一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种热稳定性好的β-葡聚糖酶，该酶活性为8000-10000U/ml，是出发菌株的2.5倍；比现有的β-葡聚糖酶酶活力高，酶适应温度和pH值范围宽泛，热稳定性及储存稳定性均较高，特别适合工业化需求。最适作用温度为65℃，最适反应pH值5.0。本发明中的β-葡聚糖酶由地衣芽孢杆菌制得，所述地衣芽孢杆菌（Βacillus?licheniformis）β-10-25保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO:M2013538。
【专利说明】一种热稳定性好的β-葡聚糖酶
【技术领域】
[0001]本发明属于酶制剂【技术领域】，特别是一种热稳定性好的β -葡聚糖酶。
【背景技术】
[0002]葡聚糖酶是高效、专一分解葡聚糖的主要酶，在啤酒和饲料的生产中经常使用。在饲料工业中它能水解β_葡聚糖中的1-3或1-4糖苷键，使之降解为低分子糖，降解后的β_葡聚糖失去亲水性和粘性，不会在畜禽肠道中膨胀粘连，使得食糜的消化率以及饲料的能量利用率均得到提高。β -葡聚糖酶应用于啤酒生产中，可以转移分解粘度很高的各种大麦β_葡聚糖，疏松大麦胚乳细胞壁，促进细胞内容物的外溢，提高原料利用率，降低麦芽汁粘度，从而使啤酒产量增加，品质得以提升。
[0003]β_葡聚糖是一种天然多糖，通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌及真菌的细胞壁，或者高等植物种子的包被中。β-葡聚糖是构成禾本植物细胞壁的一种结构性非淀粉多糖，在大麦、黑麦、高粱、大米及小米的胚乳细胞壁中含量尤其高。与一般糖类主要以α-1，4_糖苷键结合而成为线形分子不同的是，植物细胞壁中的β_葡聚糖是以混合的β- (1，3)，(1，4)糖苷键连接形成的D型葡萄糖聚合物，因此葡聚糖可以以很大的分子量溶解于水中，从而具有粘度大、亲水性高、吸水膨胀力和持水性高的性质。当以大麦作为啤酒生产原料时，上述性质便会影响麦芽汁的过滤速度，降低固形物的浸出率，还会因凝胶沉淀作用而降低啤酒的品质；同时当含有β_葡聚糖的作物用作饲料时，会增加非反刍禽畜的肠液粘度，成为饲料的抗营养因子之一，降低饲料的利用率。
[0004]目前，美国、日本、丹麦、德国、澳大利亚、加拿大等国均已采用葡聚糖酶作为啤酒和饲料工业的主要酶制剂，而其在医药、纺织、废水处理和日用化工、生物防治等其他方面的应用价值也逐渐显现出来，前景十分广阔。但是热稳定性差和酶活力低已经成为影响其应用效果的制约因素。
`[0005]中国专利CN103013873A公开了一株产热稳定性β -葡聚糖酶的菌株，该发明首次提供了一株来源于温泉的能够生产β -1, 3-1，4-葡聚糖酶的高地芽孢杆菌，并克隆得到了该酶的基因，该酶在60°C条件下保存Ih后仍能保持90%的酶活力。
[0006]中国专利CN102719416A提供了一种提高β _1，3_1，4_葡聚糖酶热稳定性的方法，通过HNO2对β -1, 3-1，4-葡聚糖酶进行化学修饰，所得的β -1, 3-1，4-葡聚糖酶T5tl值和t(1/2,60D 分别提高了 4.76%和62.1%。
[0007]之前，市场上高品质的β -葡聚糖酶几乎被国外的酶制剂生产公司所垄断，虽然近几年我国所报道的微生物产葡聚糖酶的酶活力已达到甚至超过了国际水平，但是能够获得兼具高活性及热稳定性的β_葡聚糖酶及其生产菌株仍然是目前工业应用中亟待解决的一大问题。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种热稳定性好的β -葡聚糖酶。[0009]所述的热稳定性好的β -葡聚糖酶，其酶学性质如下:
[0010](I)温度:该酶温度适应范围较宽，最适作用温度为65°C，在50_70°C之间具有较闻的酶活；
[0011](2) pH:该酶最适反应pH值为5.0，在pH值为4.0时酶活完全稳定；
[0012](3)酶活性:8000-10000U/ml，是出发菌株的2.5倍。
[0013](4)热稳定性:该酶在60°C条件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C条件下保存IOmin后保持20%以上酶活；
[0014](5)存储稳定性:该酶在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4°C保存12个月后酶活损失小于20%。
[0015]所述的β -葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤:
[0016](I)种子培养
[0017]将地衣芽孢杆菌斜面菌种经三级摇瓶发酵及一级种子罐发酵；
[0018]所述种子培养的培养基为:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCll %,ρΗ4.5-7.0,121-123°C灭菌 30_40min。
[0019](2)发酵罐发酵
[0020]将一级种子罐发酵`液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45 °C，搅拌速度200-300r/min，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10_15h ;然后将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养15-20h ;此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h ;再将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养10-15h ;
[0021]所述发酵培养基组成为:麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β -葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水1000mL, pH值4.5-7.0,121°C灭菌20min ；
[0022]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0023]称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10_15份；麦冬10_15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，然后降温至45-60°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOff功率下超声萃取0.5~1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
