专利名称：枣树水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐盐性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉 及基因工程技术领域，具体为一种枣树水通道蛋白基因及在提高植物耐 旱性和耐盐性中的应用。
背景技术：
公知，水通道蛋白(aquaporin，AQP)大量存在于植物、动物、微生物等多种生物体 内。植物水通道蛋白是一类在植物体内形成水选择性运输通道的蛋白质，它在植物种子萌 发、细胞伸长、气孔运动等过程中调节水分的快速跨膜运输，它使植物能快速灵敏地调节细 胞内与细胞间的水分流动。有些水通道蛋白是组成型表达的，而多数水通道蛋白则受环境 因子，如干旱、盐害、激素、光质等诱导表达，因此研究水通道蛋白与植物抗逆性的关系备受 人们关注。第一个植物水通道蛋白Y-TIP是从模式植物拟南芥中分离出来的，它位于液泡 膜上，因此被命名为TIP(tonoplast intrinsic protein)。通过爪蟾卵母细胞表达系统分 析确认了 Y-TIP蛋白运输水的专一性功能。到目前为止，科学家已经在拟南芥、豌豆、烟 草、玉米、水稻等多种植物中都发现了 AQP。另外，从蛋白数据库中也发现了大量AQP的同源 物，它们广泛存在于单子叶和双子叶植物以及C3和C4代谢植物中，通过氨基酸序列同源性 分析推测它们可能也是AQP。越来越多的研究表明，大多数植物中都存在着多个AQP及其 同源物且含量丰富。如拟南芥中，PIPl蛋白占叶与根质膜蛋白的以上；菠菜叶肉细胞 中含丰富的质膜AQP，占其质膜总蛋白的20% ；菜豆子叶中含丰富的a-TIP同源物，约占细 胞可抽提总蛋白的2%。根据水通道蛋白氨基酸序列同源性及结构特征，可将其分为4类 质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein，PIPs)、液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic protein,TIPs)、类nodulin26膜内蛋白(nodulin26_like intrinsic protein, NIPs)和小分子碱性内在蛋白(small and basic intrinsic protein，SIPs)。植物水通道蛋白的发现是植物水分生理学研究的重大进展，将水分代谢的研究引 入了一个全新的阶段。目前，科学家们已经在拟南芥、豌豆、玉米、烟草、向日葵、含羞草等多 种植物中发现了 AQP，并对它们中的某些蛋白进行了分类、功能、亚细胞定位等方面的研究。 但是对于中国古老的、重要的经济树种——枣树的水通道蛋白的研究还没有相关的报道， 到目前为止，还未见有从枣树中分离出AQP基因并用于提高植物耐旱性和耐盐性方面的报 道。枣树原产于我国黄河流域，是我国特有的经济林树种之一，枣树耐寒，抗旱，抵御各种 外界不良因子的能力强，尤其是对土壤瘠薄、干旱有很强的忍耐力，在晋西北、太行山、陕北 等黄土高原地区，枣树一般生长在土壤相当贫瘠、少雨干旱的丘陵山坡、高崖边等不良环境 下，且都能正常生长结果。这种极其耐旱、耐瘠薄的特点显著优于其它农作物，因此枣树的 抗逆性基因是非常宝贵的遗传资源，了解具有优良抗性的枣树的抗逆机制，逆境相关基因 的分子结构、表达、功能及调控，可充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定 的实验数据和奠定理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枣树水通道蛋白基因，该基因来自于枣树，可作为目 的基因导入植物，提高植物耐旱性和耐盐性，进行植物品种改良。本发明是采用如下技术方案实现的一种枣树水通道蛋白基因，该基因的核苷酸 序列具有如SEQ ID NO 1所示的序列。由所述一种枣树水通道蛋白基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列，该氨基酸序列 具有如SEQ ID NO :2所示的序列。一种枣树水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐盐性中的应用。本发明从壶瓶枣树(Ziziphus jujuba Mill. HUPING)的结果枝(枣吊)，利用CTAB 法提取总RNA，根据mRNA纯化试剂盒方法从提取到的总RNA中分离纯化mRNA，构建cDNA文 库，然后通过Blast分析与比对，从中克隆到一个cDNA序列为枣树中的水通道蛋白基因全 序列，将其命名为 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic protein)。 根据该基因的核苷酸序列，设计并合成引物，上游引物WP3序列为5' —ATGGATCC]ΑΤ<^'GCAAAAGACCCTG-3‘，包含 BamH I 限制性酶切位点(即有下
