一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯y病毒属病毒的方法
【专利摘要】本发明公开了一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’；反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’；其中，Y=C/T，K=G/T，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。本发明还公开了利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-downRT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在约1700bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。本发明引物通用性好，检测方法快速准确。
【专利说明】—种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病毒检测【技术领域】，具体涉及一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Υ病毒属病毒的方法。
【背景技术】
[0002]马铃薯Υ病毒属iPotyvirus')是马铃薯Y病毒科最大的一个属。根据2012年国际病毒分类委员会公布的分类标准，目前该属已报导确定种146个、暂定种32个。马铃薯Υ病毒属病毒对农业生产安全可造成严重威胁，该属病毒以蚜虫的非持久性传播为主要传播途径，一般寄主范围较窄，但多数病毒分布很广；另有少数病毒具有十分广泛的寄主范围，并可造成多种作物明显减产。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该Υ病毒属中被列为检疫性病毒的种类有:马铃薯Α病毒(Potatovirus A, PVA)、马铃薯V病毒{Potato virus V, PVV)、李痘病毒{Plum pox virus,VVN) >香蕉荀叶花叶病毒(β3Π3Π3 bract mosaic virus, BBrMV),共4种。目前尚未见到用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的Touch-down PCR检测方法。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采取如下技术方案:
一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，
正向引物的核苷酸序列为:5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’(如SEQ ID N0.1所示)；反向引物的核苷酸序列为:5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’(如SEQ ID N0.2所示);其中，Y=C/T，K=G/T, R=A/G, B=G/T/C, 1=次黄嘌呤。
[0005]利用上述简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其包括如下步骤:以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增所得的DNA片段位置判定结果，阳性样品中均能检出约1700bp的DNA片段。也就是说，若在1600 - 1800bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。
[0006]具体的，所述的Touch-down RT-PCR反应包括反转录和Touch-down PCR扩增两个过程。
[0007]进一步的，所述反转录的反应温度为42°C ;所述Touch-down PCR扩增时,第一个循环退火温度为55°C，以后每个循环退火温度降低1°C，共进行15个循环，然后用退火温度40°C进行20个循环，延伸温度为72°C。
[0008]此外，对扩增得到的DNA片段进行序列测定后，可鉴定马铃薯Y病毒属病毒的种类。[0009]将上述简并引物应用于马铃薯Y病毒属病毒Touch-down RT-PCR通用检测试剂盒。
[0010]本申请在现有技术基础上重新寻找马铃薯Y病毒属Nib、CP基因上的保守区域，根据保守区域序列设计一对简并引物，通过反转录(reverse transcription, RT)和Touch-down 聚合酶链式反应技术(Touch-down polymerase chain reaction, Touch-downPCR)建立了马铃薯Y病毒属的通用Touch-down RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果，并根据序列测定结果进行病毒种类鉴定。本发明设计的简并引物简并度低，并且利用Touch-down PCR，在高温时积累特异扩增，低温时对特异产物进行大量扩增，与已报道的现有方法相比，获得的条带更加单一，特异性更强。采用本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否含有马铃薯Y病毒属病毒，引物通用性好，检测方法快速准确，为基础研究和进出口安全提供了保证。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为利用本发明方法对该马铃薯Y病毒属病毒的通用性试验结果；图中，1为番木瓜环斑病毒(PRSV)病叶、2为番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)病叶、3为辣椒环斑病毒(ChiRSV)病叶、4为辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)病叶、5为甜椒脉斑驳病毒(PVMV)、6为烟草脉带花叶病毒(TVbMV)病叶、7为甘蔗花叶病毒(ScMV)病叶、8为高粱花叶病毒(SrMV)病叶、9为水茄花叶病毒(WTMV)病叶、10为茉莉花T病毒(MVT)病叶，Μ为2000bp的DNAMark ；
图2为利用本发明方法检测健康寄主植物的结果；图中1至10分别为三角梅、长春花、扶桑、黄瓜、辣椒、水稻、棉花、番木瓜、香蕉、甘蔗的健康叶片；
图3为利用本发明方法检测辣椒病叶的结果；图中，1为健康对照，2、3、4和5为发病辣椒叶片，6为空白对照，Μ为2000 bp的DNA Mark ；
图4为利用本发明方法检测茉莉病叶的结果；图中，1为健康对照，2为发病茉莉叶片，3为空白对照，Μ为2000 bp的DNA Mark ；
