专利名称：在酵母中高效表达n-酰基高丝氨酸内酯酶的dna及其构建的工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及在酵母中高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的DNA及其构建的工程菌。
背景技术：
由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码 子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为 是该物种高表达基因的优越密码子(optimal codon)，这种现象称为密码子偏爱性(codon bias)。密码子的偏爱性使得克隆的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母 中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用 密码子的统计分析证实所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行 偏爱性改造能大量提高重组蛋白在该系统中的表达量。N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子 (AHLs)的蛋白水解酶，通过水解AHLs生成酰基高丝氨酸，使AHLs失去活性，从而阻断病原 菌的群体感应机制，使病原菌失去致病能力，其广泛存在于多种微生物中。近年来N-酰基 高丝氨酸内酯酶作为一种新型抗菌策略(群体感应淬灭策略)的工具酶而成为研究的热
点ο目前主要是通过构建转基因植物、转基因细菌研究其在群体感应淬灭中的作用机 制，而转基因植物或转基因细菌在实际应用中存在生物安全和有效性方面的问题。
发明内容
本发明的目的是提供在酵母中高效表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的DNA及其构建 的工程菌。本发明提供的DNA分子，为如下(a)或(b)(a)序列表的序列2自5’末端第7至759位核苷酸所示的DNA ；(b)序列表的序列2所示的DNA。含有所述DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。所述重组表达载体可为在PPIC9载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组 质粒，优选为在PPIC9载体的EcoR I和Not I酶切识别位点之间插入所述DNA分子得到的
重组质粒。所述重组菌可为在宿主菌中导入所述DNA分子得到的重组菌，具体可为在宿主菌 中导入所述重组表达载体得到的重组菌。所述宿主菌可为毕赤酵母(Pichia pastoris), 具体可为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) AiiA-B546M, CGMCC No. 3975。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) Ai Α-Β546Μ, CGMCC No. 3975 已于 2010 年 7
3月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北 京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 3975。所述的重组菌可用于生产N-酰基高丝氨酸内酯酶。本发明还保护一种生产N-酰基高丝氨酸内酯酶的方法，是培养所述重组菌，得到 N-酰基高丝氨酸内酯酶。所述方法具体可为30°C、250-280rpm(4-5Xg)培养所述重组菌，得到N-酰基高 丝氨酸内酯酶；培养过程中采用甲醇诱导。所述甲醇在所述培养液中的浓度优选为0. 5% (体积百分含量)。所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的底物具体可为N-3-氧-辛酰高丝氨酸 内酯(3-OXO-C8-HSL)。本发明在现有N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiaB546的基础上，对其DNA序列进 行优化，改造成酵母偏爱密码子所编码的基因，得到了优化后的基因aiiaB546M，该优化后 基因在毕赤酵母中的表达能力显著高于优化前基因。本发明构建了含有aiiaB546M的重组 表达质粒，将该重组表达质粒导入毕赤酵母，可以得到高效高丝氨酸内酯酶的重组菌。其中 一株重组菌的表达能力尤为高效。本发明可以降低N-酰基高丝氨酸内酯酶生产成本，提高 应用的安全性和有效性，对于高丝氨酸内酯酶的生产具有重大价值。