[0024]所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10% ；
[0025]所述混合酶的重量份数组成为:β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份，酸性蛋白酶
10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0026]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
[0027](3)发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β -葡聚糖酶。
[0028]所述的β -葡聚糖酶由地衣芽孢杆菌(B acillus Iicheniformis) β-10-25生产所得。该菌株已于该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院),保藏号为CCTCCN0:M2013538o
[0029]所述菌株在固体平板上菌落为白色，边缘不整齐，表面干燥不透明，镜检为革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状，芽孢中生，椭圆形，不膨大。
[0030]所述菌株生理生化特征:V-P试验( + )，淀粉水解( + )，酪素水解( + )，明胶水解( + )，硝酸盐还原( + )，吲哚试验(_)，利用柠檬酸盐( + )，硝酸还原( + )，甘露醇( + )，木糖(+ )。
[0031]有益效果:
[0032]1、由该菌株生产所得的β -葡聚糖酶酶活力高达8000-10000u/ml，是原始菌株的
2.5倍；在50-70°C条件下具有较高酶活，最适反应温度为65°C;适用反应pH值范围为5.0 ；在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4°C保存12个月后酶活损失小于20%。比现有的β -葡聚糖酶酶活力高，酶作用最适PH值范围宽泛，热稳定性及储存稳定性均较高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
[0033]2、本发明中的葡聚糖酶在制备过程中一方面采用温度刺激发酵的方法，一方面对培养基实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，使得所得的β -葡聚糖酶具有更好的稳定性和保存活性。
【具体实施方式】
[0034]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0035]实施例1:
[0036]淀粉酶活性的测定
[0037](I)酶活单位的定义:lmL粗酶液,于50°C、pH6.0条件下，Imin从浓度为4mg/ml义葡聚糖溶液终降解出I μ mo I还原糖，即为I个酶活单位(lU/ml)
[0038](2)酶活力测定方法:采用DNS法测定
[0039]①取5支试管，编号1、2、3、4、5，分别加入0.5ml葡聚糖溶液；
[0040]②向1、2、3号试管中加入0.5ml待测粗酶液，于50°C水浴中反应15min ；
[0041]③向4、5号试管中加入0.5ml待测粗酶液；
[0042]④向5支试管中个加入3mlDNS试剂,摇匀后沸水浴5min ；
[0043]⑤水浴冷却后，以4、5号试管为对照，测定1、2、3号在540nm下的吸光度；
[0044]⑥对照葡萄糖标准曲线计算酶活。
[0045]实施例2:
[0046]酶学性质的测定
[0047](I)温度对β-葡聚糖酶酶活性的影响
[0048]于40、50、60、70、80、90°C下分别测定所得β -葡聚糖酶粗酶液的活力，结果表明该酶在50-70°C之间均具有较高的酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽，其最适作用温度为 65。。。[0049](2) β-葡聚糖酶的热稳定性
[0050]将所得的粗酶液于40、50、60、70、80、90°C下保存10min、30min、Ih后于50°C条件下测定酶活，结果表明该酶在60°C条件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C条件下保存IOmin后保持20%以上酶活。
[0051](3) β-葡聚糖酶的保存稳定性
[0052]将所得的粗酶液于4°C和室温条件下保存I天、15天、I个月、3个月、6个月和12个月后于50°C条件下测定酶活。结果表明该酶在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4°C保存12个月后酶活损失小于20%。
[0053](4) pH对酶活性的影响
[0054]在50°C，pH3-9下分别测该酶酶活，结果表明该酶在pH4.5-7.0时酶活性较高，最适 pH 为 6.5.。
[0055]实施例3:
[0056]一种β -葡聚糖酶的制备方法
[0057]包括如下步骤:
[0058](I)液体种子扩大培养
[0059]①一级种子培养:将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40°C，培养时间IOh ；
[0060]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；`
[0061]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40°C，培养时间10-15h ；
[0062]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41 °C，搅拌速度300rpm，通风量(V/V) 1: 1.5，罐压
0.05Mpa,培养时间15h ；
[0063]所述种子培养基为:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉1%，NaCll%, pH5.5，121°C 灭菌 35min。
[0064](2)发酵罐发酵
[0065]将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度37°C，搅拌速度250r/min，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间12h ;然后将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37°C时恒温培养18h ;此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h ;再将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37°C时恒温培养12h ；