划线部分)，两个保护碱基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密码子ATG。下游引物WP6 序列为5' —ATACCCGGGjTCA]AACATGAGGGTT-3‘，包含Sam I 限制性酶切位点(即有下划 线部分)，三个保护碱基ATA，及水通道蛋白Z jPIP2基因的终止密码子TGA (反向序列)。引 物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。然后使用PCR技术成功扩增出ZjPIP2的目 的基因片段，电泳分析ZjPIP2基因的cDNA序列全长为846bp，编码281氨基酸，其中包含有 16个酸性氨基酸，19个碱性氨基酸，蛋白质的相对分子量为29. 87KD，理论等电点为8. 77。 多重比对表明ZjPIP2与其他水通道蛋白有非常高的同源性，特别是与菜豆PIP2的同源性 达到88%。而且，ZjPIP2蛋白序列当中含有MIP家族典型的保守氨基酸序列“HINPAVIFG” 和两个“NPA”保守肽段。进化树分析表明枣树ZjPIP2和茄科烟草属的粉蓝烟草亲缘关系 最近。特别是三级结构的分析暗示着ZjPIP2跟菠菜水通道蛋白相似，推测其功能有着类似 性。上述同源性分析、氨基酸序列特性分析以及氨基酸序列的进化树分析、三级结构预测等 分析手段是本领域普通技术人员所熟知的常规验证手段，通过上述多重对比分析，即可证 明本发明克隆得到的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列即为本发明所述的枣树水通道蛋 白基因的序列，而且其蛋白功能也被唯一确定。本发明在PCR克隆得到ZjPIP2基因后，经限制性内切酶修饰后连接到植物表 达载体PBI121上，经含卡纳霉素的LB平板筛选、PCR、酶切、测序等方法证明植物表达载 体pBII21-ZjPIP2构建成功。通过冻融法将植物表达载体pBI121_ZjPIP2转入根癌农杆 菌LBA4404的感受态细胞中，经含卡纳霉素的YEB平板筛选、PCR鉴定等方法证明工程菌 pBI121-ZjPIP2-L构建成功。农杆菌介导ZjPIP2基因转化拟南芥，经含卡纳霉素的1/2MS 培养基筛选获得含有目的基因ZjPIP2的转基因拟南芥植株，然后对转基因植物及其Tl代 进行耐盐性评价及耐旱性性评价，经在0. IM NaCl溶液连续处理3天(盐处理)或是不浇 任何液体(干旱处理)，观察其生长表现，均能够在正常生长条件下恢复。
此外，本发明为了进一步研究ZjPIP2基因在枣树体内的表达，分别对盆栽壶瓶枣 树苗进行干旱、NaCl胁迫处理，并以未作任何处理的正常壶瓶枣树苗为对照，研究逆境因素 对ZjPIP2基因表达的影响，当处理过的树苗出现严重卷叶、枯黄现象时，立即采样并速冻 保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的对照及胁迫处理过的植物材料的总RNA，经 OD260值的测定、甲醛变性胶电泳等方法检测证明所提RNA纯度高、无降解，质量合格。反转 录所提总RNA，RT-PCR分析得Z jPIP2基因在植物茎、叶中的表达比较稳定，同时证实ZjPIP2 可受干旱、NaCl胁迫等逆境因素诱导表达。与现有技术相比，本发明首次发现并从枣树中克隆出枣树水通道蛋白基因 ZjPIP2，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性和耐旱性，以进行植物品种改 良，明确了具有优良抗性的枣树的抗逆机制，逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控， 为进一步充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的实验数据，奠定了一 定的理论基础。
图1为目的基因ZjPIP2的PCR扩增结果图；图2为pBI121载体及目的基因ZjPIP2的双酶切图谱；图3为重组质粒pBI121_ZjPIP2的酶切图谱；图4为植物表达载体pBI121_ZjPIP2的构建过程示意图；图5为工程菌pBI121-ZjPIP2_L的PCR鉴定图谱；图6(a)为枣树不同环境、组织器官中内参基因ZjH3的差异性表达图谱一；图6(b)为枣树不同环境、组织器官中内参基因ZjH3的差异性表达图谱二 ；图7为ZjPIP2基因在不同环境、组织器官的差异性表达图谱。