图1为优化前基因和优化后基因的比对。图 2 为 aiiaB546M/pUC57 的电泳图；1 为 Ikb plus ladder Marker ；2 为质粒 aiiaB546M/pUC570图3为酶切后质粒的电泳图；1为为pPIC9载体双酶切片段；2为质粒aiiaB546M/ pUC57双酶切后的两条片段，目的基因aiiaB546M为753bp ；3为Ikb plusladder Marker。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的质粒或菌株如下大肠杆菌(Escherichia coli) Transl 购买自北京全式金生物公司。毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115 购买自北京全式金生物公司。pPIC9 载体购买自 Invitrogen 公司。KYC55 指示菌(Agrobacterium tumefaciens KYC55)中国农业科学院饲 料研究所保证向公众提供；参考文献Zhu J，et al. Applied and Environmental Microbiology. 69 :6949_6953。pUC57载体购买自南京金斯瑞生物科技有限公司。实施例中所用的培养基和溶液如下LB培养基1 %蛋白胨、0. 5 %酵母提取物、1 % NaCl，pH7. 0。YPD培养基酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
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MD固体培养基YNB 13. 4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4X 10_4g/L，琼脂粉20g/L。BMGY培养基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB) 13. 4g/L，生物素 4Xl(T4g/L，甘油 IOmL0BMMY培养基以0.5%甲醇(体积百分含量)代替甘油，其余成份与BMGY相同。葡萄糖基础培养基葡萄糖0. 75g，琼脂粉3g，超纯水138g，灭菌冷却后加入ATMM 盐溶液 15mL, X-gal 溶液 200 μ L0溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA ；溶液II :0· 2mol/L NaOH, 1 % SDS(现配现用)；溶液III :3mol/L 醋酸钾，5mol/L 醋酸(ρΗ4· 8)；TAE (50 X) :242g Tris 碱，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0. 5mol/L EDTA (ρΗ8· 0)，用无菌 水定容至1000mL。ATMM 盐溶液KH2PO4 0. 079mol/L, NaOH 0. 044mol/L, (NH4)2SO4 0. 015mol/ L，MgSO4 · 7H20 0. 6mmol/L, CaCl2 0. 06mmol/L, FeSO4 ‘ 7H20 0. 027mmol/L, MnSO4· H2OO. 007mmol/L。PBS 缓冲液NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HP04 4. 3mmol/L, KH2PO4L 4mmol/L, pH7. 3，121 °C 高压湿热灭菌 20min。实施例中X-gal购自Sigma公司，DNA回收试剂盒购自TakaRa公司，各种限制性 内切酶和Taq酶均购自TakaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。实施例中的酶活测定方法如下方格纸边长为18cm的正方形纸上排列22个长方形，每个长方形的长为15个小 方格，宽为2个小方格，每个小方格为边长4mm。制备反应液20 μ L待测溶液+180 μ L PBS缓冲液(ρΗ8. 0)+1 μ L lmg/ ml3-oxo-C8-HSL ；30°C水浴，反应 0. 5h。制备琼脂条将葡萄糖基础培养基倒入直径为18cm的大平板中，凝固后，按照方 格纸的线条用无菌小刀将培养基切成间隔4mm的22个长方形细条；在每个细条的前8mm处 用直径为6mm的无菌打孔器压成圈环，之后每隔4mm用无菌牙签接入KYC55指示菌，再将反 应液10 μ L加入到打孔的圈环中，待渗入培养基后，用封口膜封好放入30°C温箱，培养24h 后观察结果，计数变蓝的点，换算成距离，根据已制好的标准曲线计算酶活。以不加入酶液 的PBS缓冲液为CK。标准曲线制备用无水乙醇将N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)稀释成 系列的浓度梯度，并等体积加入上述琼脂条的加样圈内，每个稀释度设定三个平行，平板置 于30°C培养24h。计数变蓝的点，换算成距离，即测量显色半径，分析信号分子物质的量 (nmol/L)与半径(cm)的关系，构建标准曲线。
U = 6.52*(e°_—-e°.:)48_)*50-(待测溶液为20 μ 1);