图5为利用本发明方法检测颠茄、水茄病叶的结果；图中，1为发病颠茄叶片，2为发病水茄叶片，3为空白对照，Μ为2000 bp的DNA Mark ；
图6为利用本发明方法检测长春花病叶的结果；图中，1为健康对照，2、3和4为发病长春花叶片，5为空白对照，Μ为2000 bp的DNA Mark。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例，对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0013]实施例1
1.引物设计与合成
根据马铃薯Y病毒属中芳:菜Y病毒(AVY)、颠爺斑驳病毒(BeMV)、鬼针草花叶病毒(BiMV)、菜豆黄斑花叶病毒(BYMV)、芹菜花叶病毒(CeMV)、辣椒环斑病毒(ChiRSV)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)、三叶草黄脉病毒(CYVV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、魔芋花叶病毒(KoMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、马铃薯A病毒(PVA)、人参Y病毒(PaVY)、马铃薯V病毒(PVV)、辣椒重型花叶病毒(PepSMV)、秘鲁番茄花叶病毒(PTV)、甜椒脉斑驳病毒(PVMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、大豆花叶病毒(SMV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、烟草脉带花叶病毒(TVbMV)、水茄花叶病毒(WTMV)的Nib、CP基因序列设计引物，引物序列为:
正向引物:5’ -GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’ (如 SEQ ID N0.1 所示)；
反向引物:5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’ (如 SEQ ID N0.2 所示);其中，Y=C/T，K=G/Τ,，R=A/G, B=G/T/C, 1=次黄嘌呤。
[0014]2.样品总RNA的提取
1)取0.lg植物发病叶片，用液氮充分研磨，加入1 mL的Trizol (美国Invitrogen公司)，然后移入灭菌的1.5 mL离心管中，室温下孵育5 min ；
2)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15 s,在室温下孵育5 min后，4°C, 12000 rpm离心15
min ；
3)将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，-20°C沉淀15 min ；
4)4°C, 12000 rpm离心10 min，慢慢倒掉上清液(此时RNA在离心管底形成沉淀)；
5)用75%的乙醇洗漆沉淀两次,4°C,12000 rpm离心5 min,弃去乙醇；
6)沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μ L DEPC水中，_20°C保存备用。
[0015]3.Touch-down RT-PCR 反应的建立
以待检测植物样品总RNA为模板，利用上述正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应。反转录反应为20 μ L反应体系，具体为:在0.2 mL的PCR管中加入3yL DEPC水，5 μ L总 RNA，1 μ L 的 oligo (d Τ) 18 引物(10 μ Μ)，1 μ L dNTP 混合物(10 mM)，混匀后于 65°C保持5 min，迅速转移到冰上骤冷5min ;然后向管中加入4μ L 5Χ反转录缓冲液，1 μ L RNA酶抑制剂(40U/μ L)，(λ 25 μ L反转录酶(200 U/μ L)，DEPC水补足20 μ L(以上试剂均购于大连宝生物工程有限公司)，42°C反应60 min ；72°C 15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。
[0016]Touch-down PCR扩增:反应体系为20 μ L，具体为:在(λ 2 mL的PCR管中加入
14.3μ L DEPC 水，0.5yL cDNA，0.5 μ L 正向引物 SEQ ID N0.1 (10 μ Μ)、0.5 μ L 反向引物SEQ ID N0.2 (10 μ M)，10 X PCR 缓冲液 2 μ L，2 μ L dNTP 混合物(2.5 mM), 0.2 μ L Taq DNA聚合酶(5 U/yL)。反应条件为:95°C预变性3 min ;94°C变性30 s、55°C退火30 s、72°C延伸90s，15个循环，每循环退火温度降低1°C;接着94°C变性30 s、40°C退火50 s、72°C延伸90 s，20个循环；最后72°C延伸10 min。PCR扩增试剂购于大连宝生物工程有限公司，实验在PCR仪上完成。
[0017]Touch-down PCR扩增反应结束后取7 μ L进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物是否含有约1700bp的DNA片段来判定样品中是否含有马铃薯Y病毒属病毒；即若在约1700bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。
[0018]实施例2
本发明方法的通用性检测
取番木瓜环斑 病毒(PRSV)、番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)、辣椒环斑病毒(ChiRSV)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)、甜椒脉斑驳病毒(PVMV)、烟草脉带花叶病毒(TVbMV)、甘蔗花叶病毒(ScMV)、高粱花叶病毒(SrMV)、水茄花叶病毒(WTMV)和茉莉花T病毒(MVT) 10种病毒叶片，按照实施例1所述方法分别提取各叶片总RNA，再按实施例1方法利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示(见图1，图中1至10均在约1700bp位置处出现电泳条带)感染病毒的10种叶片中均检出约1700bp的DNA片段。由此证明本发明方法可用于马铃薯Y病毒属中不同病毒种类的通用检测，具有良好的通用性。[0019]实施例3
本发明方法的的特异性检测