具体实施例方式一、枣树水通道蛋白基因ZjPIP2的获得春天采集壶瓶枣树(Ziziphus jujuba Mill.HUPING)长度约2mm的结果枝(枣 吊)，利用CTAB法提取总RNA，根据mRNA纯化试剂盒(货号:Z5200)购自Promega (美国) 方法从提取到的总RNA中分离纯化mRNA。利用cDNA文库构建试剂盒(货号18248_039) 购自Invitrogen (美国)构建cDNA文库。将获得的文库中的cDNA与克隆载体pSPORTl连 接，连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素抗性的平皿37°C培 养过夜，蓝白斑筛选重组质粒，并随机挑选部分质粒委托上海生工测序。将测序结果利用NCBI (www, ncbi. nlm. nih. rov/)在线分析软件进行Blast分 析，结果表明其中的一个cDNA序列为枣树中的水通道蛋白同源基因全序列。将其命名为 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic nrotein)。根据上述已经获得的枣树水通道蛋白基因的精确核苷酸序列设计并委托上海生 工生物工程技术服务有限公司合成如下引物，用于ZjPIP2基因的克隆。上游引物WP3序 列为5' -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘，包含BamH I限制性酶切位点(即有下划线部 分)，两个保护碱基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密码子ATG。下游引物WP6序列为 5 ‘ -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘，包含Sam I限制性酶切位点(即有下划线部分)，三个保护碱基ATA，及水通道蛋白ZjPIP2基因的终止密码子TGA。引物由上海生工生物工程 技术服务有限公司合成。以克隆载体pSP0RTl_ZjPIP2为模板，以WP3和WP6为引物，扩增获得含完整 开放阅读框的枣树水通道蛋白基因。PCR反应体系组成为5 μ L 10XPCR buffer, 1 μ L 2. 5MmdNTPs, IOpmol WP3, IOpmol WP6,1. 5U Taq DNA聚合酶，50ng 的模板，去离子水补充体 IRM 50 μ L0 PCR 扩增条件为:95°C预变性 5min，94°C 30s、54°C 30s,72°C Imin 35 个循环， 最后72°C延伸5min。取5yL PCR产物，1.2%琼脂糖凝胶电泳分析确认片段大小。按照DNA纯化试剂 盒说明操作，纯化PCR产物。二、ZJPIP2基因植物表达载体的构建
1、材料、试剂与仪器1.1载体和菌株植物表达载体PBI121均由山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物研究室 保存，大肠杆菌(E. coli)DH5a、含ZjPIP2基因的重组质粒pSP0RTl_ZjPIP2。1. 2酶与试剂盒限制性内切酶 BamH I、Sma I、Xba I、Sac I、DNA Ligation Kit、RNA 酶、 PrimeScript RT reagent Kit、 Taq _、 dNTP Mixture> DNA Marker(15000bp>2000bp ladder)均购自大连TaKaRa (宝生物)工程有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 QIAquick 购自 QIAGEN 公司。1. 3常用试剂及培养基卡那青霉素(100mg/mL)，酚氯仿异戊醇(V V V = 25 24 1)葡萄糖溶液(IM)EDTA (0. 5M, ρΗ8· 0)10ΧΤΒΕ电泳缓冲液硼酸55.2g/LTris108g/LEDTA (0. 5M, ρΗ8· 0) 40mL10% SDS (pH7. 2)NaOH (2M)Tris-HCl (1M, pH8. 0)醋酸钠(3M，pH5.2)TE 溶液(IOmM Tris-Hcl, IMm EDTA, pH8. 0)LB培养基(固体培养基加琼脂0. 15g/L)蛋白胨0. lg/L酵母提取物 0.05g/LNaCl0. 05g/L2实验方法2. 1大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制作
