建载体的方法，其特征在于，包括以下步骤 A.利用混合酶和修饰物，在第二酶切修饰体系中对目标片段进行酶切和修饰，得到3’端含单碱基突出末端的酶切产物； B.将3’端含有单碱基突出末端的酶切产物与3’端含有单碱基突出末端的载体连接环化，得到含有目标片段的载体； 所述目标片段为含有至少ー个平末端限制性内切酶识别位点的双链DNA分子； 所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物； 所述混合酶包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。
19.根据权利要求18所述的构建载体的方法，其特征在于，所述修饰物为双脱氧腺嘌呤核糖核苷酸，所述3’端含有单碱基突出末端的载体为T载体。
20.根据权利要求18或19所述的构建载体的方法，其特征在于，所述第二酶切修饰体系包括反应缓冲液，所述反应缓冲液为在25°C条件下pH值在7至8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法。本发明提供了一种混合酶，包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。本发明还提供了含有该混合酶的酶切修饰试剂盒，以及基于该混合酶构建载体的方法。利用本发明的混合酶、酶切修饰试剂盒能同时实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，简化实验步骤，提高实验效率，并进一步降低对底物的需求量，本发明构建载体的方法能够实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，简化实验步骤，提高实验效率，并能进一步降低对底物的需求量。
文档编号C12N15/64GK102676469SQ20121015164
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者盛司潼 申请人:盛司潼