专利名称：用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物及其检测方法
技术领域：
本发明属于环境生物学领域，尤其涉及一种检测链霉菌two-domain漆酶基因的引物及其检测方法。
背景技术：
漆酶是一类含铜的多酹氧化酶(p-diphenol oxidase, EC. I. 10. 3· 2),属于蓝色多铜氧化酶家族。漆酶一直是生物工程、化学工程、酶工程、材料科学和环境科学等领域十分活跃的研究热点，漆酶作用底物相当广泛，能够对多种酚类污染物显示出较强的催化降解能力，因此漆酶在酚类污染物的处理和生物传感器的构建等方面显示出良好的应用前 景。漆酶具有氧化木质素的能力，可參与木质素的降解或聚合，是參与木质素降解或解聚的三大酶系之一。漆酶的结构决定了漆酶的特性，因而也就决定了漆酶氧化降解木质素的能力。根据漆酶来源的不同可将其分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶三大类，而不同来源的漆酶氧化降解木质素的能力相差很大。与真菌漆酶相比，细菌漆酶有更多的优点，如不需糖基化、热稳定性好及酶活性的最适PH值范围广等。降解木质素的细菌种类很多，放线菌是公认的降解能力较强的ー类丝状细菌，包括链霉菌(5^r印 ο焊Ce1S)、节杆菌ClriAroみacier)、小单胞菌(Micromonospora)和诺卡氏菌(Nocardia)等。由于放线菌可以穿透木质纤维素等不溶基质，因此在中性、微碱性土壌或堆肥中，放线菌參与有机质的初始降解和腐殖化。国外学者对放线菌中的链霉菌进行了研究，发现该菌菌丝分枝多且产量大，在高斯培养基上菌落质地紧密，与培养基结合牢固不易挑起。在初级代谢阶段，该菌有降解木质素的能力，其主要是通过脱甲基、芳环断裂和侧链氧化三种途径降解木质素。有研究曾表明，链霉菌在堆肥和土壌放线菌中占有很大的比重，为堆肥放线菌群落中的优势种群；尤其在堆肥高温期，真菌等中温菌的数量減少，由于链霉菌耐高温及弱碱性环境，在堆肥高温期链霉菌大量繁殖生长，成为堆肥高温期间的优势种群，其在高温阶段产生抗生素抑制致病菌，同时产生木质纤维素胞外酶分解木质纤维素，并在较长时间維持分解半纤维素。因此，链霉菌在木质纤维素含量丰富的农业固体废物堆肥中为降解木质纤维素等难降解有机质发挥了重要的作用。目前的研究主要着重于传统three-domain漆酶基因的结构以及作用机理，对于two-domain漆酶基因及其木质素降解结合机理研究比较少，现在还是属于ー个相对空白的研究区域。Two-domain漆酶是比传统的three-domain漆酶氨基酸残基少、分子量小的一类漆酶。Two-domain漆酶是被广泛认为存在于链霉菌中的ー类新型漆酶，Streptomycesgriseus、Strep tomyces Ipomoeae、ご trep tomyces coeli color、Strep tomyces scabi ei等链霉菌中都发现了具有two-domain的laccase-like漆酶氨基酸。链霉菌two-domain漆酶具有比一般漆酶热稳定性更高、酶的最适宜的pH范围更广等优点。因此，链霉菌属 two-domain漆酶基因的研究对于链霉菌属two-domain漆酶应用的环境条件和应用领域的扩展及其分子生物学研究具有十分重要的意义。另外据我们了解，近年来针对漆酶基因多样性的研究均主要着重于传统three-domain担子真菌，子囊菌以及细菌漆酶基因。对于检验某ー类漆酶基因的特异性引物，主要有担子真菌漆酶引物CulF/Cu2R(多铜结合一区以及多铜结合ニ区设计)、子囊菌漆酶基因特异引物LAC2F/LAC3R (多铜结合ニ区以及多铜结合三区设计)以及细菌漆酶特异性CulAF/Cu2R (多铜结合一区以及多铜结合ニ区设计)。以上漆酶基因的特异性引物都是针对于传统的three-domain漆酶基因所设计的，对于检验链霉菌two-domain漆酶基因的特异性引物,现有文献中未见有相关报道。链霉菌two-domain漆酶与传统的three-domain的漆酶相比,缺少第二个结合域,氨基酸残基少，分子量小,但仍然含有四个铜的结合位点。链霉菌two-domain漆酶在多铜结合位点的保守区域氨基酸与传统的漆酶相比有很大的差异，因此，对于如何设计出能有效检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物，并无先例可循，但该简并引物的开发对于在环境中检测以及得到未知的链霉菌two-domain漆酶基因、进而掌握链霉菌的生物作用机理，又具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了ー种用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物，并相应提供一种能够快速、准确、特异性地检测链霉菌two-domain漆酶基因的方法。本发明提出的技术方案为ー种用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物，所述简并引物包括以下核苷酸序列的上游引物和下游引物
上游引物 Cu2SF :5，-TAC TGG YAC TAC CAC GAC CAY-3’ ；