用CaCl2法制备大肠杆菌(E.Coli)DH5a感受态细胞，具体方法见精编分子生物 学实验指南。2. 2PCR引物的设计与合成根据枣树水通道蛋白基因cDNA编码的序列，设计带有Ba mH I和Sam I酶切位点 的特异性引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用于ZjPIP2基因及组蛋 白基因的克隆。ZjPIP2 基因的上游引物 WP3 序列为5 ‘ -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘，包含 BamH I限制性酶切位点(即有下划线部分)，两个保护碱基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因 的起始密码子ATG。下游引物WP6 的序列为5' -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘，包含 Sam I 限制 性酶切位点(即有下划线部分)，三个保护碱基ATA，及水通道蛋白ZjPIP2基因的终止密码 子 TGA。2. 3质粒pBI121和pSP0RTl_ZjPIP2的少量制备及目的基因ZjPIP2的扩增2. 3. 1 载体 pBI121、pSP0RTl-ZjPIP2 的少量制备pSP0RTl-ZjPIP2质粒的DH5 α菌液用2mL的LB液体培养基加1 μ 1氨苄青霉素 (100mg/mL)接菌后37°C过夜培养所得。含pBI121质粒的DH5 α菌液则用2mL的LB液体 培养基加1 μ L卡那青霉素(100mg/mL)接菌后37°C过夜培养所得。碱裂解法快速提取质粒pBI121、pSP0RTl_ZjPIP2的具体步骤见精编分子生物学
实验指南。最后将干燥的质粒溶于20 μ 1 TE中，-20°C保存备用。2. 3. 2目的基因序列的扩增以克隆载体pSPORTl (携带目的片段)为模板，用设计的特异性引物进行PCR扩增 以获得含完整开放阅读框的枣水通道蛋白基因。先利用梯度PCR技术设置不同的退火温 度，找出最佳退火温度为54°C。PCR扩增 ZjPIP2 基因的反应体系10 X PCRbuffer 5 μ 1 (含Mg 离子)，dNTP 1 μ 1, 上下游引物各1μ l(20pmol/L)，rTaq聚合酶0. 3 μ 1，模板DNA 1 μ 1 (2. 3 μ g/μ 1)，灭菌超 纯水加40. 7 μ 1至总体积为50 μ 1。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性lmin，54°C退 火lmin，72°C延伸2min，共40个循环，最后72°C延伸5min。2. 4目的基因ZjPIP2和载体pBI121的准备因为PCR扩增获得的目的基因片段两端及PBI121载体的多克隆位点都具有BamH I和Sma I限制性酶切位点，利用BamH I和Sma I分别双酶切目的基因Z jPIP2的PCR产物 及载体PBI121，使它们都具有相同的粘性末端，为连接载体做准备。PCR产物的酶切反应体系 注PCR产物的体积依据其浓度而定，最少酶切1 2 μ g目的基因片段。最后加 超纯水至总体积为50 μ 1。载体pGEX-4T-l的酶切反应体系 酶切后分别取5μ 1双酶切产物，1. 0%琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认片段大小 都与预期相吻合。2. 5酶切产物的纯化及连接按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒QIAquick 里的说明书进行操作，纯化双酶切后 的目的基因片段和载体。用T4DNA连接酶将纯化后的pBI121载体与ZjPIP2基因片段进行连接。将载体 PBI121的DNA与欲插入的目的基因ZjPIP2的DNA片段混合制备成体积为5 μ L左右的DNA 溶液(载体DNA和插入DNA的摩尔数比一般为0. 03pmol 0. 1 0. 3pmol)，向上述DNA溶 液中加入等体积的DNA Ligation Kit中的Solution I，充分混勻。连接反应体系总体积为 10 μ 1左右，16°C反应过夜。采用设计构建植物表达载体pBI121-ZjPIP2。2. 6连接产物的转化将100 μ 1的新鲜或保存于_70°C的大肠杆菌感受态细胞DH5 α加入到上面的连接 产物中，轻轻混勻，冰上放置30min。放入预加温到42°C的循环水浴中热休克90s，快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却3 5min。加400 μ L的LB培养基，将管转移到37°C的摇床 上，温浴40min使细菌复苏，复苏期应温和的摇动细胞(转速低于225转/min)。