30*106U = 6. 52* (1. 4163Eck-l. 4163Es) *50/30/106(待测溶液为 20 μ 1)；e = 2. 718281828459045，R(距离mm)。Rck 不加入酶液的PBS缓冲液的扩散距 离。Rs:反应液样品的扩散距离。以上两个公式相同，第二个式子是对第一个式子的简化。酶活单位⑶的定义在30°C，pH8. 0条件下，每分钟降解Inmol底物N_3_氧-辛酰高丝氨酸内酯(3-OXO-C8-HSL)所需要的酶量。 实施例1、N-酰基高丝氨酸内酯酶基因密码子的优化 一、高丝氨酸内酯酶基因密码子的优化将N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiaB546 (如序列表的序列1所示)进行密码子 优化，优化后的基因aiiaB546M如序列表的序列2所示。基因aiiaB546和优化后的基因 aiiaB546M的比对见图1。二、重组质粒 aiiaB546/pUC57 的构建1、人工合成序列表的序列1所示的aiiaB546基因。2、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切步骤1合成的基因，回收酶切产物。3、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切pUC57载体，回收载体骨架。4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到连接产物。5、将连接产物进行测序，测序结果表明，得到了的重组质粒aiiaB546/pUC57(在 PUC57载体的EcoR I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列1所示的DNA。三、重组质粒aiiaB546M/pUC57的构建1、人工合成序列表的序列2所示的aiiaB546M基因。2、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切步骤1合成的基因，回收酶切产物。3、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切pUC57载体，回收载体骨架。4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到连接产物。5、将连接产物进行测序，测序结果表明，得到了的重组质粒aiiaB546M/pUC57(在 PUC57载体的EcoR I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA。实施例2、重组表达载体的构建一、pPIC9_aiiaB546M 的构建1、分别提取重组质粒aiiaB546M/pUC57和质粒pPIC9采用北京天根生物技术公司的质粒小提试剂盒提取质粒，1. 2%琼脂糖凝胶电泳 检测(电泳缓冲液1 XTAE，电压l-5V/cm，时间约30min)。重组质粒aiiaB546M/pUC57的电 泳图见图2。2、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切质粒pPIC9，回收载体骨架。1.0%琼脂 糖凝胶电泳检测，电泳图见图3。3、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切重组质粒aiiaB546M/pUC57，回收750bp 左右的DNA片段(aiiaB546M)。1. O%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图3。4、将步骤2回收的载体骨架和步骤3回收的DNA片段用T4DNA连接酶4°C过夜连 接，得到连接产物。5、连接产物的鉴定(1)大肠杆菌(E. coli) Trans 1感受态细胞的制备①取1/100体积的大肠杆菌Trans 1菌液，接种于500mL LB培养液中，37°C振荡 培养过液，使其OD6tltl约为0. 5-0. 7 ；②将培养液冰浴20min，以后的步骤尽可能保持在0°C，所有的容器在加细胞之前 都预冷。③将步骤②的培养液4000g、4°C离心15min，弃上清；
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④用500mL预冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重悬细胞(沉淀)；4000g、4°C离 心15min，弃上清；用250mL预冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重悬细胞，4000g、4°C离心 15min，弃上清；用20mL预冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重悬细胞，转移到30mL无菌 离心管中，4000g、4°C离心15min，弃上清；用l_2mL预冷的10% (10g/100ml)甘油水溶液重 悬细胞；将细胞按每管40 μ L分装，液氮速冻，_70°C保存，备用(感受态细胞)。(2)连接产物的鉴定采用热激转化将步骤4的连接产物转化步骤(1)制备的感受态细胞将40 μ L感 受态细胞与 ο μ L连接产混合，冰浴30min ；42°C水浴60sec，置于冰上2min ；加入500 μ L LB液体培养基，37°C摇床培养Ih ；涂布于含100 μ g/mL氨苄青霉素的固体LB平板，37°C温 箱培养16h。