下游引物 Cu4SR:5’ -RTG VSff CTG SAC RTG RCA GTG-3，；
其中，Y=C/T ；R=A/G ；V=A/G/C ；ff=A/T ;S=G/C。本发明提出的上述简并引物为通用链霉菌two-domain漆酶基因的特异性简并引物，该简并引物能特异性地检验纯培养状态及环境样品中是否存在链霉菌two-domain漆酶基因。本发明的上述简并引物可以由以下方法设计得到
(1)选择在Genbank上发表的链霉菌two-domain的漆酶氨基酸及对应编码的cDNA序
列；
(2)根据GenBank已报道的链霉菌two-domain漆酶基因氨基酸序列以及普通的three-domain氨基酸序列(包括细菌、放线菌、担子菌和子囊菌)，利用DNAman生物学软件对氨基酸进行同源性分析，手动比对的结果如图I所示；在链霉菌two-domain漆酶氨基酸多铜结合ニ区与四区中，这两个区域氨基酸序列比较保守，并且与传统three-domain漆酶氨基酸差异较大，因此本发明简并引物设计所參考的氨基酸为YWHYHDH及HCHVQSH(參见图I);
(3)针对链霉菌two-domain漆酶基因保守区域多铜结合区(copperbinding sites)中与three-domain漆酶氨基酸中不同的保守区域之间，经过发明人的反复试验、测试和检测观察，本发明的简并引物參照的是多铜结合ニ区及四区的保守氨基酸及对应的编码的cDNA序列；根据所在美国国立生物信息数据库NCBI中的氨基酸序列以及cDNA序列，本发明简并引物设计所參考氨基酸的对应的cDNA序列如下表I所示(对应cDNA序列中不一样的为粗
权利要求
1.一种用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物，其特征在于，所述简并引物包括以下核苷酸序列的上游引物和下游引物 上游引物 Cu2SF :5，-TAC TGG YAC TAC CAC GAC CAY-3，；下游引物 Cu4SR:5’ -RTG VSff CTG SAC RTG RCA GTG-3，；其中，Y=C/T ；R=A/G ；V=A/G/C ；ff=A/T ;S=G/C。
2.一种用权利要求I所述的简并引物检测待测样品中是否含链霉菌two-domain漆酶基因的方法，包括以下步骤首先，以待测样品中的DNA为模板，利用所述简并引物进行PCR扩增，PCR扩增反应完成后，利用琼脂糖凝胶对反应后的PCR扩增产物进行电泳检测，根据检测后的电泳图谱中是否含有380bp 430bp的单一条带对待测样品中是否含有链霉菌two-domain漆酶基因进行初筛；如果含有380bp 430bp的单一条带，则将PCR扩增产物回收，将回收后的DNA片段克隆测序得到一定片段长度的DNA序列，再将该DNA序列置入核酸数据库中进行比对，进而确定待测样品中是否含有链霉菌two-domain漆酶基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中，50uL PCR扩增反应体系的组成包括25 UL 2 X Taq PCR MasterMix，浓度为25 U M的所述上游引物的溶液和下游引物的溶液各I 2. 5 u L，用作所述模板的DNA IOOngo
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应条件为94°C变性3 5 min;然后94 °C变性45 60 s，58°C 60°C退火30 45 S，72 °C延伸40 60 S，共循环35次；最后72 °C延伸7 10 min，终止于4 °C。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶的浓度为2.0%。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述克隆测序是指将回收后的DNA片段插入大肠杆菌T载体中克隆，挑取克隆子测序得到所述DNA序列。
全文摘要
本发明用于一种用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物及检测方法，简并引物包括以下上、下游引物Cu2SF5’-TACTGGYACTACCACGACCAY-3’；Cu4SR5’-RTGVSWCTGSACRTGRCAGTG-3’。本发明的检测方法包括以下步骤以待测样品中的DNA为模板，利用简并引物进行PCR扩增，反应后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图谱中是否含有380～430bp的单一条带进行初筛；再将初筛回收后的DNA片段克隆测序，将该DNA序列置入核酸数据库中比对，确定待测样品中是否含有链霉菌two-domain漆酶基因。本发明能够快速、准确、特异性地检测链霉菌two-domain漆酶基因。
文档编号C12Q1/68GK102660651SQ20121018180
公开日2012年9月12日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者任秀娟, 张嘉超, 曾光明, 曾茁桐, 王聪, 胡春晓, 范长征, 蒋敏, 陈明, 鲁伦慧 申请人:湖南大学