将适当体 积的已转化感受态细胞转移到LB平板(含氨苄青霉素)，涂勻。将平板置于室温直至液体 被吸收，倒置平板，37°C静置培养过夜。2. 7转化产物的鉴定2. 7. IPCR 鉴定待转化菌在含有卡那霉素抗性的LB平板上长出菌落后，用无菌牙签挑取转化单菌落至50 μ L超纯水中，沸水浴5min使菌裂解。取1 μ 1作为模板进行PCR阳性鉴定，反应体 系为10 XPCR buffer 1. 5 μ 1 (含 Mg 离子)，dNTP 0. 2 μ 1，上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/ L)，rTaq聚合酶0. 1 μ 1，模板DNA 1μ 1 (2. 3 μ g/ μ 1)，灭菌超纯水加11. 2 μ 1至总体积为 15μ 1。扩增条件同前，将鉴定为阳性的转化体划线培养。2. 7. 2酶切鉴定将PCR鉴定为阳性的克隆子用碱裂减法提取质粒DNA后，质粒pBI121_ZjPIP2用 XbaI和Sac I进行双酶切鉴定，再用Sma I和Sac I进行双酶切鉴定。载体pBI121_ZjPIP2的Xba I和Sac I双酶切反应体系 载体pBI121_ZjPIP2的Sma I和Sac I双酶切反应体系 S. D. W 6 μ 1琼脂糖凝胶电泳酶切液，验证片段的大小，保存有目的片段的阳性菌落。并将阳性 菌株送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，验证重组质粒读码框的正确性。3、ZJPIP2基因植物表达载体构建的结果与分析3. lZjPIP2cDNA 的扩增利用设计的特异性上下游引物进行PCR扩增后，产物在1. 0%琼脂糖中电泳，经EB 染色后在紫外灯下观测到一条约850bp的条带，如图1所示，图中M :DL2000Marker ；1,2 PCR产物，与所设计的扩增目的片段大小吻合。3. 2目的基因片段及载体片段的制备将PCR产物和pBI121质粒用BamH I和Sma I双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳，结 果如图 2 所示，图中，Ml :DL15000Marker ；1 :pBI121 酶切产物；M2 :DL2000Marker ；2 目的 基因酶切产物，PCR产物大小约为850bp，pBI121载体片段分别约为14. 7Kb，与预期结果相 符。分别用试剂盒纯化目的片段与载体片段，用于连接。3. 3重组质粒的鉴定从含有卡那霉素的培养基上挑取阳性单菌落进行PCR鉴定，如图3所示，图中，M DL2000Marker ；1,2 阳性克隆，与预期结果相符；初步推断重组质粒构建成功，且重组质粒 的大小约为15. 6Kb。测序结果表明该转化菌的质粒中确实含有目的片段，且读码框正确，重 组质粒构建成功。3. 4构建ZjPIP2基因植物表达载体小结通过PCR技术克隆得到目的基因ZjPIP2的cDNA片段，经限制性内切酶BamH I 和Sma I修饰并纯化后连接到植物表达载体PBI121中；用热激法将连接产物转入E. coli DH5a感受态细胞中；用含有卡那霉素的LB平板筛选转化子，最后经PCR鉴定、酶切鉴定及 测序证明植物表达载体pBI121-ZjPIP2构建成功，如图4所示，为载体的构建图谱，为探讨 ZJPIP2基因在植物体内的功能奠定了基础。三、农杆菌介导ZjPIP2基因转化拟南芥1、材料、试剂及仪器
1.1植物材料野生型拟南芥种子来源于山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物研究室， 培养基质购自山西省农科院园艺作物研究所。1.2载体和菌株根癌农杆菌LBA4404、植物表达载体PBI121均由山西省农业科学院生物技术研究 中心园艺作物研究室保存。1-3 试剂卡那霉素购自上海生工生物工程服务有限公司；YEB、1/2MS培养基中所用试剂均 购自天津天大化工。1.4培养基及试剂配方1.4. IYEB 培养基蛋白胨0. 05g/L，酵母膏 0. 01g/L，蔗糖 0. 05g/L，硫酸镁 0. 005g/L。注固体培养基需加终浓度为1. 0%的琼脂粉。1.4. 21/2MS 培养基按配制MS培养基配制1/2MS培养基，大量元素、微量元素、有机元素、铁盐的量各 减半，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L。其他试剂配方与ZjPIP2基因植物表达载体的构建中所用到的试剂一样。2实验方法2.1拟南芥的培养将拟南芥种子先在95%乙醇浸泡30 60s ；再转入2. 65%次氯酸钠灭菌5min，其 间上下颠倒洗，5000rpm离心2min。灭菌水洗三次。然后将种子悬浮于0. 的琼脂粉溶胶 中。用枪头吸上悬浮液将种子点播于1/2MS固体培养基上，封口。4°C黑暗春化2d后，将拟 南芥种子在22°C，16h/8h光周期条件下进行培养。当拟南芥长出2片真叶时，移栽到营养