[0066]所述发酵培养基组成为:麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β -葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水1000mL, pH值5.5，121°C灭菌20min ；
[0067]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0068]称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；麦冬12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至50°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOW功率下超声萃取lh，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0069]所述混合酶添加量为混合物料总重量的8%。
[0070]所述混合酶的重量份数组成为:β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β -淀粉酶18份，果胶酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0071]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1.2。
[0072](3)发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β -葡聚糖酶。
[0073]经上述制备方法得`到的β -葡聚糖酶液体酶活力为10000u/ml。
【权利要求】
1.一种热稳定性好的β-葡聚糖酶，所述β-葡聚糖酶具有以下特性: (1)温度:该酶温度适应范围较宽，最适作用温度为65°C，在50-70 V之间具有较高的酶活； (2)pH:该酶最适反应pH值为5.0，在pH值为4.0时酶活完全稳定； (3)酶活性:8000-10000U/ml，是出发菌株的2.5倍； (4)热稳定性:该酶在60°C条件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C条件下保存IOmin后保持20%以上酶活； (5)存储稳定性:该酶在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4°C保存12个月后酶活损失小于20%。
2.如权利要求1所述的一种热稳定性好的β_葡聚糖酶，其特征在于，该酶由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) β-10-25 生产所得，菌种保藏号为 CCTCC Ν0:Μ2013538。
3.如权利要求1或2所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶，由以下方法制得: (1)地衣芽孢杆菌(Bacillus Iicheniformis) β-10-25菌种活化,一、二、三级种子培养和种子罐培养； (2)发酵罐发酵 将一级种子罐发酵液以 3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45°C，搅拌速度200-300r/min，通风量(V/V) 1:1-3,培养时间10_15h ;然后将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养15-20h ;此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h ;继续将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养10-15h ; (3)发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶。
4.如权利要求3所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，所述种子培养基组成为:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉l%，NaCll%，pH4.5-7.0。
5.如权利要求3所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，所述发酵培养基组成为:麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β -葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂 0.5g,纯净水 1000mL, pH 值 4.5-7.0,121°C灭菌 20min。
6.如权利要求5所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下: 称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；麦冬12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至50°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOff超声萃取0.5~1.5h ;滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
7.如权利要求6所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，中草药粉剂的制备方法中所述混合酶的重量份数组成为:β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β，淀粉酶18份，果胶酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
8.如权利要求1或2所 述的一种热稳定性好的β -葡聚糖酶在饲料和啤酒工业中的应用。
【文档编号】C12N9/24GK103805578SQ201310716429
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】李洪兵, 李海清, 胡永明, 胡波, 易继云, 樊淳红 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司