取三角梅、长春花、扶桑、黄瓜、辣椒、水稻、棉花、番木瓜、香蕉、甘蔗的健康叶片，按实施例1所述方法分别提取各叶片总RNA，再按实施例1方法进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示(见图2，图中1至10在约1700bp位置处均未出现电泳条带)10种叶片中均未检出约1700bp的DNA片段。由此证明本发明方法并不会与病毒的寄主植物产生交叉反应，具有良好的特异性，符合检测的要求。
[0020]实施例4
本发明方法在辣椒叶片检测中的应用
取健康辣椒叶片、具有类似病毒症状的4个辣椒叶片样品(依次计为1、2、3、4和5号样品)，按照实施例1方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-downRT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示(见图3)，只有2号病样叶片在约1700bp位置处出现电泳条带，由此判定2号辣椒叶片中含有马铃薯Y病毒属病毒，其余的1、3至5号辣椒叶片样品均不含马铃薯Y病毒属病毒。
[0021]对扩增得到的DNA片段进行回收并连于PMD18T载体(大连宝生物工程有限公司)上，转化大肠杆菌感受态细胞后，挑取阳性克隆3个以上提取质粒测序。利用NCBI的在线序列比对工具对获得的3条序列分别进行BLAST (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，并根据马铃薯Y病毒属分种标准(CP氨基酸同源性小于80%，核苷酸同源性小于76%)，初步确定2号样品为辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和辣椒环斑病毒(ChiRSV)复合侵染样品。表明建立的通用Touch-down RT-PCR方法可用于辣椒等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。
[0022]实施例5
本发明方法在茉莉叶片检测中的应用
取健康茉莉叶片、具有类似病毒症状的茉莉叶片样品(依次计为1和2号样品)，按照实施例1方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示(见图4)，只有2号病样叶片在约1700bp位置处出现电泳条带，由此判定2号茉莉叶片中含有马铃薯Y病毒属病毒。
[0023]按照实施例4方法，对2号样品扩增得到的DNA片段进行克隆测序。对测序结果的比对分析初步确定2号茉莉样品为感染茉莉T病毒样品。表明建立的通用Touch-downRT-PCR方法可用于茉莉等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。
[0024]实施例6
本发明方法在颠茄、水茄叶片检测中的应用取具有类似病毒症状的颠茄和水茄叶片样品(依次计为1和2号样品)，按照实施例1方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示(见图5)，1号、2号病样叶片在约1700bp位置处均出现电泳条带，由此判定1号和2号叶片中均含有马铃薯Y病毒属病毒。
[0025]按照实施例4方法，对1号和2号样品扩增得到的DNA片段分别进行克隆测序。对测序结果的比对分析初步确定1号颠茄样品为感染水茄花叶病毒样品，2号水茄样品为感染烟草脉带花叶病毒样品。表明建立的通用Touch-down RT-PCR方法可用于颠爺、水爺等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。
[0026]实施例7
本发明方法在长春花叶片检测中的应用
取健康长春花叶片、具有类似病毒症状的3个茉莉叶片样品(依次计为1、2、3和4号样品)，按照实施例1方法分别提取各叶片总RNA，再利用正、反向引物进行Touch-downRT-PCR反应，反应结束后1%凝胶电泳检测扩增产物，结果显示(见图6)，3号和4号病样叶片在约1700bp位置处出现电泳条带，由此判定3号和4号长春花叶片中均含有马铃薯Y病
毒属病毒。
[0027]按照实施例4方法，对3号和4号样品扩增得到的DNA片段分别进行克隆测序。对测序结果的比对分析表明，两样品扩增得到的片段源于同一病毒，与已知的约翰草花叶病毒的同源性最高，仅为70%，初步确定感染3号和4号长春花样品的病毒为一种新的马铃薯Y病毒属病毒。表明建立的通用Touch-down RT-PCR方法可用于长春花等样品中马铃薯Y病毒属病毒的快速检测鉴定。
【权利要求】
1.一种简并引物，其特征在于，由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为:5’ -GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’ ；反向引物的核苷酸序列为:5’ -GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’ ；其中，Y=C/T，K=G/T, R=A/G, B=G/T/C, 1=次黄嘌呤。
2.利用权利要求1所述简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤:以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在1600 - 1800bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。
3.如权利要求2所述利用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，所述的Touch-down RT-PCR反应包括反转录和Touch-down PCR扩增两个过程。
4.如权利要求3所述利用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，所述反转录的反应温度为42°C ;所述Touch-down PCR扩增时，第一个循环退火温度为55°C，以后每个循环退火温度降低1°C，共进行15个循环，然后用退火温度40°C进行20个循环，延伸温度为72V。
5.如权利要求4所述利用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，对扩增的DNA片段进行序列测定后，可鉴定马铃薯Y病毒属病毒的种类。
6.权利要求1所述简 并引物应用于马铃薯Y病毒属病毒Touch-downRT-PCR通用检测试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK103642804SQ201310716604
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】章绍延, 王健华, 刘志昕, 张雨良, 余乃通, 张秀春, 周朋, 梁洁 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所