基质中继续培养。2. 2根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制作，为本领域公知技术。2. 3工程菌pBI121-ZjPIP2_L的构建及筛选通过冻融法将构建成功的重组质粒载体转入农杆菌LBA4404，然后提取阳性克隆 的质粒DNA，并通过PCR鉴定重组质粒载体是否转入农杆菌。
从28°C培养的转化有重组质粒pBI121_ZjPIP2的筛选平板上随机挑选生长良好 的若干单菌落，各取二分之一菌落至50 μ 1超纯水中，沸水浴5min使菌裂解，取1 μ 1作为 模板进行PCR鉴定，将鉴定出的阳性工程菌重新划线保存一份，备用。2. 4农杆菌介导转化拟南芥2. 4. 1 工程菌 pBI121-ZjPIP2_L 的培养挑选鉴定的阳性克隆于IOmLYEB液体培养基(含终浓度为50 μ g/mL的卡纳抗生 素)过夜培养后。6000rpm离心5min收集菌体，用培养基悬浮菌体至OD6tltl值为0. 8左右， 用于转化拟南芥植株。2. 4. 2农杆菌侵染拟南芥 当拟南芥植株形成花蕾时，即可用于农杆菌转化。将含农杆菌的转化介质倒入烧 杯，将拟南芥植株的花蕾部分浸入转化介质3 5S后，把浸染过的植株放到塑料盘中，用薄 膜覆盖，暗处放置过夜。然后揭开薄膜，在正常条件下，继续培养转化后的拟南芥植株。当 拟南芥的角果枯黄、欲开裂时，收获种子。2. 4. 3转基因拟南芥的筛选将消毒的转基因拟南芥植株的TO代种子播种于1/2MS筛选培养基(含终浓度为 50 μ g/mL的卡那抗生素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，16h/8h光周期下培养。转化成功的 拟南芥种子长出来的幼苗生长正常，未转化成功的幼苗叶子发黄，生长缓慢。生长正常的拟 南芥长出2片真叶时，移栽到营养基质中继续培养。3ZJPIP2基因转化拟南芥的结果与分析3.1农杆菌的转化结果将构建好的植物表达载体pBI121-ZjPIP2转人农杆菌LBA4404，在YEB固体培养基 (含终浓度为50 μ g/mL的卡那霉素上筛选转化子，从筛选平板上随机挑选生长良好的若干 单菌落，进行PCR检测，PCR扩增结果如图5所示，图中M:DL2000Marker :1、4、5、12、13 阳 性克隆，产生一条大小约为850bp的特异条带，表明这些菌落为阳性转化子，重组植物表达 载体已经成功转入农杆菌LBA4404。3. 2转基因拟南芥植株的获得按上述方法侵染拟南芥后，将消毒的转基因拟南芥的Ttl代种子播种于1/2MS筛选 培养基(含终浓度为50 μ g/mL的卡那霉素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，16h/8h光周期下 培养。经观察，抗卡那霉素的拟南芥幼苗生长正常，且有真叶形成，而不抗卡那霉素的拟南 芥幼苗比较小，叶子发黄，也没有真叶形成。对转基因拟南芥植物及其Tl代进行耐盐性评价及耐旱性性评价，选取对照、干旱 处理、NaCl处理的转基因拟南芥植物及其Tl代。每天下午给对照浇充足的水，NaCl处理的 苗各浇0. IM NaCl溶液500ml，干旱处理的苗不浇任何液体。连续处理3天后，观察其生长 表现，结果表明，经过两种胁迫处理的转基因拟南芥及其Tl代均能够在正常生长条件下恢 复，而对照则死亡。3. 3转ZjPIP2基因拟南芥小结通过冻融法将构建好的植物表达载体pBI121_ZjPIP2转入农杆菌LBA4404感受态 细胞中，经含卡纳霉素的YEB平板筛选、PCR鉴定成功构建工程菌pBI121-ZjPIP2-L;工程 菌介导ZjPIP2基因侵染拟南芥，经含有卡纳霉素的1/2MS培养基筛选获得含有目的基因ZJPIP2的转基因拟南芥植株，并对转基因拟南芥植物进行耐盐性评价及耐旱性性评价，为 研究ZjPIP2基因在植物体内的表达定位、功能及调控机制奠定了基础。