挑取40个单克隆菌落进行PCR验证，选取PCR阳性克隆送博迈德公司测序，得到 重组质粒pPIC9-aiiaB546M(在骨架载体pPIC9的EcoR I和Not I酶切位点之间插入了序 列表的序列2所示的DNA)。二、pPIC9_aiiaB546 的构建用重组质粒aiiaB546/pUC57代替重组质粒aiiaB546M/pUC57，其它同步骤一，得 到重组质粒pPIC9-aiiaB546 (在骨架载体pPIC9的EcoR I和Not I酶切位点之间插入了 序列表的序列1所示的DNA)实施例3、重组菌的制备一、转aiiaB546M基因重组菌的制备和筛选1、质粒DNA的大量提取①取实施例2中得到的经过测序验证的含有重组质粒pPIC9-aiiaB546M的大肠杆 菌Transl，接种于含100 μ g/mL氨苄青霉素的50mL LB培养基中，37°C振荡过夜培养；②取过夜培养液50mL，10, 000rpm、4°C离心5min，弃上清，倒置离心管于吸水纸 上，吸去多余的液体；③将沉淀重悬于2mL溶液I中，剧烈振荡，充分悬浮；加入4mL新鲜配置的溶液II， 颠倒混勻，冰上放置4min ；加入3mL溶液III，颠倒混勻，冰上放置5min，13，000rpm、4°C离 心 IOmin ；④移出上清，用擦镜纸过滤；上清中加入0. 6-1倍体积的异丙醇，室温放置IOmin ； 13，000rpm、4°C离心IOmin ；弃上清，70%乙醇洗沉淀，稍离心后倾去乙醇，将沉淀真空干燥 IOmin ；⑤在干燥后的离心管中，每管加入500 μ L ΤΕ，把沉淀打散，移入Eppendorf管 中，加入10 μ L RNase (20 μ g/mL)，37°C保温30min ；每管加入500 μ L Tris饱和酚，混勻， 12，OOOrpm离心IOmin ；吸取上层水相于新Eppendorf管中，加入500 μ L酚氯仿混合液， 混勻，12，OOOrpm离心IOmin ；小心吸取上层水相于新Eppendorf管中，加入500 μ L氯仿混 勻，12，OOOrpm离心IOmin ；取上清，加入等体积异丙醇，冰上放置15min, 14，OOOrpm离心 15min ；弃上清，沉淀加500 μ L 70%乙醇洗，离心3min。⑥弃去乙醇，沉淀(pPIC9-aiiaB546M质粒)于真空干燥器中干燥IOmin ；离心管 中加入50 μ L TE液，-20°c保存备用。2、质粒的线性化
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取50 μ L pPIC9-aiiaB546M质粒，用限制性内切酶BglII37°C酶切2_3h，得到酶 切产物。向100 μ L酶切产物加入1/10体积的乙酸钠(ρΗ5. 2)及2_3倍体积的无水乙醇 沉淀，13，OOOrpm离心15min，用70 %乙醇漂洗，真空干燥，离心管中加入10 μ L无菌水，置 于-20°C待用(线性化质粒)。3、毕赤酵母GS115感受态细胞的制备①挑取YPD平板上的毕赤酵母GS115单菌落于5mL YPD液体培养基中，30°C、 250rpm摇床过夜；②将摇床过夜的新鲜GSl 15菌液按1/1000接种量转接至IOOmL YPD液体培养基 中，30°C、250rpm摇床过夜，0D600约为1. 3-1. 5时，停止振荡；③将预冷的菌液转移至冰预冷的离心管中，4°C、1500g离心5min ；沉淀用200mL预 冷的无菌水重悬，4°C、1500g离心5min ；沉淀用IOOmL预冷的无菌水重悬，4°C、1500g离心 5min ；沉淀用20mL预冷的lmol/L山梨醇水溶液重悬，4°C、1500g离心5min ；沉淀用ImL预 冷的lmol/L山梨醇水溶液重悬，按每管80 μ L分装，液氮速冻，_70°C保存，备用(感受态细 胞)。4、重组菌的制备①将80 μ L步骤3的感受态细胞与10 μ L步骤2的线性化质粒混合，并将其转至 电转化杯中；②将装有混合液的转化杯冰浴5min ；调整好基因导入仪的参数(置于PIC档)，电 击一次，电压2000V，时间约为5ms ；③立即往转化杯中加入700 μ L预冷的lmol/L山梨醇水溶液，混勻，并将其转至灭 过菌的离心管中；④将混合液涂于MD板上，将MD板置于30°C培养箱中培养2_3天，直到长出菌落为 止，即为转aiiaB546M基因重组菌(转化子)。5、高效表达菌株的筛选①用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号点到MD平板上， 每个平板上一般点100个单菌落；②按编号挑取MD平板上的单克隆接种于3mL BMGY培养基中，30°C、250_280rpm摇 床培养2-3天；③将摇床培养2-3天的培养液3250rpm离心5min，取沉淀(尽量将上清除尽)，再 往沉淀中加入ImL BMMY培养基，重新在30°C、250_280rpm诱导培养；④诱导培养48h后，将菌体离心，取上清作为待测溶液检测酶活，筛选出酶活高的 菌株。设三组平行实验，筛选出较稳定的高表达菌株。筛选得到一株高效表达高丝氨酸内酯酶的重组菌，将其命名为巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)AiiA-B546M。该菌株已于2010年7月02日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保 藏号为 CGMCC No. 3975。巴斯德毕赤酵母AiiA-B546M得到的待测溶液的酶活为36. 1 士0. 9U/mL,较对照菌 得到的待测溶液的酶活提高了 6. 92%。二、转aiiaB546基因重组菌的制备