四、ZjPIP2在枣树体内的表达1材料、试剂及仪器1.1植物材料壶瓶枣(Ziziphus jujuba Mill hupingzao)树苗由山西省农业科学院生物技术 研究中心园艺作物研究室提供。1.2试剂及仪器设备NaCl购自天津天大化工；饱和酚、DEPC及RNA提取过程中所用到的试剂均购自上 海生工生物工程有限公司。1.3试剂配方与ZjPIP2基因植物表达载体的构建中所用到的试剂一样。2实验方法2. 1材料的准备及采集将壶瓶枣树苗移栽到直径为50厘米的大花盆中。放置户外正常培养，对照、干旱 处理、NaCl处理的枣苗各三盆。每天下午给对照枣苗浇充足的水，NaCl处理的枣苗各交 0. IM NaCl溶液500ml，干旱处理的枣苗不浇任何液体。连续处理3天后，经过胁迫处理的 早树苗开始出现卷叶症状。两周后，两种胁迫处理的枣苗卷叶、枯黄现象严重，然后进行取 样。取每盆植株的根、茎、叶、结果枝茎段到50mL离心管中，液氮速冻后保存于-80°C冰箱， 用于RNA的提取。2. 2植物RNA的抽提和质量检测2. 2. 1植物材料RNA的提取CTAB法提取植物材料的总RNA。2. 2. 2RNA 质量检测采用甲醛变性胶电泳法来检验RNA是否降解，同时用分光光度计检测其纯度和浓度。(1)测所抽提RNA的0D260值取1μ 1 RNA 力卩到 99 μ 1 RNA-free water 中，用分光光度计(印pendorf BioPhotometer)检测RNA质量，如果0D26(1/0D28(1 = 2.0那么RNA的质量非常好，纯度高，无 降解，可以用于反转录。(2)甲醛变性胶电泳RNA甲醛变性电泳液1XM0PS 500 600ml 用 DEPC 处理过的水稀释 20XM0PS 20 倍。琼脂糖变性胶配制方法如下水(经DEPC 处理)44mL甲醛3. OmL20 X MOPS3. OmL琼脂糖0.6g加热溶解后再加水至总体积为60ml，使溶液冷却。
注制胶时先将水、MOPS、琼脂糖融化，室温放置至冷却到60°C，再加入甲醛，混勻 并置通风橱中15分钟后倒入制胶器中。RNA变性Buffer配制方法如下 RNA样品分别加3倍体积的RNA变性Buffer，混勻后在65°C水浴中温浴lOmin，置 于冰水混合物上使之冷却；点样，电泳，EB染色40min，S. D. W洗三次，每次15min，紫外检测 照相，能看到较分明的两条带，且前后两条带亮度比接近2 1，则RNA可用。2. 3RNA 的反转录及 RT-PCR2. 3. 1 反转录 RNA按试剂盒PrimeScrip RT reagent Kit说明将2. 6. 2. 2所提的RNA进行反转录， 反转录体系如下5XPrime Script Buffer8μ 1Prime Script Enzyme MixI 1 μ 1Oligo dT Primer1 μ 1Random 6mers1 μ 1Total RNA2 μ gS. D. Wup to 40 μ 1反转录的反应程序为37°C 15min (反转录反应)，85°C 5sec (反转录酶的失活反 应)。2. 3. 2内参基因ZjH3引物的设计与合成孙海峰等[66]研究表明枣树ZjH3基因可作为内参基因对ZjPIP2基因进行mRNA表 达水平的检测。由序列号EU916201获得ZjH3基因序列，根据所得序列设计内参基因ZjH3 的特异性引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用于ZjH3基因的克隆分 析。内参基因Z jH3的上游弓丨物序列为Z1 5，-ATGGATCCATGGCACGGACAAAGCA-3，，包含 BamHI限制性酶切位点(即有下划线部分)，两个保护碱基AT，及组蛋白基因的起始密码子 ATG。下游引物序列为Z2 :5，-TATACCCGGGCTAAGCCCTCTCGCC-3’,包含 Sam I 限制性酶切 位点(即有下划线部分)，四个保护碱基TATA，及组蛋白基因的终止密码子CTA。2. 3. 3RT-PCR 分析以反转录产物为模板，WP3、WP6 ；Zl, Z2为引物，PCR鉴定枣树水通道蛋白的表 达位置及各种胁迫处理后的表达情况。反应体系为10XPCR buffer 1.5μ1(含Mg离 子)，dNTPO. 2 μ 1，上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/L)，rTaq 聚合酶 0. 1 μ 1，模板 cDNA 1 μ 1(2. 3 μ g/μ 1)，灭菌超纯水加11. 2μ 1至总体积为15 μ 1。扩增条件同2. 2. 3. 2，WP3 >WP6的退火温度为54°c，Z1, Z2的退火温度为56°C。3干旱、NaCI胁迫下ZjPIP2的表达分析结果