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取实施例2中得到的经过测序验证的含有重组质粒pPIC9-aiiaB546的大肠杆菌 Transl，代替步骤一的1的①中的大肠杆菌，其它同步骤一，得到转aiiaB546基因重组菌 (对照菌)。挑取MD平板上的对照菌单克隆接种于3mL BMGY培养基中，30°C、250_280rpm摇床 培养2-3天；将摇床培养2-3天的培养液3250rpm离心5min，取沉淀(尽量将上清除尽)， 再往沉淀中加入ImL BMMY培养基，重新在30°C、250-280rpm诱导培养；诱导培养48h后，将 菌体离心，取上清作为待测溶液检测酶活；设三组平行实验。对照菌得到的待测溶液的酶活为35. 6士 1. lU/mL。实施例4、重组菌的酶活测定分别将巴斯德毕赤酵母Ai iA_B546M和对照菌进行如下培养和酶活测定1、将菌株接种于装有150mL BMGY培养基的500mL三角瓶，30°C、250_280rpm摇床 培养2-3天；2、取培养液，3250rpm离心5min，取沉淀(尽量将上清除尽)；3、往沉淀中加入80mL BMMY培养基，30°C、250_280rpm诱导培养；为补偿甲醇的挥 发损失，每隔12h补加甲醇溶液，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5% (体积百分含量)；每隔 12h取样一次，直至48h ；4、将取样的菌液离心，上清液作为待测溶液进行酶活测定；设三组平行实验。巴斯德毕赤酵母AiiA-B546M得到待测溶液的酶活为36. 2 士 1. OU/mL。对照菌得 到的待测溶液的酶活为33. 1 士0. 7U/mL。即密码子改造后，比改造前菌株的酶活性提高了 9. 53%，显著性(P < 0. 05)。
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权利要求
DNA分子，为如下(a)或(b)(a)序列表的序列2自5’末端第7至759位核苷酸所示的DNA；(b)序列表的序列2所示的DNA。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在PPIC9载 体的多克隆位点插入权利要求1所述DNA分子得到的重组质粒。
4.如权利要求3所示的重组表达载体，其特征在于所示重组表达载体为在pPIC9载 体的EcoR I和Not I酶切识别位点之间插入权利要求1所述DNA分子得到的重组质粒。
5.如权利要求2所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是在宿主菌中导入权利要求1 所述DNA分子得到的重组菌；所述宿主菌为毕赤酵母(Pichia pastoris)，优选为毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于权利要求1所述DNA分子通过权利要求3 或4所述重组表达载体导入所述宿主菌。
7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)AiiA-B546M, CGMCC No. 3975。
8.权利要求2、5、6或7所述的重组菌在生产N-酰基高丝氨酸内酯酶中的应用。
9.一种生产N-酰基高丝氨酸内酯酶的方法，是培养权利要求2、5、6或7所述的重组 菌，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，30°C、250-280rpm培养所述重 组菌，培养过程中采用甲醇诱导，所述甲醇在所述培养液中的浓度优选为0. 5% (体积百分 含量)；所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的底物为N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯。
全文摘要
本发明公开了在酵母中高效表达高丝氨酸内酯酶的DNA及其构建的工程菌。本发明提供的DNA为序列表的序列2所示的DNA。本发明在现有高丝氨酸内酯酶基因aiiaB546的基础上，对其DNA序列进行优化，得到了优化后的基因aiiaB546M，该优化后基因在毕赤酵母中的表达能力显著高于优化前基因。本发明构建了含有aiiaB546M的重组表达质粒，将该重组表达质粒导入毕赤酵母，可以得到高效高丝氨酸内酯酶的重组菌。其中一株重组菌的表达能力尤为高效。本发明对于高丝氨酸内酯酶的生产具有重大价值。
文档编号C12N1/19GK101914556SQ201010239510
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者何夙旭, 刘玉春, 周志刚, 姚斌, 孟昆, 张宇婷, 张美超, 曹雅男 申请人:中国农业科学院饲料研究所