3. IRNA的质量检测结果3. 1. 1 测定所提 RNA 的 0D260 值将所提RNA按1 99与S. D. W配好后，分光光度计测得的RNA浓度见表1 表1枣苗处理后分子数据材料总RNA 浓260/280 260/230 反转录反转录产度用量 物浓度(ug/ml)(ul) (ug/ml)对照根 1170.1 1.85 2.6311116.5莲 316.9 1.83 2.4841343.8叶 1637.3 1.82 2.6911484.5结 1082.5 1. 79 2. 6611169.3干旱胁迫根31.9 1.99 1.7720 1595.8莲 2393.3 2.06 2.4911796.1叶 1977.6 2.04 2.5311621.5结 2840.4 2.04 2. 5511516.8NaCl 胁迫根 172.2 1.95 2.1620 1078.2莲 30. 3 3. 79 1. 6820 1433. 4叶 11894 1.99 2. 260.5 1459.7结 3863.6 2.00 2. 5211427. 73. 1.2甲醛变性胶电泳将所提RNA样品处理后，进行甲醛变性胶电泳，凝胶成像分析仪下观察所提RNA质 量，如果看到较分明的两条带，且前后两条带亮度比接近2 1，表明所提RNA纯度高、无降 解、可用于反转录。3. 2ZJPIP2在不同胁迫下的RT-PCR分析结果按上述方法反转录所提RNA，反转录产物浓度见表1 ；然后再分别以ZpZ2JP3JPe 为引物对反转录产物进行RT-PCR分析，琼脂糖凝胶电泳RT-PCR产物，结果如图6 (a)、图 6(b)所示，如图7所示图6(a)中，M :DL2000Marker ；1 质粒对照；.2-5 干旱处理植株的根、茎、叶、结果 枝茎段；图6(b)中，2-5 对照植株的根、茎、叶、结果枝茎段；6-9 =NaCl处理植株的根、茎、 叶、结果枝茎段，表明ZjH3基因在对照和处理所有植株的不同组织均有表达，进一步表明 所提RNA可用。图7中，M :DL2000Marker ；1 质粒对照；2_5 对照植株的根、茎、叶、结果枝 茎段6-9 干旱处理植株的根、茎、叶、结果枝茎段；10-13 =NaCl处理植株的根、茎、叶、结果 枝茎段.显示枣水通道蛋白在对照植株的茎和叶片中有表达，叶片中的表达量相对少一点 儿；在干旱处理过的植株的茎、叶、结果枝茎段中均有表达，结果枝茎段经干旱胁迫表达了 目的基因，叶中的表达量现相对对照有所增加；在NaCl处理过的植株中，茎、叶、结果枝茎 段均有表达，而且茎、叶中的表达量比对照增加显著。实验结果表明ZjPIP2蛋白在茎、叶中 的表达比较稳定，证实逆境因素可诱导目的基因在结果枝中的表达。
3. 3ZJPIP2表达研究小结分别对盆栽壶瓶枣树苗进行干旱、NaCl胁迫处理，并以未作任何处理的正常壶瓶枣树苗为对照，研究逆境因素对ZjPIP2基因表达的影响，当处理过的树苗出现严重卷叶、 枯黄现象时，立即采样并速冻保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的对照及胁迫处 理过的植物材料的总RNA，经OD26tl值的测定、甲醛变性胶电泳等方法检测证明所提RNA纯度 高、无降解，质量合格。反转录所提RNA，RT-PCR分析得ZjPIP2基因在植物茎、叶中的表达 比较稳定，并推测ZjPIP2可受干旱、NaCl胁迫等逆境因素诱导表达。
权利要求
一种枣树水通道蛋白基因，其特征是该基因的核苷酸序列具有如SEQ ID NO1所示的序列。
2.由权利要求1所述一种枣树水通道蛋白基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其特 征是该氨基酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列。
3.一种枣树水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐盐性中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐盐性中的应用，该基因的核苷酸序列以及氨基酸序列如序列表中所示SEQ ID NO1和SEQID NO2，本发明构建植物表达载体，获得转基因拟南芥植株，对其进行耐盐性评价及耐旱性性评价，证明其可用在提高植物耐旱性和耐盐性中。本发明首次发现并从枣树中克隆出枣树水通道蛋白基因ZjPIP2，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性和耐旱性，以进行植物品种改良，明确了具有优良抗性的枣树的抗逆机制，逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的实验数据，奠定了一定的理论基础。
文档编号C12N15/29GK101880674SQ201010239449
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者孟玉平, 张洁, 曹秋芬, 顾蓉 申请人:山西省农业生物技术研究中心